안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

이 비디오에서는 Forrester Resonance Energy transfer 또는 fret을 사용하여 세포주기 전반에 걸쳐 kinase 및 phosphatase 활성을 모니터링합니다. 여기서 kinase one 또는 LK one activity probe와 같은 폴로는 한쪽 끝에 청록색 형광 단백질 CFP가 배치되고 다른 쪽 끝에 노란색 형광 단백질 YFP가 배치됩니다. 이 프로브는 U2 OS 셀로 형질 주입됩니다.

그런 다음 G two two M 전이 중 LK one 표적의 인산화 상태를 검사하기 위해 TRANSFECTED U2 OS 세포에 타임 랩스 형광 이미징을 실시합니다. CFP와 YFP가 가까이 있고 CFP가 여기되면 에너지가 YFP로 전달되고 YFP 입학을 감지할 수 있습니다. 그러나 프로브가 인산화되면 단백질의 확인 변화로 CFP와 YFP가 분리됩니다.

이제 CFP가 여기될 때 CFP와 YFP 여기가 모두 PLK 1 활성이 G 2에서 증가하고 유사분열 중에 최고조에 달함을 입증한 후 강한 CFP 방출과 약한 YFP 방출만 감지됩니다. 따라서 표준 기하학적 필름과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포주기가 필름 조건이나 프로브의 발현에 의해 교란되지 않도록 특별한 주의를 기울인다는 것입니다. 이 방법은 특정 키나아제 또는 인산가수분해효소가 활성화되는 위치와 시기와 같은 세포주기 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 세포주기 조절 효소에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 세포 증식 분석과 같이 unres 조건이 필요한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 인간 세포 주기를 모니터링하기 위해 U2 OS 세포는 프렛 기반 PK one 활성 프로브로 transfection됩니다. 표준 인산칼슘 형질주입 방법을 사용하여 세포를 최소 7일 동안 pur mycin에서 선택합니다.

이는 프로브를 발현하는 세포의 집단을 풍부하게 하고 독성 발현 수준 또는 세포주기에 심각한 영향을 미치는 발현 수준을 가진 세포의 수를 제한합니다. 그런 다음 CFP의 제한된 희석 발현에 의해 안정적인 클론을 선택하고 YFP를 검사하여 거의 동일한 비율로 모든 세포에 존재하는지 확인합니다. 일부 세포가 CFP만 함유하거나 YFP 재조합이 이 경우에 발생했을 가능성이 있는 경우, 상동 재조합에 덜 취약한 박테리아(예: 두 개의 세포가 모두 있는지 확인)를 사용하여 플라스미드 제제를 반복한 다음 플라스미드를 선형화하고 형질주입을 반복합니다.

세포가 프로브를 안정적으로 발현하면 부착 후 30-50% confluent가 된 후 1.5번 유리 바닥 접시에 파종합니다. 매체를 CO2와 독립적이고 페놀이 적색이 포함되지 않은 매체로 변경하고 온도 제어를 섭씨 37도로 설정한 상태에서 전동 에피 형광 현미경에 세포를 장착합니다. 현미경에는 CFP 및 YFP 여기 및 방출 필터가 장착되어 있어야 합니다.

CFP 및 YFP 모니터링에 적합한 ROIC 미러와 필요한 해상도에 적합한 대물렌즈. 여기에서는 20 x NA 0.75 공중 목표가 사용됩니다. 투과광을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.

이 시점에서 형광등을 사용하면 세포 주기를 교란시킬 수 있는 스트레스 반응을 유발할 수 있으므로 형광등을 사용하지 마십시오. 광독성을 방지하려면 필요한 세포 내 해상도를 허용하는 최대 값으로 굽힘을 설정하십시오. 이 실험에서는 핵과 세포질을 구별할 수 있어야 합니다.

