Name: Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 격리된 쥐 장간막 수집 림프관에서 세포질 칼슘 농도와 수축 활성을 측정하는 방법을. Fura-2 AM 비율 측정 영상법을 사용하여 내강 압력 변화에 따른 림프관 평활근의 칼슘 신호와 수축 패턴 간의 시간적 관계를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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<p class="jove_content"&gt;이 작품은 NIH 부여 P20RR018766 및 알코올 연구 ABMRF / 재단의 교부금에 의해 지원되었다.</p

<ol><li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+system%3A+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).</li>
<li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+biology+and+the+microcirculation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li>
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<li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li>
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<li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity%3A+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li>
<li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II%3A+modulated+by+G+proteins%2C+kinases%2C+and+myosin+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat.+Res.+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li>
<li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li>
<li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li>
<li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2%2B+concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법의 소설 조합은 림프 혈관의 펌핑 본질을 연구하기 위해 고용되었다. 동시에 변화 측정 기능 [칼슘 2 +] i와 펌핑 lymphatics의 직경은 칼슘 2의 상대적인 기여도 + 종속 및 CA 2 림프 수축성주기를 지배하는 전체 메커니즘에 + - sensitizing 신호 경로. 연구를 허용합니다 림프 수축성주기 톤 이상 겹쳐 phasic 수축으로 구성되어 있습니다. 데이터는 각 phasic 수축이 + pacemaking 메커니즘에 칼슘이의 중심 역할을 제안, [칼슘 2 +] 나는에 과도 증가와 관련된 것을 보여, 그리고 칼슘 2의 주파수 + 과도는 luminal 압력의 변화에 민감 . 우리의 데이터는 또한 압력 급속한 증가는 기저의 꾸준한 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. 닮은 5 배 증권 </td></tr><tr><td 화학 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 35g </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> JT 베이커 </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 시그마 </td><td> C - 3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> 마그네슘 황산 </td><td> 시그마 </td><td> M - 9397 </td><td> 1.44 g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td> 4 autoclaved 병 및 상점으로 살균 필터 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. 맙스 버퍼 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 회사 </TD&gt; <td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 맙스 </td><td> 시그마 </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td> 4 autoclaved 병 및 상점으로 살균 필터 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. 알부민 생리 식염수 (APSS) </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 닮은 주식 (5 배) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 맙스 버퍼 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S - 9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> 시그마 </td><td> P5280 </td><td> 0.22 g </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 샐티 </td><td> 시그마 </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td> 0.901 g </td></tr><tr><td> 알부민, 소의 </td><td> USB </td><td> 10,856 </td><td> 10g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td> 37 7.4로 산도를 조절 ° C, 4 autoclaved 병 및 저장에 다음 살균 필터 ° C. </td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약이 사용됩니다. 4 시에 보관 ° C.

cytosolic ca의 측정 2 + 절연 수축성 lymphatics에

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

림프 혈관은 액체 항상성 유지 중앙 순환에 lipids를 제공하고, 잠재적으로 해로운 항원에 대한 감시 시스템 역할, 점막 면역과 적응 면역 반응 1 최적화 다기능 교통 시스템을 구성. 림프는 맹인 종단 초기 lymphatics를 입력하고, 다음 큰 수집 lymphatics에서 압력 구배에 대한 수송이다 중간 유체로부터 형성됩니다. 각 수집 림프는 역류를 방지 뾰족한 끝이 둘있는 밸브로 구분 lymphangions라는 세그먼트의 일련의 구성됩니다. 각 lymphangion는 중앙 혈액 순환이 방향 압력 구배에 대한 림프을 향한 추진력을 얻습니다 수축성 사이클을 가지고 있습니다. 이 phasic 수축성 패턴은 수축기 및 diastolic 단계와 심장주기에 유사하고, 낮은 수축 주파수 4. 또한, 림프 평활근은 음색을 생성하고 myogenic 수축과 팽창을 표시 I각각 luminal 압력 증가와 감소, 5 N 응답. lymphatics의 phasic와 토닉 수축성을 모두 지원하는 분자 메커니즘의 하이브리드 따라서 제안하고 있습니다. 평활근의 수축은 일반적으로 cytosolic 칼슘 2 + 농도 규제 ([칼슘 2 +] I) 칼슘 2 플러스 감성 +, 세포 6 주변 환경의 변화에 대한 응답으로 수축성 요소. [칼슘 2 +] 제가 + 플라즈마 막 리간드 또는 전압 문이 칼슘 2 + 채널과 + 내부 상점에서 칼슘 2의 릴리스와 이해를 통해 칼슘 2의 운동의 조합에 의해 결정됩니다. Cytosolic 칼슘 2 + calmodulin에 바인딩 및 마이 오신 조명 체인으로 효소를 활성화 (MLC) 차례로 MLC는 굴지 - 마이 오신 - 중재 수축 8 선도 phosphorylates 키나제 (MLCK). 그러나, 칼슘이 경로의 감도 <sup&gt; 2 +는 MLC 인산 가수 분해 효소 (MLCP) 9 조정할 수 있습니다. MLCP 활동 Rho 키나제 (바위)과 마이 오신의 인산 가수 분해 효소 억제제 단백질 CPI - 17에 의해 규제됩니다. 여기, 우리는 칼슘 2 + - 의존과 칼슘이 림프 평활근의 수축의 + - sensitizing 메커니즘을 연구하기 위해 절연, perfused lymphatics에서 시간이 지남에 따라 [+ 칼슘 2] 나는 변화를 평가하는 방법을 제시한다. 절연 쥐 mesenteric 수집 lymphatics를 사용하여 우리는 [+ 칼슘 2] I 및 수축성 활동에 스트레칭 유발 변화를 공부했습니다. 격리된 림프 모델은 압력, 유량 및 욕조 솔루션의 화학 성분이 밀접하게 제어할 수있는 장점을 제공합니다. [칼슘 2 +] 제가 ratiometric, CA 2 + 바인딩 염색 Fura - 2 lymphatics 로딩에 의해 결정되었다. 이러한 연구는 phasic 조절 다른 분자 메커니즘을 연구의 광범위한 문제에 대한 새로운 접근 방법을 제공합니다림프 평활근의 수축 토닉 대 수축.

