microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

안녕하세요, 저는 저지입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Shabi이고 저희 둘 다 런던 임페리얼 칼리지의 박사후 연구원으로 Andrew Di Melo 교수 및 Josh Del 박사와 함께 미세유체 액적 플랫폼에서 일하고 있습니다. 더 높은 처리량 실험을 위한 유망한 후보를 약속하는 액적 근거한 microfluidic 플랫폼은 아주 높은 정확하게 정의한 양 및 그들의 경쟁에 생성될 수 있기 때문에, 생성 빈도는 수 킬로 pers 처럼 높을 수 있습니다.

또한 관심 영역을 몇 리터 정도의 격실로 캡슐화할 수 있기 때문에 누화와 분산을 모두 제거할 수 있으며 분석 프로세스의 시간을 더 정확하게 맞출 수 있습니다. 우리 그룹에서는 이미 많은 응용 분야에 마이크로 액적 플랫폼을 성공적으로 구현했습니다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응, 나노 입자 합성 및 단일 분자 세포 분석이 있습니다.

이러한 시스템 내에서 생성되는 방대한 양의 정보는 효율적으로 추출, 활용 및 활용되어야 합니다. 이와 관련하여, 선택의 검출 방법은 옳아야 하고, 검출의 높은 감도 및 낮은 한계를 제공해야 하고, 분자 종의 범위에 적용 가능해야 하고, 비파괴적이어야 하고, 손쉬운 방식으로 microfluidic 장치와 통합될 수 있어야 합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 당사는 소량의 환경에서 대량의 물리적 정보를 추출할 수 있고 광범위한 물리적, 화학적, 생물학적 입자 분석에 적용할 수 있는 일련의 실험 도구 및 프로토콜을 개발했습니다.

이 프로토콜에서는 Dropbox에서 단일 세포를 감지하고 혼합 프로세스를 매핑하는 데 적용되는 방법을 제시 할 것입니다. 미세유체 칩은 전통적으로 포토리소그래피 방법을 사용하여 폴리 디메틸 Sloane PGMS로 제작됩니다. 이 과정은 용매를 증발시키고 냉각 후 필름을 조밀화하기 위해 65도 및 95 도의 핫 플레이트에서 실리콘 웨이퍼 소프트 베이크에 미세 유체 채널 Spinco, SU 8 50을 얻기 위해 클린 룸 시설에서 수행되어야하며, SU 8을 노출시키고 적절한 마스크 하에서 UV 방사선으로 저항합니다. 그런 다음 냉각 후 65도와 95도에서 웨이퍼를 굽습니다.

교반하는 동안 적절한 현상 용액을 사용하여 노출되지 않은 영역을 개발합니다. 새로운 EC 솔벤트를 사용하여 웨이퍼를 헹군 다음 가스로 건조시켜 깨끗한 표면을 생성합니다. 웨이퍼를 헥산과 메탄올 세척제로 처리합니다.

또한 esate 마스터 제작 공정을 완료하려면 40분 동안 건조제에서 표면에 압착제를 증발시킵니다. 구조화된 미세유체 기질을 형성하기 위해 S 가드 1 8 4를 10:1 비율의 수지 가교제로 혼합하고 이를 마스터 위로 당깁니다. 이것을 건조제에서 가스를 제거하고 65도에서 장치를 경화시킵니다.

경화된 PDMS를 잘라 마스터에서 떼어냅니다. 생검 펀치를 사용하여 유체 튜브를 위한 접근 구멍을 만듭니다. 65도에서 20분 동안 PDMS의 다른 층을 경화시킵니다.

준비한 상층을 최하층에 놓고 65도에서 하룻밤 숙성합니다. 페트리 접시에서 칩을 벗기고 깍둑썰기합니다. 칩이 제작되면 관심 있는 솔루션을 주입하여 사용할 준비가 된 것입니다.

주사기에 필요한 용액을 채워 튜브의 어떤 부분에도 기포가 남아 있지 않도록 합니다. 액적 생성의 경우 두 단계가 사용됩니다. 수성 분산상에는 관심 시약이 포함되어 있습니다.

오일 상은 주사기 바늘 끝의 한쪽 끝에서 바늘 팁과 동일한 내부 직경의 연속 위상 맞춤 튜브로 작용하여 주사기 펌프에 주사기를 장착하고 원하는 주입 유속을 정의합니다. 각 단계에 대해 불안정한 액적 형성으로 이어질 수 있는 수성상에 의한 PDMS의 습윤을 방지하기 위해 오일 수성 유속의 최소 비율이 1로 권장됩니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 PDMS 기판에 펀칭된 구멍에 직접 연결합니다.

