Name: 파킨슨병의 Neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: 배우세요 MALDI 이미징 질량 분광법을 이용하여 파킨슨병 L-DOPA 치료 부작용인 운동이상증과 관련된 쥐 뇌의 신경펩티드 변화를 검출하는 방법을. 이 기술은 높은 분자 특이성을 유지하며 치료 유발 변화의 공간적 분포를 규명합니다.

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우리는 소중한 의견을위한 그림 3과 교수 요나 Bergquist에 대한 데이터를 기여한 한나 워너 감사드립니다. 스웨덴 연구 협의회 (부여 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA), 아케 Wiberg의 재단 (MA, JH), 과학 로얄 스웨덴어 아카데미 (MA, JH), 그리고 스웨덴의 화학 사회 (JH)가 기꺼이 재정적인 지원을 인정한다.

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

neuropeptides의 연구에 든 이미징 질량 분광법을 고용의 몇 가지 장점이 있습니다. MS 데이터의 편견 분석은 특정 뇌 핵을 표시하거나 같은 striatum의 단지 dorsolateral 부분은 특정 pathophysiological 조건과 연결된 곳이 여기 제시된 결과에 있습니다. 공간 정보를 유지함으로써 그것은 전체 뇌 부분의 분석 또는 펩타이드 추출물에서 전통 peptidomics 연구를 사용 비해 높은 감도와 낮은 다양성과 통계적 분석을 수행하기 위해 관심 영역을 재정의하는 데 후 가능합니다. 또한, 그것은 든 IMS는 즉시 이전에 알려지지 않은 사후 translational 수정을 감지할 수 실현하는 것이 중요하지만, 구조적 분석은 수정되어 정확한 아미노산 위치를 결정하기 위해 따라야합니다. 든 IMS 데이터를 시각화의 일반적인 함정은 BL에서 선형 광학 규모로 최대 피크 강도를 매핑 포함대신 100 % 모든 부분의 최대 피크 강도가 어디 흔한 절대 규모에 대한 모든 부분을 매핑의 실험 시리즈의 각각의 섹션에서 (그림 3)에 대한 컬러 (100 %)까지 (0 %) 응답 (그림 5) . 후자의 방법은 그룹 데이터 및 치료 그룹 사이의 차이의 시각화의 비교를 허용합니다. 든 IMS 분석의 주요 장애물은 특정 질량 봉우리에 펩티드의 과제입니다. 온 조직 탠덤 - 질량 분광법 때로는 가능하지만 종종 13,14 꽤 어려움이 증명한다. 우리는 반대 위상 LC-MS/MS 뒤에는 강력한 양이온 교환 크로마 토그래피, 대한 예비 분별 (분리)를 포함하여 더 전통적인 접근 방식이 성공적으로 시퀀스 많은 neuropeptides 특히 opioid 펩티드하는 데 사용할 수있는 것을 발견했습니다. 그것은 같은 마스코트와 같은 일반적인 검색 엔진을 사용하여 모든 데이터베이스 항목이 일치하지 않는 양질의 MS / MS 스펙트럼을 얻기 위해 여전히 흔치 않습니다. 이러한 경우에는 손으로 드 노보-시퀀싱은 onl입니다Y 옵션도 있습니다. 피크 정체성의 궁극적인 증명은 적절한 녹아웃 마우스에서 조직 섹션 든 IMS에 의해 얻을 수있다, 그러나 이것은 항상 사용할거나 불가능합니다. 대안은 서구 immunoblotting이나 immunohistochemistry에 의해 예를 들어, 정반대로 다른 방법으로 결과를 확인하는 것입니다. 이것은 종종 항체 및 신규 항체를 확인하는 작업을 상당히 높이는 포함될 수 있습니다. 이 프로토콜에 제시된 일반적인 전략은 몇 가지 섹션 및 실험 조건을 포함한 대규모 neuropeptide 든 IMS 실험에 최적화되어 있습니다. 메커니즘 밑에있는 고통과 중독의 약물에 대한 내생적인 반응을 포함하여 연구의 다양한 분야에서 취업으로 프로토콜은 특히 opioid 펩티드에 최적화되었으며, 향후 연구에 큰 영향을 미칠 것이다.

