라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

매장 운영하는 CA의 범위

이 실험 방법은 형광 기반 방법을 사용하여 암 및 골격근 세포에서 저장 작동 칼슘 진입 또는 SOCE의 특성을 밝히는 데 사용됩니다. 이는 세포 내 칼슘 농도에 민감한 살아있는 세포에서 URA 2의 형광을 기록함으로써 달성됩니다. 또한, 칼슘 농도에 둔감한 파장의 망간을 첨가하여 담금질하는 속도를 측정하는데, 이는 SOCE 연구를 위한 SOCE의 활성화를 직접적으로 반영합니다.

구조적으로 전문화된 골격근 세포에서는 근육을 절개하고 가죽을 벗깁니다. 근섬유가 준비되어 있습니다. 그런 다음 섬유를 낮은 친화성 칼슘 지표로 처리하고 내부 형광을 모니터링합니다.

이러한 방법은 SOCE가 흥분되지 않는 세포와 골격근 모두에 존재하며 등급이 매겨진 활성화와 세포 내 칼슘 저장 함량에 대한 긴밀한 결합을 통해 존재한다는 것을 보여줍니다. 전기생리학, 패치 클랜과 같은 다른 방법에 비해 이 플루오레세인 기반 기술의 주요 장점은 사용이 편리하고 세포 집단 연구 또는 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있다는 것입니다. 의식 미터법 환경 및 맥코닝 분석에 적합한 에스테티션 S를 사용하는 것이 중요합니다.

따라서 각 기기가 다르기 때문에 개별 기기의 교정이 중요합니다. 단일 근육 섬유의 기계적 피부 과정은 특별한 실습 교육, 미세 해부 기술에 대한 심층적인 이해 및 학습, 주의 깊은 관찰 및 정말 많은 환자가 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 시작하기 전에 URA 2 형광 측정을 위해 현미경 설정을 보정합니다. 칼슘 결합 및 칼슘 3 URA 2에 대한 여기 파장은 3 40 및 3 80 나노 미터이지만, 칼슘 측정을위한 URA 2의 최적 비율 동적 범위는 특정 현미경 시스템의 다른 파장에서 발생할 수 있습니다.

이러한 파장의 이동은 다양한 광학 구성 요소가 추가됨에 따라 광학 경로가 변경되었기 때문입니다. 마찬가지로 각 시스템의 ISO 경련점도 다릅니다. 따라서 스펙트럼 스캐닝을 통해 이 파장을 결정하는 것이 중요합니다.

대안적으로, Ming 스크리닝은 최종 값이 칼슘 농도와 무관하도록 두 파장에서 형광등만으로 기록할 수 있습니다. RFP를 발현하는 플라스미드로 배양된 K Ys SE one 50 세포를 transection하는 것으로 시작하며, HRNA에 대해 특이적으로 또는 I one 또는 스크램블 서열을 48시간 동안 포함합니다. transfection된 세포를 유리 바닥 접시에서 성장시킵니다.

그런 다음 매체를 제거하고 균형 잡힌 소금 용액 또는 BSS로 세포를 헹굽니다. 헹굼 후 오전 2:00에 2마이크로몰 RA 2가 포함된 BSS 1ml를 추가하고 접시를 섭씨 37도에서 40분 동안 유지합니다. 세포를 실온에서 15분 동안 두어 세포 내 URA 2:00 AM 형태가 URA 2로 전환되도록 합니다.

그런 다음 현미경으로 BSS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 시각화 모드에서 RFP를 표현하는 셀을 선택합니다. 방출 파장을 510나노미터로 설정하고 여기 파장을 350 및 390나노미터로 설정하여 여기비 모드를 선택합니다.

비율이 세 번째 창에 표시됩니다. 다음으로 기록합니다. 선택된 세포는 미리 결정된 파장에서 형광을 발하고 세포는 4개의 서로 다른 용액으로 관류됩니다.

