Name: 안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 배우세요 FRET 기반 리포터를 사용하여 U2 OS 세포에서 세포주기 동안 키나제와 인산 가수 분해 효소 활성을 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기법은 세포 신호 전달 과정을 시각적으로 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 스웨덴 연구 협의회, 전략 연구, 스웨덴의 암 사회, 스웨덴의 아동 암 사회 아케 Wibergs 재단과 Jeanssons 기초에 대한 스웨덴의 기초에 의해 지원됩니다.

1. 세포에 프로브를 소개합니다 <ol><li> 안달 기반 프로브 및 플라스미드 부여 저항 공동 transfect 세포. 관심의 셀 타입에 효율적입니다 transfection 방법을 선택합니다. U2OS 전지, 표준 칼슘 인산염 transfection 방법은 적절한 결과 15 줄. </li><li> 적어도 7 일 동안 적절한 항생제의 세포를 선택합니다. 프로브 및 제한 심각하게 세포주기에 영향을 미칠 독성 표현 수준이나 표현 수준과 세포의 크기를 표현하는 세포의이 풍요롭게의 금액입니다. </li><li> (선택 사항) 안정적인 클론을 선택하십시오. </li><li> 고정 또는 라이브 세포를 사용, CFP 및 YFP 모두 거의 같은 비율로 모든 세포에 존재하는지 확인합니다. </li><li> 일부 세포는 CFP 또는 YFP를 포함하는 경우에는 재조합 가능성이 높습 발생했습니다. 재조합은 박테리아 성장하는 동안 또는 프로브의 transfection 후 중 발생할 수 있으며, 후자의 경우에는 플라스미드 품질에 따라 달라질 수 있습니다. 플라스미드 P를 반복배상하고 문제가 지속되면 transfection하기 전에 플라스미드를 linearize. </li></ol> 2. 모니터링 ratiometric이 무서워 <ol><li> 챔버의 장착을위한 유리 바닥 요리, 또는 커버 전표에 씨앗 세포. 요리 / 커버 전표가 더 1.5 (170 μm의 두께)입니다 없는지 확인합니다. </li><li> 37 ° C. 설정 온도 제어와 동력 epifluorescence 현미경에 페놀 붉은없이 성장 매체 전지를 탑재 중 CO 2 또는 2 독립 미디어 등 Liebowitz - 15 CO를 사용하여 미디어의 산도 조절을 보장합니다. </li><li> 전송 조명을 사용하여 세포에 초점. 형광등을 사용하는 전지를 보지 마라. </li><li> YFP 여기 (YFPex)와 YFP 방출 (YFPem) 필터 및 적절한 이색성 거울을 사용하여 12 또는 16 비트 이미지를 획득하여 시작합니다. 여전히 필요한 subcellular 해상도를 허용 가능한 최대한의 binning을 사용합니다. 노출 시간이나 강도를 감소 높은 binning을 사용하면 phototoxicity을 피하기 위해 중요합니다. </li><li> 나를asure 또는 셀 찾아볼 수없는 영역에서 최소 거친 평균 및 최대 픽셀 값을 측정 또는 추정하여 배경 강도와 대략적인 소음을 예상하고있다. 변경 노출 시간 및 중성 밀도 필터 때문에 세포의 평균 신호는 약 배경 강도 플러스 5-10 회 맥스와 분 배경 농도 차이입니다. </li><li> 포화되지 가까이하지 않는 이미지를 확인합니다. 이미지의 최대 강도는 세포가 유사 분열을 입력하면 강도 차이 있도록 동적 범위 (12 비트 이미지에서 예를 들어 최대 2000)의 절반 미만이어야한다. </li><li> CFP의 여기와 YFP 방출 필터 및 적절한 이색성 거울을 사용하여 단계 2.4-2.6를 반복합니다. </li><li> 2.7 점 2.4에 사용되는 지역 제외, transfected 세포 여러 영역을 선택하고 최대 강도를 보장은 모든 세포의 다이나믹 레인지의 절반 이상이 적습니다. </li><li> 두 이미지 모두 4 획득 시간 경과 실험을 시작합니다YFPex를 사용하여 5 분 - YFPem 및 CFPex - YFPem 필터 설정합니다. </li></ol> 3. 조건을 확인하고 최적화 <ol><li> 획득한 이미지를 열고 유사 분열에서 transfected 프로브를 표현하는 세포 유사 분열하는 세포주기 시간을 모니터링합니다. </li><li> 사용되는 세포 유형에 게시된 데이터에 측정된 세포주기 시간을 비교합니다. 또한, 영화가 참조 셀 사이클 시간을 얻을에만 전송 빛의 하나의 이미지 (예 : DIC 또는 위상 대조) 매 시간을 인수함으로써 세포를 untransfected. </li><li> 유사 분열에서 유사 분열하는 시간이 세포주기의 타이밍을 참조에 해당하는 경우에는 4 단계로 진행합니다. 또는 더 노출을 사용하여 다시 취득 이미지, 더 많은 시간을 포인트 또는 여러 개의 Z - 레벨과 단계를 반복합니다 3. </li><li> 세포주기의 타이밍을 참조에 해당하지 않는 유사 분열에서 유사 분열하는 시간 경우에는, 영화는 결국에서만 전송 빛의 하나의 이미지 (예 : DIC 또는 위상 대조) 하나의 이미지 뒤에 매 시간을 인수함으로써 세포를 transfectedtransfected 세포를 식별하는 실험. </li><li> transfected 세포가 아직 이상 세포주기 시간을 보여주면, 1 단계를 반복하지만 적은 프로브를 transfect 또는 탐침의 매우 낮은 금액을 포함하는 안정적인 클론을 선택하십시오. </li><li> transfected 세포가 형광 불빛이없는 정상적인 세포주기 시간을 표시하는 경우, 이미지 사이의 binning, 중성 밀도 필터, 노출 시간 및 시간을 수정하여 2 단계지만, 낮은 노출을 반복합니다. </li></ol> 4. 