Name: 새로운 Multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 다층 플라스크를 활용한 포유류 세포 배양 스케일 업 방법입니다. 균일한 세포 증식과 3-5배 높은 수율을 달성하여 생명공학 연구의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

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1. 프로토콜 세포 배양을위한 멀티 Flasks을 사용하는 <ol><li> 선박의 준비와 세포 현탁액을 추가 <ol><li> 필요에 따라 세포 성장 매체를 준비합니다. </li><li> 멀티 플라스크 세로로 작업 표면 (무균 층류 후드)에 직면하고있는 캡과의 측면에 선. <ol><li> 이러한 flasks 3에서 사용할 수있는 5 층 형식과 T - 175 술병과 비슷한 작업 흐름 패턴을 사용합니다. </li></ol></li><li> 풀어 뚜껑을 제거합니다. 50 또는 100 ML의 피펫을 사용하여 플라스크 내부 또는 외부로 쏟아져 사전 예열 매체의 필요한 금액을 추가합니다. <ol><li> 멀티 Flasks이 모자가 위쪽을 향하고와 세로로 배치하는 경우 ≤ 10 ML은 선박의 바닥에 도달할 수 있습니다 아르 Pipettes. Pipettes ≥ 10ml 이는 선박 미디어의 큰 볼륨을 추가할 수있는 편리한 포털을 제공, 멀티 술병에있는 로고 과거 즉시 혈관에 도달할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 매체의 버블링을 피하기 위해, FL에 액체 스트림을 허용멀티 술병의 뚜껑 (로고 쪽)의 내벽을 따라 오우. </li><li> 10 ML 피펫 및 캡 flasks을 사용하여 상위 계층을 통해 성장 매체에 집중 세포 주식의 세포 현탁액을 추가합니다. 도움말 : - 교통 인큐베이터 사이트에 카트 멀티 Flasks하고 나머지 단계를 수행합니다. - 셀 시딩 밀도는 셀 유형, 매체 및 문화 기간이 필요에 따라 달라집니다. 표준 T - 175 flasks에서 사용하는 시딩 밀도와 미디어 볼륨으로 시작하여 형식이 사용되는 다중 술병에 따라 3 또는 5 곱하면됩니다. </li></ol></li><li> 세포의 혼합 <ol><li> 위치를 믹스 : 로고가 직면하고 함께 똑바로 멀티 휴대용 술병을 잡고 카운터 45 ~ 시계 방향 각도 당신을 마주 믹스 포트. </li><li> 같은 각도에서 개최, 부드럽게 상단 레이어의 액체까지 (당신을 멀리 목) 앞에서 뒤쪽으로부터 멀티 휴대용 술병을 기울 것은 완전히 소모될 downwar믹스 포트를 통해 DS. 믹스 포트쪽으로 돌고. </li><li> 마찬가지로, 부드럽게 중간 완전히 혼합 포트를 통해 상단을 향해 아래쪽 레이어에서 하수구까지 뒤에서 앞에서 (당신쪽으로 목)에 다중 휴대용 술병을 바위. 단계 1.2.2과 적절한 혼합을 보장하기 1.2.3 한 번 더 반복합니다. </li><li> 다시 믹스 위치 (1.2.1 단계)에 멀티 휴대용 술병을 지참하고 1.3 단계로 진행 </li><li> 또는 세포 현탁액은 멀티 술병에서 외부 준비할 수 있으며, 세포 현탁액은 피펫을 사용하여 혈관이나 부드러운 쏟아져하여 추가할 수 있습니다. <ol><li> 믹스 포트는 미디어와 세포의 인 - 선박은 혼합 수 있으며 외부 세포 정지의 큰 볼륨을 만들 필요가 없습니다. </li><li> 또한 멀티 술병의 레이어에 걸쳐 미디어 등화 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> 유체의 평균 <ol><li> 혼합 / 세포 현탁액의 추가 후, 장소 멀티 플라스크 수직 평면 작업 표면에 액체 볼륨 equa를 맞춰야베드로 모든 레이어 인치 </li></ol></li><li> 각각의 레이어로 분할 액체 <ol><li> 당신이 직면하고있는 로고와 함께 멀티 휴대용 술병을 잡고 레이어의 각 파티션에 45 ° 각도 액체 시계 방향으로 회전. 팁 : - 최상의 결과를 얻으려면이 단계 1.3-1.4의 평면 작업 표면을 사용하는 것이 중요합니다 </li></ol></li><li> 수송 <ol><li> 일단 세포 현탁액을 포함하는 미디어 전송 멀티 술병은 같은 45 ° 각도 (시계 방향) 거리에 인큐베이터로 믹스 포트에서 미디어 단계 1.4.1에서와 같이에서 분할됩니다. 현미경에서 볼 배양기에서 flasks를 제거하면이 위치도 적합합니다. </li></ol></li><li> 보육 선반에 멀티 술병 배치 <ol><li> 에서 멀티 휴대용 술병을 들고 45 ° 각도 (시계 방향, 거리 믹스 포트에서), 부드럽게로 믹스 포트에서 거리 모퉁이를 사용하여 (배양기 표면에 가로로 내려 회전피봇). 로고가 직면와 함께 멀티 휴대용 술병을 놓는다. <ol><li> 팔콘 멀티 플라스크 디자인은 선박이 스택을 허용하고 튼튼한 스택 갈비뼈에 의해 장소에서 그들을 보유하고 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 및 시약의 유통 <ol><li> 작업 표면에 평평하게 멀티 플라스크를 삽입 후, 부드럽게 앞뒤로 바위와 사이드 사이드 각 계층에서 액체를 엎지르지 않도록주의를 복용 문화 표면에 균일하게 세포를 배포할 수 있습니다. flasks를 스택. <ol><li> 이 플라스크는 광학 명확 물질로 만들어져 있으며 마지막 레이어에 세포는 쉽게 현미경에서 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 미디어 교환 <ol><li> 기음하는 동안 직면하고있는 로고와 함께 왼쪽으로 기울이기는 멀티 술병 (믹스 포트 쪽). </li><li> 다음 기울기, 오른쪽에있는 멀티 술병, 모든 잔여 미디어를 대기음을 이어갑니다. </li><li> 미디어의 적절한 금액을 추가하고 단계 1.3-1.7을 따르십시오 </li></ol></li></ol> 2.