마찬가지로, KYSE one 50 셀에는 ferra two가 로드되고 기록될 수 있습니다. 여기비 모드에서는 이전 절차와 달리 ISO 경련점 360나노미터가 여기 파장으로 선택됩니다. 그런 다음 360 및 390 나노미터에서 형광을 동시에 기록하는 동시에 세포에 5개의 서로 다른 BSS 용액을 주입합니다.

이 프로토콜의 경우, C two C 12 cells, mouse myogenic cell line을 유리 바닥 접시에서 배양하여 합류시킨 다음 2.5% horse serum을 함유하는 분화 배지에서 myo tube로 분화해야 합니다. BSS 용액에 최종 농도 5마이크로몰 RA 2:00 AM의 C 2 C 12 myo 튜브를 로드하고 40분 동안 배양합니다. 그런 다음 20 마이크로 어금니와 벤조 p 톨루엔 스미드 또는 BTS의 최종 농도를 추가하여 근육 수축과 그로 인한 운동 아티팩트를 억제합니다.

실온에서 15분 동안 세포를 배양하고 모든 용액에서 BTS를 유지합니다. 다음으로 4를 로드합니다. 소금 용액의 균형을 관류 시스템으로 맞춥니다.

앞에서 설명한 대로. 각 풍부 동안 360 및 390 나노 미터에서 선택한 세포의 형광을 기록합니다. 이 시리즈에서는 마그네슘과 thap argen을 함께 적용하여 마그네슘 이온 담금질을 모니터링합니다.

소포체 칼슘 저장고는 고갈되고 있습니다. 신근 digitorum longus 또는 EDL 근육을 절개하려면 안락사된 쥐의 다리를 측면으로 배치하고 발목 부위에서 무릎까지 피부를 제거합니다. 조직의 표재성 근육층을 절단하여 EDL을 노출시키고 상부 힘줄과 아래쪽 힘줄을 모두 절단하여 손상되지 않은 EDL 근육을 자유롭게 합니다.

힘줄의 길이를 가능한 한 길게 유지하는 것이 중요합니다. 이제 수축을 방지하기 위해 실체 현미경으로 칼슘이 없는 0.1밀리몰 EGTA를 함유한 T 로드 용액으로 EDL을 옮깁니다. 무릎 삽입 힘줄을 두 부분으로 나누고 EDL 근육을 두 다발로 나눕니다.

8개의 번들을 얻을 때까지 이 과정을 반복합니다. 묶음에서 힘줄을 잃어버린 경우 묶음을 버리십시오. 다음으로, EDL 번들 스트립의 양쪽 힘줄을 잡고 3개 또는 4개의 분리된 단일 근육 섬유가 양쪽에 힘줄 조직과 함께 손상되지 않을 때까지 스트립을 조심스럽게 늘립니다.

유리 바닥 접시에 칼슘이 없는 티로 완충액 한 방울을 넣으십시오. EDL 스트립을 접시에 똑바로 놓고 가능한 한 많은 용액을 빠르게 제거합니다. 다음으로, 방수 스카치 테이프를 사용하여 양쪽 힘줄을 단단히 테이프로 감습니다.

먼저 칼슘이 없는 용액으로 섬유질을 씻고 2.5밀리몰의 칼슘 용액으로 두 번 씻습니다. 섬유가 과도하게 수축하여 손상이 발견되면 섬유를 버리고 선택한 건강한 근육 섬유를 1번 세척액으로 3회 세척한 다음 스킨닝 용액과 같은 변형된 세포 내 용액으로 5분 동안 목욕시킵니다. 핀 홀더에 부착된 텅스텐 바늘을 사용하여 실체 현미경으로 섬유를 기계적으로 스킨링하면 섬유는 횡세뇨관에서 칼슘과 결합된 도로 5n을 다시 밀봉하고 가둡니다.

건강하게 온전한 단일 근육 섬유 또는 여전히 약간의 힘줄이 붙어있는 이러한 유형의 섬유 다발을 얻는 것은 제 생각에 이러한 섬유를 최종 실험실로 항상 매우 어렵게 옮기는 가장 어려운 단계 중 하나입니다. 이 과정에서 섬유가 과도하게 수축하거나 끊어질 수도 있습니다. 따라서 건강한 섬유가 있으면 기계적인 피부 자체가 SR을 로드하는 것이 훨씬 쉬울 것입니다. 섬유와 스키닝 용액을 20 마이크로 몰 흐름 5 N am으로 배양합니다.