1.1 샘플 수집 및 준비 <ol><li> Isoflurane (Apoteksbolaget AB, 스웨덴) </li><li> 수술 도구, 가위의 두 켤레 rongeur, 주걱 </li><li> 잘게 깔린 드라이 아이스 </li><li> 알루미늄 호일 및 저장을위한 비닐 봉지 </li><li> 그라 이오 스탯 (Microm, 하이 델베르크, 독일) </li><li> 인듐 - 주석 산화물 (ITO) 코팅 든 슬라이드 (Bruker Daltonics, 독일) </li><li> 최적의 절삭 온도 매체 (-10 월) (사쿠라 Finetek 유럽, 네덜란드) </li><li> 진공 dessicator </li></ol> 1.2 매트릭스 응용 <ol><li> 의 Acetonitrile (ACN), 메탄올 (MeOH), 에탄올 (EtOH) 프로 분석 학년 (머크, 독일). </li><li> Trifluoroacetic 산성 (TFA) (시그마 알드리치, 세인트 루이스, 미주리). </li><li> 물이 밀리 Q 정화 시스템 (Millipore, 베드 포드, MA)로 정화되었다. </li><li> 칩-1000 (Shimadzu, 일본) 또는 세로 630 망보고 (LabCyte, 서니 베일, 캘리포니아) </li></ol> 1.3 질량 분광법 <ol><li> ULtraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging 소프트웨어 (V 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> 펩타이드 또는 단백질 보정 표준 (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 데이터 처리 <ol><li> 기원 v.8.1 (OriginLab 사, Norhampton, MA) </li><li> Matlab 버전 7.9.0.529 (MathWorks, Natic​​k, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 Neuropeptide 식별 <ol><li> 초음파 sonicator </li><li> 10 kDa 분자량 차단 필터 (Millipore, 베드 포드, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 겔 (시그마, 독일) </li><li> Hypersil 칼럼 (ThermoFisher) </li><li> 피리딘, 프로 분석 등급 개미의 산 (FA), Acetonitrile (ACN), 메탄올 (MeOH), 에탄올 (EtOH) (머크, 독일). </li><li> Trifluoroacetic 산성 (TFA) 시그마 알드리치 (세인트 루이스, 미주리, 미국). </li><li> 애질런트 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 컬럼 (0.075x150mm) </li><li> 애질런트 1100 마이크로 fractioncollector, Prespotted anchorchip 대상 플레​​이트 (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools 소프트웨어 (V 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> 바이오 작품 소프트웨어 (v.3.3, 써모 피셔, <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> 마스코트 소프트웨어 (V 2.2 MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep 데이터베이스 ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

파킨슨병의 neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