멀티 Flasks에서 수확 세포 <ol><li> 세포 라인까지 멀티 Flasks 수직을 떼어 놓다 및 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 각 하나를 가지고 있습니다. 부드럽게 미디어 멀티 술병의 상단 레이어 배수 수 있도록 같이 목이 그래서 당신이 직면와 flasks로 바꾸란. </li><li> 당신이 믹스 포트 근처에 액체 수준에 도달할 때까지 목을 통해 5 또는 10 ML aspirating 제보를 넣습니다. 지친 매체 기음. </li><li> 분리 시약 / 세척 버퍼를 추가하고 단계 1.2.1에서와 같이 위치를 섞어 가지고 다음, 진행 및 단계 1.3-1.7를 수행합니다. 성장 매체 / 중화 요원과 함께 중화 및 수신 튜브에 세포 현탁액을 잔 또는 세포가 유출되는 등의 휴대용 술병을 바꾸란 상단 선박의 층 및 10 ML의 피펫을 사용하여 세포를 수집합니다. 팁 : 알에서 미디어의 완전한 배수를 허용하기 위해, 셀 또는 시약의 회복을 향상시킬 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 멀티 휴대용 술병을 가지고, 교환을 향해 목이 반전하기 상단 레이어에 내 계층. 멀티 술병이 바뀌 남아 있고 난 후, 기울기 멀티 플라스크는 45 ° 각도 (거리 믹스 포트에서)를 시계 방향으로. 남은 시약를 수집하는 피펫 (10-10 ML)를 사용합니다. </li></ol> 3. 팔콘 멀티 Flasks에서 권장 작업 볼륨 성장 매체 3 층 : 멀티 플라스크 당 75-150 ML 5 층 : 멀티 플라스크 당 125-250 ML 해리 대리인 3 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 15 ML 5 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 25 ML 팁 : 표준 T - 175 flasks에 사용되는 중간 볼륨으로 시작하고 단위 면적 당되는 ML은 동일하게 유지하므로 평가 멀티 술병에 형식을 따라 3 또는 5 배 곱하면됩니다. 4. 대표 결과 : 팔콘 멀티 플라스크 1. 설계 files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/&gt; . 그림 1 : 멀티 플라스크의 세포 배양 혈관은 3에서 사용할 수있는 - 그리고 규모 - 업 각각 525과 875cm이 성장 면적을 제공하는 세포의 5 레이어 스택 형식입니다. 피펫 액세스뿐만 아니라과로와 밖으로 혈관의 세포 및 시약의 제거를 용이하게합니다. 믹스 포트의 존재는 멀티 술병의 모든 레이어에 걸쳐 미디어의 급속한에 - 선박 믹싱 및 균등화를위한 수 있습니다. . 2 세포 수율은 멀티 플라스크를 사용하여 : 이러한 선박 3에 해당하고 T - 175 flasks의 5 배 면적 3 계층과 5 계층 형식으로 사용할 수 있습니다. 따라서, ≥ 3과 5 회 (130 ± 6.8 × 10 6 218 ± 23.6 각각 X 10 6 세포) BHK - 21의 숫자 (아기 햄스터 신장)이 세포가 T - 175에 비해 성장 및 멀티 플라스크로부터 복구되었습니다 flasks (43.2 ± 3.5 X 10 6 세포, Fig.2A). U 당 세포 수율알 표면 면적은 3 동등한되었습니다 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21 T - 175 flasks, LnCAP (인간의 전립선 선암 세포 라인), C 형 간염 - G2 (인간 hepatocarcinoma 세포 라인), EcoPack 2-293 (인간 신장 세포 라인)과 같은 세포 공급 업체 (ATCC, 시그마 및 / 또는 Clontech)에서 권장하는 성장 미디어 (레이어 당 35 ML)에서 48 - 96h 기간 (Fig.2B)에 대한 교양. 전지는 자동 바이올렛 - CELL 카운터 (1)에 열거되었다. <img alt="그림 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg"> 그림 2A : BHK 21 세포의 세 다섯 배 번호가 성장하고 복구되었습니다 3 - 5 - 레이어 멀티 Flasks T - 175 flasks에 비해. 예상 수확량은 컨트롤에서 의미 세포 수율을 사용하여 결정되었다 T - 175 3, 셋, 다섯 번 곱한 flasks - 5 층 멀티 Flasks 각각 (N = 4 flasks / 포맷). <img alt="그림 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg"> 그림 2B : cm 2 당 세포 수율은 3 상응하는어요 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21, LnCAP, HepG2 및 EcoPack2 - 293 세포에 대한 T - 175 flasks. 