더 복잡한 솔루션의 경우 실리카, 모세관 포트 또는 커넥터도 구현할 수 있습니다. 칩의 배출 포트를 튜브에 연결하고 폐기물 수집 또는 추가 분석 처리를 위해 수집기에 직접 연결합니다. 이것이 설정되면 액적 흐름 포커싱을 생성하기 위한 마이크로 채널의 두 가지 주요 구성 또는 두 개의 허용 가능한 유체를 함께 가져오기 위해 이러한 형상을 사용하여 발생하는 순전한 힘과 계면에서 발생하는 후속 모세관 인으로 인해 발생하는 T 접합 형식의 두 가지 주요 구성이 있습니다.

몇 펨톨리터 정도의 작은 방울이 자발적으로 생성됩니다. 액적이 생성되면 광학 설정을 사용하여 프로빙할 수 있습니다. 광학 시스템은 다음 프로토콜로 설정됩니다.

자동화된 서브미크론 포지셔닝 용량을 갖춘 컨포칼 현미경과 관련된 Fluor falls의 흡수와 일치하는 파장에서 작동하는 레이저를 사용하십시오. 그들을 흥분시키려면 형광 수명 이미징을 위해 수 메가헤르츠의 반복 속도로 작동하는 펄스 레이저를 사용하십시오. 가래 실험은 빔 스티어링 미러와 광학 장치를 사용하여 빔 높이와 빔 방향을 제어합니다.

이색성 거울을 사용하여 레이저 빔을 대물 렌즈에 반사합니다. 두 개의 레이저를 동시에 사용하는 경우 듀얼 밴드 diic mirror를 설치할 수 있습니다. 두 레이저 빔의 반사를 허용하려면 무한 보정된 높은 개구수 NA 현미경 대물렌즈를 사용하여 레이저 광을 미세유체 채널 내에서 밀접한 초점으로 가져옵니다.

동일한 높은 NA 대물렌즈를 사용하고 동일한 이색성 거울을 통해 전송되는 미세유체 채널 내에서 샘플에서 방출되는 형광을 수집합니다. 단일 또는 이중 대역 방출 필터를 사용하여 잔류 여기광을 제거합니다. 형광 방출을 75마이크로미터 핀홀에 집중시킵니다.

plano 볼록 렌즈 사용. 현미경 대물렌즈의 공초점면에 핀홀을 배치합니다. 다른 이색성 거울을 사용하여 형광 신호를 두 개의 검출기로 분할합니다.

이색성 거울에 의해 반사된 형광을 방출 필터로 필터링하고 plaino 볼록 렌즈로 첫 번째 검출기에 초점을 맞춥니다. 2차 적색 형광과 관련된 실험의 경우 diic mirror에서 투과된 형광을 다른 방출 필터로 필터링한 다음 다른 plano 볼록 렌즈로 두 번째 검출기에 초점을 맞춥니다. 형광 광자를 검출하기 위해 avalanche photo diodes를 사용하십시오.

형광 데이터 수집을 위해 애벌런치 포토 다이오드 검출기의 전자 신호를 다기능 DAQ 디바이스에 연결하여 PC에서 실행되는 데이터 로깅을 수행합니다. 가래 실험의 경우 펄스 레이저를 사용하고 검출기를 별도의 PC에서 실행되는 시간 상관 단일 광자 계수 TCS PC 카드에 연결합니다. 이 카드를 사용하면 형광 수명 데이터를 얻을 수 있습니다.

TCS PC 방법론 사용. 감지된 각 형광 광자는 입사 레이저 펄스와 상관관계가 있으므로 방출된 각 형광 광자에는 지연 시간이 할당됩니다. 이 데이터는 단일 또는 다중 지수 감쇠 곡선에 맞게 형광단 복사 속도의 추정치를 얻을 수 있습니다.

이제 우리는 세포가 생물학적, 물리적, 화학적 관점에서 매우 이질적이라는 것을 알고 있습니다. 따라서 이상적으로는 한 번에 각 세포를 분석해야 합니다. 그러나 신뢰할 수 있고 의미 있는 결론에 도달하기에 충분한 정량적 정보를 수집할 수 있도록 더 높은 처리량으로 분석을 수행해야 합니다.