초조 Analysing <ol><li> 분석은 현미경 전용 대부분의 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 프리웨어 ImageJ (사용 분석 수행하는 방법을 설명합니다 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij을</a> 플러그인 비율 플러스 (활용) <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus를 . HTML</a> ). </li><li> ImageJ에서 이미지를 엽니다. 경우에는 귀하의 이미지는 여러 가지 빛깔의의 stac의 형식에K (예 Deltavision) 먼저 hyperstack로 변환하여 각 채널을 별도 : hyperstack에 이미지 hyperstack - 스택과 이후를 사용하여 단일 채널 스택에 분할 : 차원을 이미지 hyperstack - 줄이기 </li><li> 그것만이 비율이 0과 1 사이의 범위에하지 않는함으로써 이미지의 시각적 선명도를 증가하기위한 것일 뿐이므로이 단계는 선택 사항입니다 프로세스 수학 곱하기 : 3 이용한 YFPem 스택 - YFPex을 곱하면됩니다. </li><li> YFPex에 - YFPem 스택, 세포의 결여된하는 지역에 관심을 (ROI)의 영역을 그리지만, 그 측정이 될 수있는 세포에서도 가까운 거리에 있습니다. 배경 및 신호 강도가 모두 일반적으로 이미지의 중앙에 강력한는 같은 이미지의 다른 세포가 다른 지역을 요구할 수 있습니다. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자에게 투자 수익 (ROI)를 추가 분석 - 도구 - 투자 수익 (ROI) 관리자. </li><li> 분석 - 측정 : - YFPem와 CFPex - YFPem 스택 YFPex 모두 투자 수익 (ROI)의 평균 강도를 측정 </li><li> 여러 timepoints에서 반복하고 관심 세포에 가까운 배경 농도가 영화 전반에 걸쳐 유사 확인합니다. </li><li> 분석 - 설정 측정 - 최소 및 최대 회색 값 : 최소한의 강도를 포함하는 측정을 설정합니다. </li><li> 세포의 대부분을 다루는 관심 영역을 그려과 YFPex 모두 최소 농도 측정 - YFPem와 CFPex - YFPem 스택을. 4.6에서 측정한 최소 강도와 배경 강도의 차이를 가지고 두하여 나눕니다. 이것은 클리핑의 가치에 대한 시작을 예측할 수 있습니다. </li><li> 오픈 비율 플러스. YFPem 및 CFPex - - YFPem 스택 YFPex을 선택합니다. 비율을 선택 CFPex 걱정 위해 - 스택 1로 YFPem - 스택 1로 YFPem을 거꾸로가 인산화시 효율 저하를 걱정 프로브 선택 YFPex를 시각화 비율을 걱정하십시오. </li><li> 측정된 배경 농도 및 클리핑 값을 넣습니다. </li><li> 결과 비율 스택의 배율을 설정하고 적당한 모양의 U를 적용비율 변화를 시각화하는 P 테이블 (LUT). </li></ol> 5. 대표 결과 Plk1 활동은 유사 분열 동안 G2 단계와 봉우리의 핵에서 처음 볼 수 있습니다. 그림 3은 제 2에서 설명한대로 최소한 phototoxicity 설정을 사용하여 실험을 보여줍니다. 이것은 대표적인 초기 결과주의와 이미지 사이의 노출 조건이나 시간이 잡음 비율 또는 시간적 해상도로 신호를 증가 수정할 수 있습니다하시기 바랍니다. 프로브를 표현 세포의 대부분은 이미징 조건과 프로브의 표현 수준은 세포주기의 타이밍에 영향을 미치지 않습니다 나타내는 20 사이 및 25 시간의 세포주기의 시간 분아 따위에 의해 중식 그 그림 3 차원 보여줍니다. 상당한 소음이 있지만, Plk1 활동의 추세는 G2의 증가와 유사 분열 14 peaking하면 (그림 3A) 명확하게 볼 수 있습니다. 이곳으로 원시 데이터를 처리하는 말은 평균 거꾸로 RA의 kymograph (그림 3B) 또는 부량로 제시 필터링 티오 (그림 3C)는 명료을 강화할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 무서워 기반 프로브의 원리 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링합니다. 두 fluorophores, 일반적으로 CFP (파란색)와 YFP (녹색)은, phospho - 결합 도메인 (오렌지색)과 phosphorylatable 시퀀스 (노란색)에 의해 연결되어 있습니다. 따라서 탐사에 conformational 변화를 유도 phospho 결합 도메인에 바인딩 인산화 (적색) mediates. CFP와 YFP 사이의 효율성을 걱정에 영향을 미치는 두 fluorophores, 사이의 거리 또는 방향의 차이에 conformational 변화 결과. 안달 흥분 CFP 및 모니터링 YFP 방출 (점선)에 의해 시각하실 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 실험 절차의 도식 개요. p_upload/3410/3410fig3.jpg "/&gt; 그림 3. Plk1 활동은 유사 분열 동안 G2 단계와 봉우리의 핵에서 처음 볼 수 있습니다. 안달 기반 프로브 모니터링 Plk1 활동 9,14을 표현 U2OS 세포는 20x NA 0.7 공기 객관적이고 수은 램프를 갖춘 Deltavision Spectris 이미징 시스템을 사용하여 60 시간에 대한 촬영했다. 이미징 조건 4X binning과 중성 밀도 필터를 사용하여, 같은 섹션 2에 명시된 최소한의 phototoxicity를 일으킬 선정되는 들어오는 빛을 차단 99%. 네 부문을 통해 한 셀 아래 거꾸로 걱정 - 비율, 잘못된 색상 표현. B, 의미 필터를 적용한 후에에 표시된 셀의 kymograph. C, 거꾸로의 부량는 A. D에 표시된 셀, 50의 누적 mitotic 항목의 비율을 걱정 딸 세포의 부서를 포함하여 표현 세포, - 프로브를 무서워.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