각 막대는 4-6 flasks의 의미 나타냅니다. BHK - 21 세포 (11,000 cells/cm2) 72 시간, LnCAP 전지 (20,000 cells/cm2)와 EcoPack2 - 293 세포 (~ 35,000 cells/cm2)에 대한 교양 있었다가 96시간 및 HepG2 세포 (25,000 세포 / cm 2 교양되었습니다 )는 48 시간 이전에 수확 교양되었습니다. 멀티 플라스크의 레이어 사이 3. 미디어 분포 세포 배양 매체 (DMEM, Invitrogen)는 5 계층 멀티 Flasks (250 mL/5-layer 용기)에 추가 및 프로토콜은 위에서 설명한에 따라 레이어로 분할되었다. 미디어 배포는 개별 레이어에서 밖으로 펌핑 각 계층 및 미디어에 구멍을 천공하여 측정되었다. 각 계층에서 발견한 액체의 무게는 그림 3과 같이 레이어에서 레이어로 비교적 균일한 것으로 판명되었다. 그들은 다음과 같습니다 : 510.8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (GM). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg"> 그림 3. 5 층 멀티 플라스크의 다섯 가지 레이어의 각 통일 미디어 배포. 세포 배양 매체는 equilibrated 및 개별 레이어로 분할 다중 Flasks (250 ml/5-layer 용기)에 추가되었습니다. 미디어는 개별 레이어와 유체 무게로 뚫고 구멍을 통해 밖으로 펌핑되었다 각 계층 (n은 = 6 flasks)에서 기록되었다. 멀티 플라스크의 층 사이에 4. 세포 분포 셀이 추가되고 멀티 술병 내에서 혼합 수 있습니다. 우리 비즈 (10μm, PolySciences 주식 회사)를 사용하여 다중 플라스크의 층 사이에 세포의 시뮬레이션 배포 세포의 크기와 유사합니다. 비드 정지는 상단 레이어를 통해 10 ML의 피펫을 사용하여 멀티 플라스크 용기로 추가되고 내림차순으로 선박의 미디어 믹스되었다위의 프로토콜 ribed. 비드 배포 비드 서스펜션이 각 레이어에서 밖으로 펌핑되었다 포함된 각각의 레이어와 유체의 드릴링 구멍에 의해 측정되었다. 각 계층에서 발견한 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 읽고 기록했다. 3 계층 멀티 Flasks (Fig.4A)에 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다. 믹스 - 포트 멀티 플라스크 레이어 사이의 세포 및 시약의 균일한 분포를 수 있습니다. <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg"> 그림 4A : 3 층 멀티 플라스크의 세 가지 레이어의 각 비드 분포. (권, 미디어 볼륨 1시 10분입니다 비드 정지 권)는 구슬의 중지 (3.6 X10 6 / ML)은 멀티 Flasks에 적절 중간에 추가되었으며 혼합, 평균 및 설명된 프로토콜을 사용하여 파티션 단계로 따라갔다. 각 계층 (중간 각 레이어에 구멍을 뚫고 펌프)에서 복구 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운트를 읽어되었습니다어 및 기록. 계층 멀티 Flasks (N = 5 flasks) - 3 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다 아래와 같이 보충 성장 미디어에서 3 계층 멀티 Flasks에서&gt; 80 % 합류로 성장 세포의 Ecopack 2-293 얼룩 패턴을 대표하는 이미지가 있습니다. 세포 monolayers는 고정 및 스테인드 크리스탈 바이올렛과 멀티 플라스크 레이어는 다음 잘린 및 이미지 (2) 스캔했습니다. 참고 셀 patterning는 멀티 플라스크 (Fig.4B)의 모든 레이어에 동질적인되었습니다. 비슷한 결과는 여러 세포 유형 (데이터가 표시되지 않음) 평가와 함께 획득했다. <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg"> 그림 4B :이 그림은 다중 Flasks의 층 사이에 균일한 세포 성장을 보여줍니다. 3 계층 멀티 Flasks 및 T - 175에서&gt; 80 % 합류로 성장 Ecopack - 2-293 전지는 고정 및 크리스탈 보라색 묻다되었습니다. 멀티 플라스크 혈관이 절단되었고 각각의 스테인드 계층은 스캔했습니다. 5 멀티 플라스크의 공기 공급. : 96시간을위한 교양 EcoPack2 - 293 세포에서 BioProfile 플렉스 분석기 (3,4)을 (노바 의생명)를 사용하는 동안 미디어의 분석 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks (81.03 속에서 자란 세포의 공기 포화에 차이를 알려주지 않았다 ± 1.9 대 83.4 ± 5.8 % 주변 O 2). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg"> 그림 5 : 동안 미디어의 에어 채도 (% 주변 O 2) 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks에서 미리 혼합 미디어와 유사했다. EcoPack2 - 293 세포는 35,000 세포 / cm 2의 밀도에 씨앗을 품고 사전 미디어 분석 (N = 3 flasks)에 96시간위한 교양되었습니다.