노출 시간을 짧게 설정하고 높은 중성 농도 필터를 삽입합니다. 그런 다음 12비트 또는 16비트 테스트 이미지를 획득합니다.YFP 여기 및 방출을 사용하여 노출 시간과 중립 밀도 필터를 조정하여 셀의 평균 강도가 배경 강도와 거의 같고 최소 배경 강도와 최대 배경 강도 간의 차이의 5배가 되도록 합니다. 영상의 채도가 높지 않은지 확인하려면 샘플 영상의 형광 강도를 검사하십시오.

이미지의 최대 intensity는 세포가 유사분열에 들어갈 때 intensity 차이를 허용하기 위해 dynamic range의 절반 미만이어야 합니다. 다음으로, CFP 여기 및 YFP 방출 필터를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 초점을 맞추고 노출 조건을 최적화하는 데 사용되는 영역을 제외하고 형질주입된 세포가 있는 여러 영역을 선택합니다.

이러한 절차는 스트레스 반응을 유발할 수 있으므로 최대 강도가 모든 세포에서 동적 범위의 절반 미만이어야 합니다. YFP 여기(YFP excitation), YFP 방출(YFP Emission) 및 CFP 여기(CFP Excitation)를 사용하여 45분마다 두 개의 이미지를 획득하도록 소프트웨어에 지시합니다. YFP 방출 필터.

또한 실험의 총 길이가 세포주기의 지속 시간을 초과하도록 설정합니다. 모든 것이 설정되면 획득이 완료된 후 이미지 획득을 시작하고 획득한 이미지를 열고 유사분열에서 유사분열까지의 세포 주기 시간을 모니터링합니다. 여기에서 transfection된 probe를 발현하는 세포의 경우, 세포 주기 시간은 대략 20 - 25시간이었습니다.

이를 사용된 셀 유형에 대한 제어 데이터와 비교합니다. 세포 주기 시간이 기준 타이밍과 일치하는 경우 프렛을 분석할 수 있습니다. 타이밍이 확인되면 이미지를 분석할 수 있습니다.

분석은 대부분의 현미경 검사 전용 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 여기서 이미지 j 프리웨어는 ratio plus 플러그인과 함께 사용됩니다. 이미지 J에서 이미지를 열어 분석을 시작합니다.이미지가 멀티컬러 스택 형식인 경우 이미지를 선택하여 하이퍼 스택으로 변환하여 개별 채널을 분리합니다.

그런 다음 하이퍼 스택으로 스택을 쌓습니다. Convert to hyper stack(하이퍼 스택으로 변환) 창이 열리고 설정이 표시되면 OK(확인)를 클릭합니다. 이제 이미지가 아래에 두 개의 슬라이더 막대와 함께 표시됩니다.

이미지를 단일 채널 스택으로 분할하는 것 옆에서 이미지를 클릭하고 하이퍼 스택 차원 감소를 선택합니다. 그러면 축소 창이 열리고 프레임과 소스 유지가 선택되었는지 확인합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.

채널이 하나만 포함된 새 이미지가 나타납니다. 이 과정을 반복하여 두 번째 채널로 새 이미지를 불러옵니다. 다음으로, 최종 이미지의 시각적 선명도를 높이려면 YFP 여기 YFP 방출 스택을 선택합니다.

프로세스를 클릭한 다음 수학을 클릭합니다. 그런 다음 곱하기 창이 열리면 3을 입력하여 YFP 여기 YFP 방출 스택에 3을 곱합니다. 이 단계는 선택 사항이며 비율이 0과 1 사이의 범위에 있지 않도록 합니다.

그런 다음 이미지 J 도구 모음에서 자유형 도구를 선택합니다. 그런 다음 YFP 여기, YFP 방출 스택에서 셀이 없지만 ROI를 ROI 관리자에 추가하기 위해 측정할 셀에 가까운 영역에 관심 영역 또는 ROI를 그리고 분석 도구를 클릭합니다. 다음은 ROI 관리자입니다.

