라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

본 실험 방법은 형광 기반의 방식을 사용하여 암세포 및 골격근 세포에서 저장소 작동 칼슘 유입(store operated calcium entry, SOCE)의 특성을 규명하는 데 사용됩니다. 이는 세포 내 칼슘 농도에 민감한 URA two의 형광을 살아있는 세포에서 기록함으로써 이루어집니다. 또한, 칼슘 농도에 민감하지 않은 파장에서 망간 첨가에 의한 형광 소광 속도를 측정하며, 이는 SOCE의 활성화를 직접적으로 반영하므로 SOCE 연구에 활용됩니다.

구조적으로 전문화된 골격근 세포에서 근육을 박리하고 외피를 제거합니다. 근섬유를 준비합니다. 그다음 근섬유를 저친화도 칼슘 지시약으로 처리하고 내부 형광을 모니터링합니다.

이러한 방법들은 SOCE가 비흥분성 세포와 골격근 모두에서 존재하며, 단계적 활성화와 세포 내 칼슘 저장량과의 밀접한 결합을 보인다는 것을 입증합니다. 전기생리학이나 패치 클램프와 같은 다른 방법들에 비해 이 플루오레신 기반 기술의 주요 장점은 사용이 편리하며 세포군 연구나 고효율 스크리닝에 적용할 수 있다는 점입니다. 정량적 환경 및 마그네슘 농도 분석을 위해 적절한 에스테틱스 S를 사용하는 것이 중요합니다.

기기마다 특성이 다르기 때문에 개별 기기의 보정은 매우 중요합니다. 단일 근섬유의 기계적 피부 공정은 특수한 실습 교육과 미세 해부 기술에 대한 심층적인 이해 및 학습, 세심한 관찰, 그리고 상당한 인내심이 필요하므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시작하기 전, URA two 형광 측정을 위해 현미경 설정을 보정하십시오. 칼슘 결합 및 calcium three URA two의 흥분 파장은 340 및 380 nanometer이지만, 특정 현미경 시스템에서 칼슘 측정을 위한 URA two의 최적 비율 동적 범위는 다른 파장에서 나타날 수 있습니다.

이러한 파장의 변화는 다양한 광학 부품이 추가됨에 따라 광로가 변경되기 때문에 발생합니다. 마찬가지로, 각 시스템의 ISO spastic point 또한 달라집니다. 따라서 스펙트럼 스캔을 통해 이 파장들을 결정하는 것이 중요합니다.

또는, 최종 값이 칼슘 농도와 무관하도록 임의의 두 파장에서 형광만을 측정하여 Ming 스크리닝을 기록할 수 있습니다. 먼저 RFP를 발현하는 플라스미드와 I one에 특이적인 HRNA 또는 스크램블 서열을 포함하는 플라스미드로 배양된 K Ys SE one 50 세포를 형질전환하여 48시간 동안 배양하십시오. 형질전환된 세포를 유리 바닥 접시에서 배양하십시오.

그 다음 배지를 제거하고 균형염 용액(BSS)으로 세포를 세척합니다. 세척 후, 2 µM RA가 포함된 BSS 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 40분 동안 배양합니다. 세포 내의 URA 형태가 URA 2로 전환될 수 있도록 상온에서 15분 동안 둡니다.

그런 다음 현미경 하에서 BSS로 플레이트를 2회 세척합니다. 시각화 모드에서 RFP를 발현하는 세포를 선택합니다. 방출 파장은 510 nanometers로 설정하고, 여기 파장은 350 및 390 nanometers로 설정하여 여기비(excitation ratio) 모드를 선택합니다.

비율은 세 번째 창에 표시됩니다. 다음으로, 네 가지 서로 다른 용액이 세포에 관류되는 동안 미리 설정된 파장에서 선택된 세포의 형광을 기록하십시오.

마찬가지로, KYSE 150 세포에 ferra 2를 로딩한 후 기록을 진행합니다. 들뜸 비율 모드(excitation ratio mode)에서는 이전 절차와 달리, ISO spastic point 360 nm를 들뜸 파장으로 선택합니다. 그런 다음 5가지 서로 다른 BSS 용액으로 세포를 관류하는 동안 360 nm와 390 nm에서의 형광을 동시에 기록합니다.