<ol><li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li>
<li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li>
<li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li>
<li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody%E2%80%93fusion+protein+B1%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li>
<li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li>
<li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlaherty%2C+P+%22Tips+and+Techniques+for+enhancing+your+cell+culture%22">Tips and Techniques for enhancing your cell culture</a>. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).</li>
<li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanyal%2C+S+%22Scaling+up+cells+in+BD+Falcon+Cell+Culture+Multi-Flasks%22">Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks</a>. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).</li>
<li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li>
<li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+of+%CE%B21+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li>
</ol>

모든 저자 Becton 디킨슨, Biosciences 세그먼트, 디스커버리 Labware 단위의 직원입니다.

현재 연구는 멀티 술병 디자인 연구자 제공하는 생산성의 증가를 보여줍니다. 멀티 Flasks를 사용할 때 최적의 성능을 위해 위에서 설명한 단계를 수행하는 것이 중요 반면, 가장 중요한 것으로 간주됩니다이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이것은에 파티션 멀티 플라스크 플랫 게시물 누워있는 레이어의 각 (III)에 액체를 분할 후 시계 방향으로 45 °의 각도로 멀티 휴대용 술병을 운반 용기 (2) 이내 믹스 포트를 사용 전지 및 시약의 혼합은 (i) 포함 인큐베이터. 멀티 플라스크의 적절한 사용은 T - 175 flasks (5)에 일치하는 환경에서 양식 각 선박 내에서 균일한 세포 인구의 생산 리드. 이 선박은 T - 175 술병과 비슷한 면적에 3과 5 배 이상 세포를 제공합니다. 3과 5 계층 우주선이 각각 525과 성장 영역의 875cm 2를 제공하고 공간과 노동의 모두를 제공합니다사용자 avings. 조직 문화 표면 처리 따라서 필요없이 스케일 업 가능 표준 flasks 비교 다시 최적화 기존의 문화 조건 또는 품질, 균질성 또는 셀 (6, 7)의 성능을 저하. 이것은 또한 이전에 수집된 데이터 comparability을 위해 제공합니다. 이 선박은 또한 콜라겐과 같은 시약과 코팅 수, 첨부, 성장과 같은 hepatocytes 8, kertainocytes 9, 혈청이없는 미디어 속에서 자란 줄기 세포와 같은 특정 세포 유형의 차별 화를위한 전문 하층을 제공하기 위해 폴리 - D - 라이신, fibronectin 공법. 코팅 솔루션은 이전 culturing 세포에 귀중한 시약의 소모뿐만 아니라 코팅 솔루션의 효과적인 제거를 줄이기 위해 최소한의 잔류 않도록 액체 유지로 제거할 수 있습니다. 레이어 당 25-50 ML로 번역 0.142-0.287 ML / cm 2에서 멀티 flasks 범위의 문화 세포에 권장되는 최적의 미디어 볼륨. 다른 multilayered 플라스크, T 달리그의 제품은 내에서 각 선박의 레이어 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 신속한 수있는 용기에 섞어 포트를 제공합니다. 다양한 세포 라인, 차 문화와 줄기 세포는 멀티 Flasks을 사용하여 효율적으로까지 축소되었습니다. 이 선박은 높은 처리량 - 심사, 백신 생산, 바이러스성 벡터 transfections 및 세포 치료와 같은 세포의 큰 숫자를 요구하는 애플 리케이션에 특히 유리한 있습니다. 시간, 공간, 노동 감소 폐기물 발생의 절감 단일 계층 선박에 종래의 문화 대 멀티 술병의 핵심 위닝 있습니다. 우리 문화 5 수확 세포의 약 세 번 숫자를 수있는, T - 175 3를 사용하여 동일한 공간에 flasks, 5 층 멀티 Flasks. 우주 절약에이 장점은 T - 175에 국한되지뿐만 아니라 다른 선박으로 확장될 수 있습니다 : 일반 실험실 incubators 하우스에 맞는 표준 롤러 병 장치 ~ 4 rol850cm이 표면 영역을 제공하는 각각의 ler 병 (2,200 ML). 같은 영역에서 ~ 20, 5 레이어 다중 Flasks 따라서 문화 전지 다섯 배의 성장 표면을 제공 지내게 될 수 있습니다. 또한, &quot;이동 - 그린 &#39;인식의 증가, 폐기물 생성을 줄이기 위해 옵션이 매우 바람직합니다. 그런 점에있어서, 38 %는 T - 175 flasks 이러한 장점에 비해 멀티 Flasks를 사용하여 폐기물 발생의 감소 리드 (5, T - 175 flasks 한 5 레이어 다중 술병이 ~ 400g 무게 반면에 ~ 640g의 무게)가 있습니다 폐기물 저장 및 처리 비용 및 사용자에게 경제적 절감 결과에 감소합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 세 계층 조직 문화 처리 525cm이 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences의 세포 배양 - BD 팔콘 멀티 Flasks</a> </td></tr><tr><td> 5 층 조직 문화 처리 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,144 </td></tr><tr><td> 100ml 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td> 357,600 </td></tr><tr><td> 10 ML 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td> 357,551 </td></tr><tr><td> 5 ML aspirating 피펫 </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,070 </td></tr><tr><td> T - 175 플라스크 조직 문화 - 대우 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,028 </td></tr><tr><td> 그램 크리스탈 바이올렛 </td><td> BD </td><td> 212,525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> 시그마 </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI - 1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> 가상 </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Lonza </td><td> CC - 5012 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose 인산 국물 </td><td> 시그마 </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK - 21 세포 </td><td> 시그마 </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> C 형 간염 - G2, LnCAP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 비드 </td><td> PolySciences 주식 회사 </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> 바이오 플렉스 프로필 분석기 </td><td> 노바 바이오 메디컬 </td><td></td></tr></tbody></table>