세포주기에 걸쳐 무서워 모니터링하는 것은 외부 자극에 단기 반응을 평가했을 때 덜 중요한 고려 사항이 필요합니다. 첫째, 세포주기의 진행은 쉽게 phototoxicity이 최소로 보관이 필요한, ​​스트레스 신호에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 둘째, 모든 기자 잠재적 kinases, phosphatases 또는 상호 작용 도메인을 titrating으로 세포 프로세스에 영향을 줄 수 있습니다. 실험 조건이 충분한 경우에는 평가하는 아마도 가장 간단한 방법은 유사 분열에서 유사 분열하는 세포주기의 길이를 측정하고 탐침의 형광 이미지와 표현의 독립 실험 비교하는 것입니다. 모니터링에 중요한 요소는 세포주기에 걸쳐 비율이 높은 해상도로 아름다운 이미지를 얻기위한 유혹을 견딜 수 있습니다 무서워. 정확한 설정이 현미경 시스템 및 표현 수준과 특정 프로브의 자연의 감도에 따라하지만, 사용하는 것이 중요합니다무엇에 해당하는 binning 수준의보고 절대적으로 필요합니다. CF...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> Leibovitz L - 15, 아니 페놀 레드 </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, 생명 기술에 의해 </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax - I </td><td> 31,966 </td><td> GIBCO, 생명 기술에 의해 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14,287 </td><td> GIBCO, 생명 기술에 의해 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td></tr></tbody></table>