광범위한 세척과 세척 용액 2 번으로 배양을 수행하고 30 분의 추가 배양을 통해 염료의 완전한 에스테르 화를 허용합니다. 그런 다음 관심 영역에서 60x 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 섬유를 시각화할 수 있습니다. 섬유가 SR loading SR Depletion 용액으로 관류되는 동안 각 염료의 형광을 동시에 기록합니다.

KYS, SE one 50 세포의 SOCE 활성은 세포 내 칼슘 측정을 사용하여 검사되었습니다. 세포는 RFP와 짧은 헤어핀, A-S-O-C-E 채널을 암호화하는 OR I one 유전자에 대한 RNA로 코드 transection되었으며, black trace knocking down 또는 I one 발현으로 표시되는 대조군과 비교하여 SOCE 활성이 감소했으며, SOCE 및 KYC one 50 cells도 망간 담금질 분석으로 확인되었습니다. TG가 ER 칼슘 저장량을 완전히 고갈시킨 후, 망간의 풍부함은 현저한 형광 감소를 초래했습니다.

URA 2 신호 손실의 가파른 기울기는 SOCE가 더 활성화되었음을 나타냅니다. 따라서, 2개의 A PB 처리된 세포에서 느린 형광 감소는 SOCE 활성이 이 화합물에 의해 차단되었음을 나타냅니다. 망간 담금질 속도는 담금질이 포화 없이 여전히 선형 범위에 있는 초기 10초부터 결정되었으며, 배양된 근육 세포에서 유사한 망간 담금질 분석이 수행되었습니다.

이 경우, 망간은 tg와 함께 적용되었습니다. TG가 SR 칼슘 저장량을 고갈시키는 동안 형광 담금질 기울기는 최대 속도에 도달할 때까지 점차적으로 변화했습니다. 시그모이드 곡선은 이러한 실험 조건에서 SOCE의 단계적 활성화를 나타냅니다.

컨포칼 이미징에서 TT 격실의 5번 도로와 다이의 스킨 섬유 트래핑은 빨간색 채널에서 볼 수 있는 것과 같은 특징적인 포유류 이중선 패턴을 보여주었습니다. 유동 5 NM으로 SR을 적재한 후, SR 격실에서 SR 고갈 용액 형광 수준이 증가함에 따라 TTSR 적재 용액 형광 강도가 증가한 TTSR 로딩 용액 형광 강도와 함께 스킨 섬유가 풍부할 때 녹색 채널에서 전형적인 단점 SR 패턴이 보였고 TT 격실은 감소하기 시작했습니다. 이는 SR 칼슘 저장 고갈과 SOCE 활성화 사이에 각각 연관성이 있음을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 처음으로 실행 가능한 정말 건강하고 손상되지 않은 근육 섬유를 얻는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다. 그들은 효과적인 피부 과정을 허용하기 위해 끝에 충분한 힘줄이 있어야 하며, 이는 궁극적으로 실험자가 놀라운 이점을 가진 생리학적으로 관련된 준비를 할 수 있도록 합니다. 이 연구에 사용된 모든 형광등은 일반적으로 빛에 민감하며 이 절차를 수행하는 동안 어두운 접시에 넣고 어두운 방에서 세탁하는 것과 같은 예방 조치를 항상 연습해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

O 이 기술을 마스터하면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 우리가 제안하는 것은 기계적인 얇은 단계에서 더 높은 성공률을 허용하기 위해 여러 가지 손상되지 않은 섬유를 먼저 얻고, 개발 후 하룻밤 동안 이러한 섬유를 배양하려는 경우에도 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 칼슘 신호 전달 분야의 연구자들이 암세포의 성장과 사멸에서 저장 작동 칼슘 유입의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

근육의 생리적, 병리학적 기능.