새로운 multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

셀 기반 애플 리케이션의 증가 세포의 큰 숫자가 필요합니다. 세포의 큰 번호가 필요한 경우 소규모 확장하는 동안 적절 한가 단일 레이어 T - flasks의 사용은, 복잡하고 힘드는 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이 요구를 충족시키기 위해, 새로운 다층 세포 배양 용기의 성능이 T - flasks 단일 계층에서 세포 쉽게 규모를 촉진하기이 논의됩니다. T - 175 flasks에 비해 5 - 레이어 형식과 각각의 문화와 완벽하게 세 복구 및 세포의 다섯 번 번호를 사용 - 테스트 flasks 3에서 사용할 수 있습니다. BD 멀티 플라스크의 핵심 기능으로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 각 선박의 레이어 사이 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 일관 환경 거기에 교양 수있는 세포를 만들 수 있도록 신속하게 믹스 / 평균 항구 T - 175 flasks에 합동이다. 이러한 멀티 Flasks의 디자인도 C에 대한 수onvenient 피펫 직접 flasks에 시약과 세포를 추가뿐만 아니라 귀중한 세포 및 시약의 효율적인 복구에 대한 액세스하고 쏟아져에 의한 오염의 위험을 줄여줍니다. 붓는가 pipetting 이상 선호 어플 리케이션 디자인 귀중한 세포 및 시약의 소모를 줄이기 위해만큼 최소한의 잔류 액체 보유를 허용합니다.

세포 연구에 수단과 증가 역할을하며, 발견과 새로운 치료제의 개발. 우리가 첨부 의존 세포를 성장과 수확에 대한 더 효율적이고 효과적인 방법이 필요 세포의 더 많은이 증가 필요성과. 오른쪽 기능을 Multilayered 술병이 목적를 검색할 수 있습니다.

새로운 Multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업

점점 더 많은 세포 기반 응용 분야에서 대량의 세포를 필요로 하고 있습니다. 소규모 단계에서는 적절한 단층 T-플라스크의 사용은...