안달 ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 기반 기자 1 살아있는 세포의 내생 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동의 평가를 허용합니다. 이러한 프로브는 일반적으로 phosphorylatable 시퀀스와 phospho - 바인딩 도메인 방해 CFP 및 YFP의 변종의 구성됩니다. 인산화되면 변화로 이어지는 CFP와 YFP 사이의 거리 또는 방향의 변경 결과 프로브 변경 형태는 (그림 1) 효율성을 무서워. 몇몇 프로브는 PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, 오로라 B 9 기자와 Plk1 구 등의 여러 kinases와 phosphatases의 활동 균형을, 모니터링, 지난 10 동안 공개되었습니다 . 모듈형 설계 감안할 때, 추가 프로브는 향후 10 등장할 가능성이있다. 세포주기를 통해 진행은 스트레스 signali에 의해 영향을받습니다NG 11 경로. 특히, 세포주기는 세포가 스트레스를 12 회복하는 경우에 비해 성장을 교란되지 않은 동안 다르게 규제입니다. 세포주기를 통해 세포의 시간 경과 이미징 따라서 특별한주의가 필요합니다. ratiometric 이미징을 채용 특히 잡음 비율 높은 신호를 두 개의 이미지가 정확하게 결과를 해석하는 데 필요한 때문에 이것은 문제가된다. Ratiometric는 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동에 세포주기에 의존 변경 이미징이 predominately 세포주기 8,9,13,14의 하위 섹션에 제한되었습니다 무서워. 여기, 우리는 인간의 세포주기에 걸쳐 ratiometric 이미징을 사용하여 걱정 기반 프로브를 모니터링하는 방법을 논의합니다. 방법은 생명 과학의 많은 연구자에게 제공하고 현미경이나 영상 처리의 전문 지식을 필요로하지 않는 장비에 의존합니다.

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

푀르스터 공명 에너지 전이(FRET) 기반 리포터는 살아있는 세포 내 내인성 인산화효소(kinase) 및 탈인산화효소(phosphatase) 활성의 평가를 가능하게 합니다. 이러한...