본 프로토콜에서는 마우스 근원세포주인 C2C12 세포를 유리 바닥 배양 접시에서 합류(confluence) 상태까지 배양한 후, 2.5% 말 혈청(horse serum)이 포함된 분화 배지에서 근관(myotubes)으로 분화시켜야 합니다. BSS 용액을 사용하여 C2C12 근관에 RA 2:00 AM을 최종 농도 5 µM로 처리하고 40분 동안 배양합니다. 그 다음, 근육 수축 및 그로 인한 모션 아티팩트를 억제하기 위해 20 µM의 최종 농도로 벤조-p-톨렌설폰아마이드(benzo-p-toluene sulfonamide, BTS)를 첨가합니다.

세포를 상온에서 15분 동안 배양하며 모든 용액에는 BTS를 유지합니다. 다음으로, 4개의 균형 염 용액(Balance salt solutions)을 관류 시스템에 로드합니다.

이전에 설명한 바와 같습니다. 매 관류 시 360 및 390 nanometers에서 선택된 세포의 형광을 기록합니다. 본 시리즈에서는 마그네슘 이온 퀜칭(quenching)을 모니터링하기 위해 마그네슘과 thap argen을 함께 처리합니다.

소포체 칼슘 저장량이 고갈되는 동안, 장지신근(extensor digitorum longus) 또는 EDL 근육을 분리하기 위해 안락사시킨 마우스의 다리를 측면으로 배치하고 발목부터 무릎까지의 피부를 제거합니다. 표면의 근육 조직층을 절개하여 EDL을 노출시킨 다음, 상단과 하단 건을 모두 절단하여 온전한 EDL 근육을 분리합니다.

건의 길이를 최대한 길게 유지하는 것이 중요합니다. 이제 수축을 방지하기 위해, 실체 현미경 하에서 EDL을 0.1 millimolar EGTA가 포함되고 칼슘이 없는 T road 용액으로 옮깁니다. 무릎 삽입 건을 두 부분으로 강제로 나누고 EDL 근육을 두 개의 다발로 분리합니다.

여덟 개의 번들이 얻어질 때까지 이 과정을 반복합니다. 어느 번들에서든 힘줄이 소실된 경우, 해당 번들은 폐기합니다. 다음으로, EDL 번들 스트립의 양쪽 힘줄을 잡고, 양 끝에 힘줄 조직이 붙어 있는 분리된 단일 근섬유가 3~4개 남을 때까지 스트립을 조심스럽게 늘립니다.

글라스 바텀 디쉬에 칼슘 제거 tyro 버퍼를 한 방울 넣습니다. EDL 스트립을 디쉬 위에 곧게 펴놓고, 최대한 빠르게 용액을 제거합니다. 그다음, 내수성 스카치 테이프를 사용하여 양쪽 힘줄을 단단히 고정합니다.

먼저 섬유를 칼슘 제거 용액으로 세척한 후, 2.5 millimolar 칼슘 용액으로 두 번 더 세척합니다. 섬유의 과수축 및 손상이 관찰되면 해당 섬유는 폐기하고, 선택된 건강한 근섬유를 세척 용액 1번으로 세 번 세척한 다음, 수정된 세포 내 유사 피부 제거 용액(modified intracellular like skinning solution)에 5분 동안 담가 둡니다. 핀 홀더에 부착된 텅스텐 바늘을 사용하여 실체 현미경 하에서 섬유의 피부를 기계적으로 제거하면, 섬유가 다시 밀봉되면서 가로관(transverse tubules) 내에 칼슘과 결합된 road five n이 포획됩니다.

제 생각에 건강한 단일 온전한 근섬유 또는 힘줄이 일부 부착된 이러한 유형의 섬유 다발을 얻는 것은 가장 까다로운 단계 중 하나이며, 그다음으로 어려운 과정은 이러한 섬유를 최종 실험 챔버로 옮기는 매우 어려운 작업입니다. 이 과정에서 섬유가 과수축하거나 심지어 파손될 수 있습니다. 따라서 건강한 섬유를 확보했다면, 기계적 스키닝(skinning) 과정에서 SR을 로드하는 것이 훨씬 수월해질 것입니다. 20 µM 플루오르-5-니트로아미노산(flow five N am)이 포함된 스키닝 용액에서 섬유를 배양하십시오.