우리는 cytosolic CA를 평가하는 접근 방법을 소개합니다<sup&gt; 2 +</supCA를 공부 격리 lymphatics에&gt; 집중<sup&gt; 2 +</sup&gt; 종속 및 CA<sup&gt; 2 +</sup림프 평활근의 수축&gt; - sensitizing 메커니즘.

Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에

림프관은 체액 항상성을 유지하고, 지질을 중앙 순환계로 전달하며, ...로서 작용하는 다기능 운송 시스템을 구성합니다.

본 실험 시스템은 세포 내 칼슘의 변화가 루멘 압력 상승으로 인해 발생하는 림프관 수축 패턴의 변화와 관련이 있는지 확인합니다. 먼저 쥐의 장간막에서 수축성 림프관을 절제하고, 루멘 압력을 정밀하게 제어하기 위해 양 끝을 캐뉼라로 삽입합니다. 다음으로, 340nm와 380nm의 교대 여기를 이용한 형광 현미경으로 세포질 칼슘 변화 측정이 가능한 비례 측정용 칼슘 감지 염료인 fura-2 AM을 혈관에 로딩합니다.림프관에 내강 압력을 가하는 동안 림프관 직경의 변화와 세포질 칼슘 농도를 기록합니다. 단계별 프로토콜을 통해 획득한 타임랩스 이미지로부터 림프관 직경을 결정합니다. 결과는 세포질 칼슘의 일시적 증가와 림프관의 위상성 수축 사이의 시간적 관계, 그리고 칼슘 농도와 근원성 수축 사이의 상관관계를 나타냅니다.생체 내 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 염증 속도, 신경성 및 엔드린 조절, 내강 압력 및 흐름을 포함하여 림프 펌핑에 미치는 외적 영향을 완전히 제어할 수 있다는 점이며, 이를 통해 림프 수축 주기를 결정하는 신호 전달 경로를 정밀하게 연구할 수 있다는 것입니다. 분리 및 캐뉼라 삽입 단계는 습득하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 림프관은 매우 섬세하여 조작이 미숙할 경우 수축 기능을 상실할 수 있습니다.절연된 용기 챔버에 내성 매칭 마이크로 피펫을 장착합니다. 챔버와 마이크로 피펫에 시스템 내에 기포가 생기지 않도록 주의하며 알부민 생리적 분류 용액(albumin physiological sort solution, A PSS)을 채웁니다. 그런 다음 안과용 봉합사로 오버핸드 매듭을 만들어 각 마이크로 피펫에 하나씩 배치합니다.이제 케타민을 근육 내 주사하여 동물을 마취합니다. 자일라진을 투여한 후, 70% 알코올로 복부 부위를 소독하고 정중선 개복술을 시행하여 소장과 장간막을 외부로 노출시켜 적출합니다. 적출한 조직을 얼음처럼 차가운 상태로 보관하십시오.실체 현미경 하에서 얼음처럼 차가운 A PSS로 채워진 해부 챔버 내에 장간막의 일부를 핀으로 고정합니다. 전체 분절에서 최적의 압력 제어를 보장하기 위해 밸브가 하나만 있는 혈관을 선택하십시오. 주변 지방 및 결합 조직으로부터 수집 림프관을 조심스럽게 박리합니다.이제 림프 샘플을 A PSS가 들어 있는 준비된 혈관 챔버로 옮깁니다. 안과용 봉합사로 묶어 혈관을 저항이 일치하는 두 개의

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

뮤린 좌심실 유두근는 체외에서 심근 수축력을 조사하는데 사용될 수있다. 이 문서 자세히 분리 실험 프로토콜 심장 수축 특성을 연구에 대해 설명합니다.

마우스의 심장 수축력의 조사에 대 한 격리 유두 근육의 수축력 측정

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

이 논문은 쥐의 심장에서 분리된 심장 근세포에서 수축하는 동안 myofilament Ca2+ 감도의 변화를 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장 전기생리학, 수축기/이완기 세포질 Ca2+ 수치 및 수축/이완과 함께 이 측정은 건강한 심장과 질병이 있는 심장에서 심장 흥분-수축 결합을 매개하는 메커니즘을 뒷받침하는 데 필수적입니다.

Myofilament 칼슘의 평가<sup&gt; 2 +</sup&gt; 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

이 프로토콜은 수축하는 림프관에서 세포질, 유리 칼슘[Ca2+]i 및 혈관 직경을 동시에 측정한 다음 절대 Ca2+ 농도와 수축성/리듬 매개변수를 계산하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 조건에서 Ca2+ 및 수축 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ 및 해당 수축성의 실시간 평가

배우세요 격리된 쥐 장간막 수집 림프관에서 세포질 칼슘 농도와 수축 활성을 측정하는 방법을. Fura-2 AM 비율 측정 영상법을 사용하여 내강 압력 변화에 따른 림프관 평활근의 칼슘 신호와 수축 패턴 간의 시간적 관계를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

Cytosolic CA의 측정^{2 +} 절연 수축성 Lymphatics에

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