본 영상에서는 Förster Resonance Energy Transfer(FRET)를 이용하여 세포 주기 전반에 걸쳐 키나아제(kinase)와 포스파타아제(phosphatase)의 활성을 관찰합니다. 여기서는 한쪽 끝에 시안 형광 단백질(CFP)이, 다른 쪽 끝에 황색 형광 단백질(YFP)이 배치된 Polo-like kinase 1(PLK1) 활성 프로브를 사용합니다. 이 프로브를 U2 OS 세포에 형질전환합니다.그런 다음 G2/M 전이 과정 중 LK1 표적의 인산화 상태를 조사하기 위해, 형질전환된 U2 OS 세포를 대상으로 타임랩스 형광 이미징을 수행합니다. CFP와 YFP가 서로 가까이 위치하고 CFP가 흥분되면, 에너지가 YFP로 전달되어 YFP 방출을 검출할 수 있습니다. 하지만 프로브가 인산화되면, 단백질의 구조적 변화로 인해 CFP와 YFP가 서로 분리됩니다.이제 CFP가 여기되면, 강한 CFP 방출과 약한 YFP 방출만이 검출됩니다. CFP와 YFP 모두를 여기시킨 후 YFP 방출 비율을 정량화하면 PLK1 활성이 G2기에 증가하여 유사분열 중에 정점에 도달한다는 것을 알 수 있습니다. 따라서 표준 형광 촬영과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 촬영 조건이나 프로브의 발현으로 인해 세포 주기가 교란되지 않도록 특별히 주의를 기울였다는 점입니다. 이 방법은 특정 인산화효소나 탈인산화효소가 언제 어디서 활성화되는지와 같은 세포 주기 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 세포 주기 조절 효소에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 증식 분석과 같이 비정지 상태(unres conditions)가 요구되는 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 인간 세포 주기를 모니터링하기 위해, U2 OS 세포에 FRET 기반의 PK1 활성 프로브를 형질전환합니다. 표준 인산칼슘 형질전환법을 사용하여, 세포를 최소 7일 동안 puromycin으로 선별합니다.이는 프로브를 발현하는 세포군을 농축하고, 세포 주기에 심각한 영향을 미치거나 독성 수준으로 발현되는 세포의 수를 제한합니다. 이후 제한 희석법을 통해 CFP 발현이 확인되는 안정적인 클론을 선별한 다음, YFP 발현을 검토하여 모든 세포에서 대략 동일한 비율로 존재함을 확인합니다. 일부 세포가 CFP 또는 YFP만 포함하고 있다면 상동 재조합이 일어났을 가능성이 높으므로, 이 경우 sure 2 세포와 같이 상동 재조합이 덜 일어나는 박테리아를 사용하여 플라스미드 준비 과정을 반복한 후, 플라스미드를 선형화하여 형질전환을 다시 수행하십시오.세포가 프로브를 안정적으로 발현하면, 세포가 부착되어 30~50% 정도 합류(confluent)되었을 때 1.5번 유리 바닥 접시(glass bottom dish)에 분주합니다. 배지를 CO2 독립적이며 페놀 레드(phenol red)가 포함되지 않은 것으로 교체하고, 온도가 37 °C로 설정된 전동 에피 형광 현미경에 세포를 장착합니다. 현미경에는 CFP 및 YFP 여기 및 방출 필터가 갖춰져 있어야 합니다.CFP 및 YFP 모니터링에 적합한 ROIC 미러와 요구되는 해상도에 적합한 대물렌즈를 준비합니다. 여기서는 20 x NA 0.75 공기 대물렌즈가 사용되었습니다. 투과광을 이용하여 세포의 초점을 맞춥니다.이 시점에서는 형광등을 사용하지 마십시오. 형광등은 세포 주기를 교란할 수 있는 스트레스 반응을 유도하기 때문입니다. 광독성을 방지하려면, 필요한 세포 내 해상도를 확보할 수 있는 범위 내에서 굴절률을 최대값으로 설정하십시오. 본 실험에서는 핵과 세포질을 구분할 수 있어야 합니다.짧은 노출 시간을 설정하고 고밀도 중성밀도 필터를 삽입하십시오. 그런 다음 YFP 여기 및 방출을 사용하여 12비트 또는 16비트 테스트 이미지를 획득하십시오. 세포 내 평균 강도가 배경 강도에 배경 강도의 최소값과 최대값 차이의 5배를 더한 값과 거의 같아지도록 노출 시간과 중성밀도 필터를 조정하십시오. 이미지가 포화되지 않았는지 확인하려면 샘플 이미지의 형광 강도를 검토하십시오.세포가 분열기로 진입할 때 발생하는 강도 차이를 고려하여, 이미지의 최대 강도는 다이내믹 레인지의 절반 미만이 되어야 합니다. 다음으로, CFP 여기 필터와 YFP 방출 필터를 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 초점 맞춤 및 노출 조건 최적화에 사용된 영역을 제외하고, 형질전환된 세포가 포함된 여러 영역을 선택하십시오.