이 절차의 전반적인 목표는 3층 또는 5층 BD Falcon Multi 플라스크를 사용하여 생산성이 향상된 균질한 세포를 배양하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 플라스크에 배지를 추가하고 세포 현탁액을 접종함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 내용물을 혼합하고 평형화하여 고르게 분산시키는 것입니다.세 번째 단계는 운송 파티션을 나누고 용기를 인큐베이터에 평평하게 배치하는 것입니다. 마지막 단계는 멀티 플라스크에서 배양된 세포를 회수하는 것입니다. 새로운 세포 배양 장치를 사용하기 때문에, 멀티 플라스크의 모든 층에서 균일한 세포 성장이 이루어져 T 1 75 플라스크 대비 최종적으로 3배에서 5배의 세포 수율을 얻을 수 있습니다.취급 단계가 개념화하기 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연을 강력히 권장합니다. 다층 플라스크 세포 배양 용기는 세포의 스케일업을 위해 3층 또는 5층의 적층 가능한 형태로 제공되며, 성장 표면적은 각각 525 및 875 cm²입니다. 피펫 접근이 가능하여 세포와 시약의 용기 내 추가 및 제거가 용이합니다. 혼합 포트의 존재 덕분에 용기 내부에서 빠르게 혼합이 이루어지며 다층 플라스크의 모든 층에 걸쳐 배지가 균일하게 분배됩니다.세포 배양을 위해 멀티 플라스크(multi flask)를 사용하려면, 먼저 멸균된 라미나 플로우 후드(laminar flow hood) 내에 용기를 수직으로 세워 측면으로 놓습니다. 캡 부분이 위를 향하게 한 상태에서, 내용물을 넣기 전 이 상태 그대로 멀티 플라스크에 라벨을 부착하고, 캡을 느슨하게 풀어 제거합니다. 그 다음 50에서 100 milliliter 피펫을 삽입합니다.로고를 즉시 지나쳐 멀티 플라스크에 층당 35 milliliters의 예열된 세포 성장 배지를 직접 추가합니다. 배지에 기포가 생기는 것을 방지하려면 액체 흐름이 멀티 플라스크의 내부 로고 측벽을 따라 들어가게 하십시오. 마지막으로, 10 milliliter 이하의 피펫을 사용합니다.농축 세포 스톡으로부터 실험용 세포 현탁액을 상층부를 통해 배양 배지에 추가하고 플라스크의 캡을 닫습니다. 이는 세포와 배지가 잘 섞이도록 유도하고, 외부에서 대량의 세포 현탁액을 제조해야 하는 번거로움을 없애기 위함입니다. 멀티 플라스크를 들어 로고가 정면을 향하게 수직으로 세운 뒤, 용기를 시계 반대 방향으로 45도 각도로 기울입니다. 그다지 용기를 동일한 각도로 유지합니다.믹스 포트(mix port)를 통해 상층액이 완전히 아래로 빠져나갈 때까지 멀티 플라스크의 입구 부분을 바깥쪽으로 향하게 하여 앞뒤로 부드럽게 기울입니다. 믹스 포트를 중심으로 용기를 회전시키며 이 동작을 반복하여 세포와 배지가 충분히 혼합되도록 합니다. 그 후 멀티 플라스크를 다시 혼합 위치로 되돌립니다.세포 현탁액을 혼합한 후, 모든 층의 액체 부피를 균일하게 맞추기 위해 멀티 플라스크를 평평한 작업 표면에 수직으로 세워 둡니다. 마지막으로 액체를 각 층으로 분할하기 위해, 이전과 같이 로고가 본인을 향하도록 멀티 플라스크를 잡고 용기를 시계 방향으로 45도 각도로 기울입니다.혼합 포트(mixed port)에 액체가 닿지 않도록 주의하십시오. 세포 현탁액의 분할이 완료되면, 배지가 혼합 포트 반대 방향으로 향하도록 멀티 플라스크를 시계 방향으로 45도 기울인 상태를 유지하며 인큐베이터로 운반합니다. 용기를 이 각도로 유지한 채, 혼합 포트 반대편 모서리를 축으로 삼아 로고가 위를 향하도록 멀티 플라스크를 수평으로 천천히 내려 인큐베이터 표면에 놓습니다. 그런 다음 용기를 앞뒤 좌우로 부드럽게 흔들어 세포가 배양 표면에 고르게 분포되도록 합니다.각 층의 액체가 쏟아지지 않도록 주의하며 용기들을 서로 겹쳐 쌓습니다. 