든 이미징 질량 분석법 (IMS)은 생물 학적 조직 샘플 2 (Fig.1)의 분자 종의 공간적 분석을 용이하게하는 강력한 방법이다. 12 μm의 얇은 조직 섹션은 일반적으로 든 TOF / TOF 질량 분석기를 사용하여 질량 분석기로 감지할 수 온전 펩티드와 단백질의 탈착 및 이온화를 촉진 든 행렬로 덮여 있습니다. 일반적으로 피크 수백은 단일 쥐의 뇌 조직 섹션에서 평가 할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 영상 기술 달리, 이러한 방식은 관심 분자의 사전 지식을 필요로하지 않습니다 높은 분자 특이성과 감도 2를 유지하면서 여러 분자 종 혼자 가잖아하고 종합적인 분석을 허용합니다. 여기에서 우리는 동물 모델 파킨슨병 (PD)의 쥐의 두뇌에 neuropeptides의 특정 지역과 관련된 유통 프로필을 elucidating위한 든 IMS 기반의 접근 방식을 설명합니다. PD 나이 3,4 65 명 이상 1 %의 유행과 함께 일반적인 neurodegenerative 질병입니다. 가장 일반적인 증상 치료는 L-DOPA 5를 사용 도파민 교체에 따라 달라집니다. 그러나 이것은 L-DOPA 유발 dyskinesias (뚜껑) 1,3,6 되나 불수의 이상 운동을 포함한 심각한 부작용이 동반된다. 뚜껑에서 가장 두드러진 분자 변화 중 하나는 opioid 전구체 prodynorphin의 mRNA 7 upregulation이다. dynorphin의 펩티드는 본질적으로 운동 제어 7,8에 관련된 뇌 영역에서 neurotransmission 보죠. 그러나, neuropeptide 전구체의 처리에서 발생한 정확한 opioid 펩티드의 연대를 특징되지 않았습니다. 따라서, 우리는 실험 파킨슨병 및 L-DOPA 유도 운동 이상증의 동물 모델에서 든 IMS를 활용. 든 이미징 질량 분광법은 neuropeptide characteriza에 관하여 특히 유리한 것으로 판명기, 일반적으로 사용되는 항체 기반의 접근 방식부터 알려진 펩타이드 시퀀스와 이전에 관찰 포스트 translational 수정을 대상으로하고 있습니다. 반대로 든 IMS는 새로운 펩타이드 가공 제품을 해명하기 때문에의 연결을 전송 neuropeptide 변조의 새로운 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. neuropeptides의 절대 액수가 든 IMS에 의해 결정될 수 없지만 펩타이드 이온의 상대적인 풍요로움은 건강과 질병의 레벨 변경에 대한 통찰력을 제공, 대량 스펙트럼에서 delineated 수 있습니다. 여기에 제시된 예제에서는 dynorphin B, 알파 neoendorphin과 물질 P의 정상 농도는 크게 dorsolateral 증가된다는 것을 발견했다지만, 심한 운동 이상증과 동물의 dorsomedial, striatum는 (그림 얼굴, 몸통과 orolingual 근육을 포함하지 5). 또한, 든 IMS는 기능성 inacti의 이전에 알려지지 않은 메커니즘을 대표하는, 운동 이상증의 심각도 및 DES-티로신 알파 neoendorphin 수준 간의 상관 관계를 밝혀N-터미널 티로신의 제거 등 striatum에서 dynorphins의 vation는 dynorphin의 opioid - 수용체 결합 능력 9를 줄여줍니다. 이 든 IMS와 결과가 생물 의학 연구의 모든 분야에 응용 프로그램에 대한 기술의 잠재력을 강조를 사용하여 뚜껑의 neuropeptide 특성에 관한 최초의 연구이다.

L-DOPA를 사용하여 도파민 대체 약물은 파킨슨병에서 가장 일반적으로 사용되는 증상을 치료하지만, 불수의 이상 운동, 되나 운동 이상증을 포함한 부작용이 동반된다<sup&gt; 1</sup&gt;. 여기서 든 이미징 질량 분석법을위한 프로토콜은 운동 이상증과 관련된 쥐의 두뇌 neuropeptide 수준의 변화를 감지하여 그 제공됩니다.

파킨슨병의 Neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법

MALDI 이미징 질량 분석법(IMS)은 생물학적 조직 시료 내 분자 종의 공간적 분석을 용이하게 하는 강력한 접근 방식입니다2 ...