여기에 대장균 세포를 단일 액적에 캡슐화하는 예가 있으므로 그대로 수행할 수 있습니다. 하룻밤 동안 배양된 대장균 top 10 균주를 사용합니다. 세포의 생존 능력을 감지하려면 cyto nine과 propidium iodide를 사용하십시오.

두 염료 모두 DNA 간 대조 염료이며 형광 강도는 20배 이상 증가합니다. DNA에 결합하면 cyto nine은 막 투과성 및 프로피듐 요오드화물인 녹색 형광 염료입니다. 이것은 붉은 형광 염료로, 막이 투과되지 않습니다.

따라서 살아있는 세포는 녹색으로 형광을 발하는 반면 죽은 세포는 녹색과 적색 방출을 모두 나타냅니다. 여기서 우리는 액적 생성과 T 접합을 사용한 단일 세포 캡슐화를 볼 수 있습니다. 이 비디오는 고속 카메라로 녹화되었지만 초당 수천 개의 속도로 비말이 생성될 수 있습니다.

세포를 캡슐화할 때는 세포의 배양이 희석되어 생성된 물방울보다 세포의 수가 적고, 주사기 또는 튜브에서 발생할 수 있는 세포가 침전되는 것을 방지해야 합니다. 주사기 내부의 마그네틱 교반 막대를 사용하여 용액에 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 50마이크로미터의 매우 얇은 튜브를 사용하여 주사기를 마이크로칩에 연결합니다.

이것은 튜브 내부의 빠른 유속을 보장하여 세포가 침전되는 것을 방지합니다. 다음은 세포 기반 실험을 위한 시간 함수로서의 사진 개수의 일반적인 예입니다. 액적 내에서 혼합 과정을 매핑합니다.

액적은 수명이 다른 두 개의 서로 다른 플루오로 4를 사용하여 생성할 수 있습니다. 흐르는 액적 내에서 유동장이 생성되며, 이는 결국 원래 분리된 두 용액을 혼합하여 혼합 공정을 향상시킵니다. 유동장의 대칭은 권선 채널을 사용하여 변경할 수 있습니다.

액적을 조사하려면 채널의 한쪽에서 시작하여 물방울이 흐르는 마이크로 채널 높이의 절반에 광학 프로브 볼륨을 집중시키고 채널의 전체 너비를 따라 각 실험을 수행합니다. 1마이크로미터 간격으로. 오일 상의 노이즈 배경에서 액적과 관련된 단일 버스트를 구별하고 각 버스트의 지속 시간을 설정하는 알고리즘을 구현합니다.

두 번째 알고리즘을 구현하여 실험이 수행된 특정 너비에서 각 액적의 길이를 따라 지연 시간 및 강도 값을 추출합니다. 그런 다음 최대우도 추정기 MLE 알고리즘을 사용하여 실험에서 각 액적의 형광 수명을 평가합니다. 실험에서 모든 액적의 수명 값을 평균화하면 MLE 계산의 최종 오류가 줄어듭니다.

더 많은 액적을 조사할수록 수명 궤적을 얻은 후 오류가 작아집니다. 각 너비에 대해 2D 맵의 모든 궤적을 결합합니다. 각 수명 값은 두 개의 플로라 4의 특정 혼합물과 연관되어 있기 때문에 농도 또는 혼합 맵을 얻을 수 있습니다.

우리는 마이크로 장치의 제작과 미세 액적 형성 및 영역 캡슐화 및 프로세스, 액적의 광학 감지를 위한 실험 설정 및 관련 프로토콜에 대해 설명했습니다. 두 가지 예는 액적에서 단일 세포에 대한 검출과 혼합 과정의 매핑을 선택했습니다. 흐르는 액적 내부는 현재 액적 미세유체역학(microfluidics)으로 조사되고 있는 일반적인 응용 분야를 나타냅니다.

제시된 실험에서 알 수 있듯이 액적 미세유체 플랫폼의 사용은 높은 처리량, 완벽한 감금 및 높은 재현성과 같은 특정 매력적인 특성을 나타냅니다. 생성되는 많은 양의 정보와 이 정보가 생성되는 가장 빠른 속도입니다. DU는 이 소형화된 플랫폼에서 최대한의 이점을 얻기 위해 가장 높은 공간 시간 해상도를 가진 빠른 감지 방법을 사용해야 했습니다.

이 경우, 우리는 매우 정밀한 형광 분광 기술을 사용하여 이것이 가능하다는 것을 보여줍니다.