인큐베이터에 넣은 후에는, 다른 용기 위에 평평하게 놓을 때 배지가 분리된 상태를 유지하고 혼합 포트와 떨어져 있는지 확인하십시오. 먼저, 로고가 안쪽을 향하도록 멀티 플라스크를 수직으로 잡습니다.그런 다음 5 mL 흡입 팁을 삽입하고 배출된 배지를 비워 흡입을 완료합니다. 플라스크를 안쪽으로 뒤집은 상태에서 반시계 방향으로 45도 기울여 유지하며 최대한의 회수를 위해 흡입을 계속합니다. 용기가 안쪽으로 뒤집힌 상태에서 시계 방향으로 기울여, 해리 전 혼합 포트 반대편 모서리에 남아 있는 잔여 부피를 흡입합니다.필요한 경우, 세포 단층을 PBS로 헹구고 폐기물 용기로 흡입하여 제거합니다. 이제 trypsin EDTA 해리 시약을 첨가하고 용기를 다시 혼합 위치로 가져옵니다. 앞서 시연한 바와 같이 시약이 모든 층에 균일하게 분배되고 안정화된 후, 플라스크를 37 °C에서 원하는 시간 동안 배양합니다.불활성화 시약 내에서 용액을 중화하고 혼합, 평형화 및 분할 단계를 반복한 후, 세포 현탁액을 수집 튜브에 붓습니다. 마지막으로, 멀티 플라스크를 혼합 포트 반대 방향으로 시계 방향으로 45도 각도로 기울입니다. 이때 용기는 뒤집힌 상태를 유지하십시오.피펫을 사용하여 남아 있는 시약을 모두 수거합니다. 세포 농도를 결정하기 위해 세포 계수를 위한 aliquot를 취합니다. 3층 멀티 플라스크에서 성장 배지를 사용할 때는 75~150 mL의 세포 배양 배지 부피를 권장합니다.5층 멀티 플라스크를 사용할 때, 용기당 최대 125에서 250밀리리터를 배양할 수 있습니다. 해리제(dissociation agents)의 경우, 3층 멀티 플라스크에는 15밀리리터 이상을, 5층 용기에는 25밀리리터 이상을 추가할 수 있습니다. 이 막대 그래프에서 나타난 바와 같이, T 175 플라스크와 비교하여 3층 및 5층 멀티 플라스크에서 3배에서 5배 더 많은 baby hamster kidney 세포가 성장하고 회수되었습니다.이 그림에서 baby hamster kidney 세포의 단위 표면적당 세포 수율은 3층 및 5층 멀티 플라스크와 T 1 75 플라스크에서 동일함을 확인할 수 있습니다. 인간 전립선 선암 세포주, 인간 간암 세포주, 그리고 인간 신장 세포주 eco pack 2 2 9 3 모두 이 데이터의 세포 배양을 위해 적절한 성장 배지에서 배양되었습니다.5층 다층 플라스크에 배지를 첨가하고 층별로 분할하였습니다. 앞서 시연한 프로토콜에 따라 각 층에 구멍을 뚫은 후, 각 층의 배지를 펌프로 배출하여 측정하였습니다. 각 층에서 회수된 액체의 무게가 층별로 비교적 일정하게 나타나, 용기 전체에 배지가 균일하게 분포되었음을 확인하였습니다.이 그림의 분할 이후, 세포와 크기가 유사한 비즈를 사용하여 멀티 플라스크 층간의 세포 모의 분포를 수행하였으며, 이는 층당 비즈 수를 계수한 여기 데이터로 입증되었습니다. 혼합 포트를 통해 비즈와 시약이 멀티 플라스크 층 사이에 균일하게 분포될 수 있었습니다. 여기서는 3층 멀티 플라스크에서 80% 이상의 밀집도(confluence)로 배양된 세포의 염색 패턴 대표 이미지를 보여줍니다.보충 성장 배지에서 결정 바이올렛으로 고정 및 염색된 세포 단층이 나타나 있습니다. 멀티 플라스크 층을 절단하여 이미지를 스캔하였습니다. 멀티 플라스크의 모든 층에서 균일한 세포 패턴이 형성되었음을 확인하십시오.이 마지막 그림은 Bio Profile FLEX 분석기를 사용하여 96시간 후 인간 배아 신장 세포 배양물에서 분리한 소모 배지를 분석한 데이터를 보여줍니다. 5층 멀티 플라스크의 각 층에서 분리한 배지와 T 175 플라스크에서 분리한 배지 간의 공기 포화도 차이는 검출되지 않았습니다. 이 영상을 시청한 후, 생산성을 높이기 위해 멀티 플라스크를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