이러한 절차들이 스트레스 반응을 유발했을 수 있으므로, 모든 세포에서 최대 강도가 동적 범위의 절반 미만이 되도록 확인하십시오. 소프트웨어를 사용하여 YFP 여기, YFP 방출 및 CFP 여기, YFP 방출 필터를 이용해 45분마다 두 개의 이미지를 획득하도록 설정하십시오.또한 실험의 총 길이를 세포 주기 기간보다 길게 설정하십시오. 모든 설정이 완료되면 이미지 획득을 시작하십시오. 획득이 완료된 후, 획득한 이미지를 열어 유사분열에서 다음 유사분열까지의 세포 주기 시간을 모니터링하십시오. 여기서 형질전환된 프로브를 발현하는 세포의 경우, 세포 주기 시간은 대략 20에서 25시간이었습니다.이를 사용된 세포 유형의 대조군 데이터와 비교하십시오. 세포 주기 시간이 참조 타이밍과 일치하면 FRET 분석이 가능합니다. 타이밍이 확인되면 이미지를 분석할 수 있습니다.분석은 대부분의 현미경 전용 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 여기서는 ratio plus 플러그인이 설치된 Image J 프리웨어를 사용합니다. Image J에서 이미지를 열어 분석을 시작하십시오. 이미지가 다색 스택 형식인 경우, Image 메뉴에서 하이퍼 스택으로 변환하여 개별 채널을 분리하십시오.그 다음 hyper stack을 선택한 후 stack to hyper stack을 클릭합니다. 설정값이 표시된 convert to hyper stack 창이 열리면 확인(okay)을 클릭합니다. 이제 이미지 아래에 두 개의 슬라이더 바가 표시됩니다.이미지를 단일 채널 스택으로 분리하려면, 이미지 위에서 클릭한 후 hyper stack reduce dimensionality를 선택하십시오. 그러면 reduce 창이 열리는데, 여기서 frames와 keep source가 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 Okay를 클릭하십시오.단일 채널만 포함된 새 이미지가 나타납니다. 이 과정을 반복하여 두 번째 채널이 포함된 새 이미지를 띄웁니다. 다음으로, 최종 이미지의 시각적 선명도를 높이기 위해 YFP excitation YFP emission 스택을 선택합니다.프로세스(process)를 클릭한 다음, 수학(math)을 클릭하십시오. 이후 곱하기(multiply)를 클릭하십시오. 곱하기 창이 열리면, YFP excitation YFP emission 스택에 3을 곱하기 위해 3을 입력하십시오. 이 단계는 선택 사항이며, 비율이 0과 1 사이의 범위에 있지 않도록 하기 위해 수행합니다.다음으로, Image J 툴바에서 freehand 툴을 선택합니다. 그런 다음 YFP excitation, YFP emission 스택에서 세포가 없지만 측정할 세포와 가까운 영역에 관심 영역(ROI)을 지정한 후, analyze tools를 클릭하여 ROI manager에 ROI를 추가합니다. 이어서 ROI manager를 클릭합니다.ROI 관리자 창이 나타납니다. 추가를 클릭하여 YFP excitation YFP emission 스택에서 ROI의 평균 강도를 측정하기 위한 ROI 좌표를 저장하십시오. 분석을 클릭한 다음 측정을 선택하십시오.결과 창이 열립니다. CFP 여기 YFP 방출 스택을 선택하십시오. 그다음 ROI 관리자에서 해당 ROI를 더블 클릭하고 측정을 반복하십시오.측정값이 결과 창에 추가됩니다. 스택의 다른 위치로 스크롤하여 여러 시점에서 이 과정을 반복하십시오. 결과 창의 측정값을 비교하여 관심 세포 주변의 배경 강도가 필름 전체에서 유사한지 확인하십시오.최소 강도를 포함하여 측정값을 설정하려면 분석(analyze)을 클릭한 다음, 측정값 설정(set measurements)을 클릭하고 최소 및 최대 그레이 값(gray value)을 지정하십시오. 이어서 측정 대안을 보여주는 창이 나타납니다. 필요에 따라 밝기와 대비를 조정한 후, 세포의 대부분을 덮는 ROI를 그려 두 스택(stack) 모두에서 최소 강도를 측정하십시오.그런 다음, 이번에는 배경 대신 세포를 사용하여 이전과 동일하게 측정합니다. 결과 섹션의 값들을 사용하여 측정된 최소 강도와 배경 강도의 차이를 계산하고 이를 2로 나눕니다. 이를 통해 clipping value to open ratio 및 select plugins를 위한 초기 추정값을 얻을 수 있습니다.