ROI 관리자 창이 나타납니다. 추가를 클릭하여 ROI 좌표를 저장하여 YFP 여기 YFP 방출 스택에서 ROI의 평균 강도를 측정합니다. analyze(분석)를 클릭한 다음 measure(측정)를 선택합니다.

결과 창이 열립니다. CFP 여기 YFP 방출 스택을 선택합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 ROI를 두 번 클릭하고 측정을 반복합니다.

측정값이 결과 창에 추가됩니다. 스택의 다른 위치로 스크롤하여 여러 시점에서이 프로세스를 반복합니다. 결과 창에서 측정값을 비교하여 관심 셀에 가까운 배경 강도가 필름 전체에서 유사한지 확인합니다.

최소 강도를 포함하도록 측정을 설정하려면 analyze(분석)를 클릭한 다음 set measurements(측정 설정)를 클릭하고 최소 및 최대 회색 값을 표시합니다. 다음으로 측정 대안을 보여주는 창이 나타납니다. 필요에 따라 밝기와 대비를 조정한 후 대부분의 셀을 포함하는 ROI를 그리고 두 스택에서 최소 강도를 측정합니다.

그런 다음 이번에는 배경 대신 셀을 사용하여 이전과 같이 측정합니다. 결과 섹션의 값을 사용하여 측정된 최소 강도와 배경 강도 간의 차이를 계산하고 이를 2로 나눕니다. 이것은 열린 비율에 대한 클리핑 값과 선택한 플러그인에 대한 시작 추정치를 제공합니다.

그런 다음 비율 더하기. 그런 다음 fret ratio의 경우 CFP excitation YFP emission S stack one 또는 인산화 시 fret 효율이 감소하는 프로브를 시각화하는 inverted fret ratio를 선택합니다. YFP 여기 YFP 방출 S 스택 하나를 선택하여 측정된 배경 강도와 클리핑 값을 삽입합니다.

결과 창의 값을 사용하여 비율 더하기 창에 붙여넣습니다. 결과 비율 스택의 배율을 설정하고 적절한 조회 테이블을 적용하여 비율 변경 사항을 시각화합니다. PLK one 활동을 모니터링하는 프렛 기반 프로브를 발현하는 U2 OS 셀은 이 비디오에 설명된 대로 60시간 동안 촬영되었습니다.

이 이미지는 딸 세포의 분열을 포함하여 세포를 발현하는 50개의 프렛 프로브의 누적 유사분열 진입을 보여줍니다. 프로브를 발현하는 대부분의 세포는 20 - 25시간의 세포 주기 시간으로 증식하며, 이는 프로브의 이미징 조건 및 발현 수준이 세포 주기 타이밍에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 1 개의 세포에서 4 개의 분열을 따르는 반전 된 프렛 비율의 거짓 색상 표현은 상당한 잡음이 있지만 PK 1 활성이 G 2에서 증가하고 유사 분열 중에 최고조에 달하는 추세가 보인다는 것을 보여줍니다.

원시 데이터가 평균 필터링되어 그래프로 표시되는 경우 활동 피크 사이의 시간을 쉽게 추정할 수 있습니다. 이 그림은 그래프의 이전 이미지에 표시된 셀의 반전된 프렛 비율의 정량화를 보여줍니다. 활성화 타이밍을 추정할 수 있으며 여기에서 볼 수 있듯이 프로브의 인산화는 유사분열에서 인산화가 최고조에 달하기 약 4시간 전에 볼 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포를 스트레스가 없는 상태로 유지하는 것이 중요하므로 빛에 대한 노출을 최소화하고 온도 또는 pH 변화를 최소화하여 이를 수행합니다. 또한 이 방법은 세포에서 키나아제와 인산가수분해효소 활성의 균형을 모니터링한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차는 RNA 간섭 또는 억제제 스크리닝과 결합하여 이러한 키나아제 및 인산분해효소의 업스트림 조절자를 식별할 수 있습니다.