이 절차의 주요 목적은 매트릭스 보조 이미징 질량 분석법을 사용하여 얇은 뇌 절편에서 뉴로펩타이드, 특히 오피오이드 펩타이드의 공간적 분포를 직접 규명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 급속 냉동된 쥐 뇌의 12 µm 두께 조직 절편을 수집하여 전도성 유리 슬라이드 위에 부착합니다. 두 번째 단계는 화학 잉크젯 프린터를 사용하여 절편 전체에 매트릭스를 배열 형태로 도포한 다음, 각 매트릭스 지점에서 질량 분석 스펙트럼을 획득하는 것입니다.실험의 전반적인 성공 여부를 확인하기 위해 다음 몇 가지 펩타이드 피크를 시각화합니다. 이어서 질량 분석 스펙트럼 내보내기 파일의 검토 및 처리, 펩타이드 데이터의 후처리 및 통계적 평가를 수행합니다. 마지막 단계는 곰팡이 이미징 질량 분석법으로 얻은 펩타이드 데이터를 분석하고 검증하는 것입니다.최종적으로, 결과는 서로 다른 처리군 간에 뇌의 다양한 영역에서 상대적인 오피오이드 펩타이드 수치가 유의미하게 다름을 보여줍니다. 방사면역 SAO 겔 기반 방식과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 다중 이미징을 통해 높은 분자 특이성을 유지하면서 처리로 인해 유도된 변화의 위치를 국소화할 수 있다는 점입니다. 이는 결과적으로 이전에는 검출되지 않았던 번역 후 수정의 절단(truncation)을 감지할 수 있는 가능성을 제공합니다.이 방법이 처음인 연구자는 정밀한 시료 준비와 데이터 처리가 필요하기 때문에 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다. 여기서는 조직의 품질, 매트릭스, 적용 프로토콜, 데이터 평가 및 후속 검증 실험에 중점을 둡니다. 단백질 분해 효소에 의한 분해를 방지하기 위해 조직 박리 과정 동안 신속하고 세심하게 작업하는 것이 필수적입니다.승인된 프로토콜에 따라 쥐를 희생시킨 후, 즉시 뇌를 적출하여 분말 드라이아이스로 옮겨 비교적 천천히 냉각시킨 다음, -80°C 냉동고에 보관하십시오. 전체 뇌는 절편 제작 전까지 수년간 보관해도 MS 신호 품질의 저하가 없습니다. 실험을 시작할 준비가 되면 tissue tech 임베딩 매질을 사용하여 뇌를 홀더에 고정하되, 임베딩 매질이 펩타이드의 이온화 및 탈착을 방해하므로 절단할 뇌 부위가 오염되지 않도록 주의하십시오.크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 냉동 조직을 12 micron 두께의 절편으로 절단하고, 조직 절편을 전도성 MALDI 유리 슬라이드 위에 탑재합니다. 이 단계에서 조직 절편의 염색을 수행하고 조직의 품질을 검사할 수 있습니다. 이 그림은 액체 질소로 급속 냉동하여 조직에 균열과 찢어짐이 발생한 뇌 조직의 크레스탈 바이올렛 염색 결과를 보여줍니다.이 조직은 매트릭스가 퍼지고 균일하게 결정화되지 않으므로 고해상도 MALDI 이미징 질량 분석법에 적합하지 않습니다. 섹션을 진공 상태에서 15분 동안 건조하고, 슬라이드를 -80 °C에서 보관하십시오. 조직 섹션은 -80 °C에 보관하더라도 섹셔닝 후 가능한 한 빨리 분석해야 합니다. 먼저, 데시케이터에서 섹션을 1시간 동안 해동한 다음, 실온의 70% ethanol로 섹션이 포함된 슬라이드를 10초 동안 세척하고, 이어서 실온의 95% Ethanol로 각각 10초씩 두 번 세척하십시오. 세척 후, 데시케이터에서 슬라이드를 10분 동안 건조하십시오.현미경으로 절편을 검사하여 조직 절편에 조직 왜곡, 미세 찢어짐 또는 작은 균열이 없는지 확인하여 mold EMS 품질을 저하시키지 않는 양호한 품질의 절편인지 확인하십시오. 다음으로, 50 mg/mL DHB, 50% methanol, 10% 150 mM ammonium acetate 및 물에 희석된 0.3% tri fluoro acetic acid로 구성된 신선한 매트릭스 용액을 준비하십시오. 조직 절편이 놓인 유리 슬라이드 홀더를 스캔하고, 칩 소프트웨어의 이미지 분석 기능을 사용하여 홀더를 각각의 기준점에 맞추십시오.그런 다음 뇌 영역과 표적 분석물 모두에 적합한 매트릭스 적용 파라미터를 선택하십시오. 이어서 공간 해상도를 지정하십시오. 이제 최적화된 프로토콜을 사용하여 chemical link Jett 프린터로 매트릭스를 적용하십시오.다중 데이터 요청 전에 매트릭스가 도포된 최종 섹션을 스캔하고 이미지를 저장하십시오. 이는 나중에 매트릭스 침적 위치를 MALDI 스테이지의 모터 좌표와 상호 참조하는 데 사용됩니다. 즉시 사용하지 않을 경우, 매트릭스가 도포된 섹션은 필요할 때까지 진공 데시케이터에 보관할 수 있습니다.