그 다음 ratio plus를 선택합니다. FRET 비율의 경우, CFP 들뜸 YFP 방출 S stack 1을 선택하거나, 인산화 시 FRET 효율이 감소하는 프로브를 시각화하기 위한 inverted FRET 비율의 경우 YFP 들뜸 YFP 방출 S stack 1을 선택하여 측정된 배경 강도와 클리핑 값을 입력합니다.결과 창의 값들을 사용하여 ratio plus 창에 붙여넣으십시오. 결과로 생성된 ratio stack의 스케일을 설정하고, ratio 변화를 시각화하기 위해 적절한 lookup table을 적용하십시오. PLK1 활성을 모니터링하는 FRET 기반 프로브를 발현하는 U2 OS 세포를 본 동영상에 설명된 대로 60시간 동안 촬영하였습니다.이 이미지는 딸세포의 분열을 포함하여, fret 프로브를 발현하는 50개 세포의 누적 유사분열 진입을 보여줍니다. 프로브를 발현하는 대부분의 세포는 20에서 25시간 사이의 세포 주기 시간으로 증식하며, 이는 이미징 조건과 프로브의 발현 수준이 세포 주기 타이밍에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 한 세포의 4회 분열 과정을 추적한 반전 fret 비율의 가색(false color) 표현은 상당한 노이즈가 있음에도 불구하고, PK one 활성이 G two에서 증가하여 유사분열 중에 정점에 도달하는 경향이 있음을 보여줍니다.원시 데이터를 평균 필터링하여 그래프로 나타내면 활성 정점 사이의 시간을 쉽게 추정할 수 있습니다. 이 그림은 이전 이미지에 표시된 세포의 역 FRET 비율 정량화 결과를 그래프로 보여줍니다. 활성화 시점을 추정할 수 있으며, 여기서 알 수 있듯이 프로브의 인산화는 유사분열에서 인산화가 정점에 도달하기 약 4시간 전에 관찰되기 시작합니다.이 절차를 수행할 때는 세포가 스트레스를 받지 않는 상태를 유지하는 것이 중요하므로, 빛에 대한 노출을 최소화하고 온도나 pH의 변화를 최소화해야 합니다. 또한, 이 방법은 세포 내 키나아제(kinase)와 포스파타아제(phosphatase) 활성 사이의 균형을 모니터링한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차는 RNA 간섭이나 억제제 스크리닝과 결합하여 이러한 키나아제 및 포스파타아제의 상위 조절 인자를 식별하는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

이 비디오는 테스트 단백질에 특이적인 항체에 태그된 공여체 및 수용체 형광단의 도움으로 내인성 단백질 인산화를 결정하기 위한 시간 분해 Förster 공명 에너지 전달 또는 TR-FRET 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 세포 용해물에서 테스트 단백질의 인산화를 측정하도록 설계되었습니다.

세포의 단백질 인산화를 모니터링하기 위한 시간 분해 Forster 공명 에너지 전달

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

다기능 Ser/Th 키나아제 AURKA의 활성화는 Thr288에 대한 자가포스포틸화로 특징지입니다. 여기에서는 프로브 엔지니어링을 위한 몇 가지 전략과 미토시스 전반에 걸쳐 키나아제 활성화를 따르는 빠른 FRET 프로토콜을 설명합니다.

라이브 셀의 형성 FRET 바이오 센서를 사용하여 오로라 키나아제 활성화의 실시간 모니터링

시간-분해된 Förster 공명 에너지 전달 세포 기반 분석 프로토콜은 384-웰 포맷의 세포 용해물에서 내인성 인산화 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 1/3/4/5/6 단백질의 단순하고, 특이적이며, 민감하고, 강력한 정량화를 위해 기술된다.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

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In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

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HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

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안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

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