공압 바이오리액터를 사용하여 포유류 세포의 성장을 위한 이 일회용 바이오리액터 시스템의 조립, 작동 및 성능을 시연합니다.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

지속적인 성장 조절 공급을 사용한 영양소 조절은 교반 현탁 생물 반응기에서 배양에 대한 간헐적 배치 공급에 비해 포유류 세포 스페로이드의 성장 속도를 향상시킵니다.  이 연구는 간단한 조정된 비율 공급 배양을 설정하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

설명된 프로토콜을 통해 실험실은 프로그래밍 가능한 액체 처리 로봇과 96웰 플레이트를 사용하여 최소한의 노동력, 경험 및 장비 투자 비용으로 높은 처리량으로 확장 가능하고 접착력이 있는 줄기 세포 배양을 수행할 수 있습니다.  이 시스템에서 20회 이상 통과한 iPSC는 다능성, 정상 핵형을 유지했으며 심근세포로 분화되었습니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

여기에서는 역류 원심분리 시스템을 사용하여 폐쇄형 반자동 방식으로 다층 플라스크에서 부착 세포를 수확하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 기존 단계를 거의 수정하지 않고 다른 세포 확장 플랫폼에서 부착 세포와 현탁 세포를 모두 수확하는 데 적용할 수 있습니다.

폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리

여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.

GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

배우세요 다층 플라스크를 활용한 포유류 세포 배양 스케일 업 방법입니다. 균일한 세포 증식과 3-5배 높은 수율을 달성하여 생명공학 연구의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

새로운 Multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업

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