대부분의 실험에서는 여기 보이는 것처럼 여러 섹션을 동시에 분석합니다. 각 슬라이드 홀더에는 두 개의 유리 슬라이드가 들어가므로, 모든 홀더에 대해 두 개씩 구성된 여러 세트를 분석해야 합니다. 몰드 TOF 획득 방법과 파라미터는 동일해야 하지만, 펩타이드 질량 보정은 각 슬라이드마다 확인해야 합니다.그 다음, 레이저 초점과 레이저 강도를 포함하여 조직 샘플의 획득 파라미터를 최적화합니다. 이어서, 베이스라인을 높여 피크 해상도를 떨어뜨리거나 검출기를 포화시키지 않고, 인접한 매트릭스 침전물에서 매트릭스가 제거되지 않는 범위 내에서 최적의 MS 신호를 얻는 데 필요한 샷 수를 입력하고 레이저 이동 방식을 선택합니다.노이즈만 검출될 때까지 각 매트릭스 스팟당 촬영 가능한 최대 샷 수를 추정하십시오. 무작위 이동 패턴을 사용하여 25샷 단계로 총 24단계에 걸쳐 각 매트릭스 도포 부위에서 600샷을 누적합니다. flex 이미징 소프트웨어를 사용하여 모든 스팟팅된 구역의 스캔 영상을 MALDI 스테이지의 모터 좌표와 교차 참조하십시오.그다음 자동 실행 배치 러너(auto execute batch runner) 소프트웨어를 사용하여 배치 모드로 데이터 획득을 수행합니다. Flex imaging과 같은 데이터 시각화 도구를 사용하여 MALDI IMS 이미지를 시각적으로 검사함으로써 피크 강도 분포를 평가하고, 피크 강도 분포가 조직 특성, 스팟 품질 또는 정규화 효과와 관련이 있는지 확인합니다. 이 예시는 9마리의 서로 다른 동물에서 나타난 10가지 서로 다른 펩타이드 피크의 분포를 보여줍니다.정규화에 사용되는 총 이온 전류(TIC)가 흰색으로 표시되어 있습니다. TIC는 질량 분석 스펙트럼의 모든 강도 값의 합계입니다. 세 번째 동물의 TIC 값은 매우 낮으며, 펩타이드 이미지에서는 특이적 정보보다 노이즈가 더 많이 나타납니다.6번 동물의 뇌는 섹션 하단에 TIC 값이 매우 높은 영역을 나타냅니다. 이는 펩타이드 이미지 C와 D의 해당 영역에서 비정상적으로 높은 강도로 반영됩니다. 이는 데이터 분석에 영향을 줄 수 있는 잠재적인 과정규격화(over normalization) 효과입니다. 과정규격화 효과가 특정 처리군에서만 나타날 경우 부정확한 결과로 이어질 수 있습니다.이 예시에서 그룹 C의 TIC는 현저히 더 높으며, 이는 개별 피크 강도에 비정상적인 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 가공되지 않은 데이터(raw data)에서는 cytochrome C의 평균 피크 강도가 그룹 B보다 그룹 C에서 더 높게 나타나지만, 정규화 후에는 피크 강도가 더 낮아집니다. 그룹 C의 경우, 이는 결과에 대한 심각한 오해로 이어질 수 있습니다.광범위한 데이터 검증을 진행하기 전에 각 처리군에 대한 평균 TIC를 항상 계산하는 것이 중요합니다. 다음으로, 관심 영역을 정의하기 위해 pro-dinorphine messenger RNA가 14 kilodalton pro-dinorphine propeptide로 번역된다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 선조체 뉴런에서 pro-dinorphine은 소포에 담겨 수지상 돌기를 통해 다른 선조체 뉴런을 표적으로 운반되거나, 축삭을 통해 세포체에서 수 밀리미터 떨어진 흑질로 운반됩니다.소포에는 프로펩타이드를 alpha neo endorphin di norphine A 또는 DI norphine B와 같은 di norphine 펩타이드로 추가 가공하는 효소들이 포함되어 있습니다. 각각은 표적 구조인 흑질로 방출될 때 서로 다른 오피오이드 수용체를 활성화할 수 있으며, dinorphine은 엔도펩티다아제(endo peptidase)와 엑소펩티다아제(exo peptidase)에 의해 추가로 가공되고 제거됩니다. 기존 항체들은 펩타이드의 N-말단이 아닌 C-말단만을 표적으로 하기 때문에, 이러한 펩타이드 중 일부는 질량 분석법으로만 검출될 수 있습니다. 오피오이드 수용체 활성화에 관여하는 서열은 Y-G-G-F-L이며, di norphine 생성 세포는 stray AUM에 위치하며 흑질로 투사됩니다.