배양 후 세척액 2번으로 충분히 세척하고, 염료의 탈에스테르화가 완전히 이루어지도록 30분 동안 추가 배양합니다. 그 후, 관심 영역에서 60배 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 섬유를 시각화할 수 있습니다. 섬유에 SR 로딩 및 SR 고갈 용액을 관류하는 동안 각 염료의 형광을 동시에 기록하십시오.

세포 내 칼슘 측정을 통해 KYS, SE one 50 세포의 SOCE 활성을 조사하였습니다. 세포에 RFP와 Orai1 유전자를 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA를 공동 형질전환하였으며, Orai1 유전자는 SOCE 채널을 인코딩합니다. 검은색 추적으로 표시된 대조군과 비교했을 때, Orai1 발현을 억제하면 SOCE 활성이 감소하는 결과가 나타났습니다. KYS one 50 세포에서의 SOCE는 망간 소광 분석으로도 확인되었습니다. TG가 ER 칼슘 저장고를 완전히 고갈시킨 후, 망간을 투입하자 형광 강도가 유의미하게 감소하였습니다.

URA two의 신호 손실 기울기가 더 가파르다는 것은 SOCE가 더 활발함을 나타냅니다. 따라서 two A PB 처리 세포에서 형광 감소 속도가 느려진 것은 이 화합물에 의해 SOCE 활성이 차단되었음을 의미합니다. 망간 퀜칭 속도는 포화 없이 퀜칭이 여전히 선형 범위에 있던 초기 10초 동안의 데이터를 통해 결정되었으며, 이와 유사한 망간 퀜칭 분석이 배양된 근육 세포에서도 수행되었습니다.

이 사례에서는 망간을 tg와 함께 처리하였습니다. TG가 SR 칼슘 저장고를 고갈시키는 동안, 형광 소광 기울기는 최대 속도에 도달할 때까지 점진적으로 변화하였습니다. 이러한 S자형 곡선은 해당 실험 조건에서 SOCE의 단계적 활성화를 나타냅니다.

공초점 이미징 하에서, red channel에서 관찰된 것과 같이 TT 구획 내 rhodamine 5 및 dye의 skin-fiber trapping은 전형적인 포유류의 doublet 패턴을 보였습니다. SR에 fluo-5N을 로딩한 후, skinned fiber에 TTSR 로딩 용액을 처리하자 green channel에서 전형적인 점상(punctuated) SR 패턴이 관찰되었습니다. SR 고갈 용액을 처리함에 따라 rhodamine 5N과 fluo-5N 모두의 형광 강도가 증가하였습니다. 이후 SR 구획과 TT 구획의 형광 수준이 감소하기 시작했습니다. 이는 SR 칼슘 저장고의 고갈과 SOCE 활성화 사이에 각각 결합(coupling)이 존재함을 나타냅니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 생존 가능하며 매우 건강하고 온전한 근섬유를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 근섬유의 끝부분에 충분한 힘줄이 있어야 효율적인 박리 과정이 가능하며, 결과적으로 실험자는 엄청난 이점이 있는 생리학적으로 유의미한 표본을 준비할 수 있게 됩니다. 본 연구에 사용된 모든 형광 염색제는 일반적으로 빛에 민감하므로, 이 절차를 수행하는 동안 암실에서 시료를 처리하거나 세척하는 등의 주의 사항을 반드시 준수해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

이 기술을 숙달하면 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 기계적 분리 단계의 성공률을 높이기 위해 먼저 여러 개의 온전한 섬유를 확보할 것을 권장하며, 분리 후 이 섬유들을 하룻밤 동안 배양하고자 하는 경우에도 마찬가지입니다. 이 기술은 칼슘 신호 전달 분야의 연구자들이 암세포의 성장 및 사멸에서 저장소 작동 칼슘 유입(store operated calcium entry)의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

근육에서의 생리적 및 병리적 기능.