따라서 이어지는 실험에서는 stray AUM과 subs nigra 모두를 moldy IMS로 분석하여 각 관심 영역의 스펙트럼을 얻었습니다. flex 분석 소프트웨어에서 dorson medial 및 dorsal lateral stri aum과 medial 및 lateral nigra를 정의하고 데이터 분석을 위해 내보냈습니다. 데이터 축소를 위해 서로 다른 소프트웨어에 포함된 피크 검출 도구를 사용하여 피크 검출을 수행하십시오.예를 들어, Origin의 피크 분석이나 MATLAB의 MS Peaks를 사용하십시오. 모든 스펙트럼의 피크 리스트를 하나의 탭 구분 텍스트 파일로 내보내고, Freeway P bin과 같은 소프트웨어를 사용하여 피크의 시작 및 종료 경계를 결정하십시오. 피크 경계 사이의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고 이를 통계 분석에 사용하십시오. 처리 군 간의 MS 재현성은 각 질량 값에 대한 평균 MS 트레이스와 표준 오차를 계산하여 평가할 수 있습니다.본 예시에서는 분석된 질량 범위 전체에 걸친 변동성을 평가하기 위해 손상되지 않은 대조군 흑질의 평균 스펙트럼이 사용됩니다. 두 대조군 모두에서 피크 강도가 동일하고 표준 편차가 낮으므로 우수한 재현성을 확인할 수 있습니다. 이는 유효한 통계 분석을 보장합니다.데이터 세트의 변동성이 매우 큰 경우, 실험적 변동 요인을 최대한 줄여 Maori IMS 실험을 반복하는 것이 거의 항상 필요합니다. 일반적으로 한 번의 세션에서 가능한 한 많은 절편과 동물을 처리하며, 때로는 여러 사람이 교대로 작업하기도 합니다. 하지만 일부 사례에서는 이것만으로 충분하지 않을 수 있으며, 다른 전략을 채택할 수 있습니다.예를 들어, 일부 스펙트럼에 노이즈가 포함된 경우, TIC의 빈도 분포를 도식화하여 최적이지 않은 데이터를 제거하기 위한 컷오프 임계값을 사용할 수 있습니다. 데이터를 평가하는 또 다른 방법은 동일 그룹 내 두 동물의 모든 피크를 서로 대조하여 도식화하는 것입니다. 두 동물의 피크 강도가 동일하다면, 강도-강도 도표는 좁은 직선 형태로 나타납니다.한 동물에서 낮은 품질의 스펙트럼 데이터가 포함된 경우, 그래프는 일반적으로 오른쪽에서 보는 바와 같이 직선으로부터 비대칭적인 이동을 나타냅니다. 펩타이드 서열 식별을 위해, 고해상도 질량 분석법과 결합된 다차원 액체 크로마토그래피를 사용하여 쥐 뇌 조직 추출물에 대해 펩타이드 도미닉 분석을 수행합니다. 간단히 설명하면, 쥐 뇌 절편에서 뉴로펩타이드를 추출하고 강양이온 교환 크로마토그래피를 통해 사전 분획합니다.그 후, 각 분획물을 나노 흐름 역상 HPLC를 사용하여 추가로 분리합니다. 다음으로, 하이브리드 선형 이온 트랩 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 장비를 이용한 전기 분무 탠덤 질량 분석법으로 뉴로펩타이드를 특성화하며, 마지막으로 데이터베이스 매칭을 통해 펩타이드 서열 식별을 수행합니다. 일부 뉴로펩타이드의 경우 특이적 항체를 사용할 수 있으며, 면역 조직 화학 염색 실험을 통해 펩타이드 식별 및 실험 결과를 검증할 수 있습니다. 이는 MALDI 이미징 질량 분석법보다 해상도가 높으며 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다.이 예시에서, 왼쪽 상단 패널의 해마와 왼쪽 하단 패널의 흑질에서 Dior bee 면역 반응성 신경 섬유를 확인할 수 있으며, 오른쪽 하단의 Maori IMS 이미지는 서로 다른 뇌 영역 수준에서의 국소화를 보여줍니다. 특정 피크 질량이 특정 펩타이드에 명확하게 할당될 수 있다는 최종적인 증거는 pronin knockout 마우스와 같은 펩타이드 knockout 동물에서 moldy IMS를 수행함으로써 얻을 수 있습니다. 화살표로 표시된 몇몇 피크들은 야생형 대조군에서는 나타나지만, knockout 군에서는 소실된 것을 확인할 수 있습니다.substance P 및 P ink과 같이 관련 없는 펩타이드 피크는 결손 동물과 대조 동물 사이에 차이가 나타나지 않았습니다. Di norphine B 및 alpha neo endorphin의 피크 강도는 six hydroxy dopamine 병변에서 유의하게 증가했습니다. 화살표로 표시된 고도 이상운동증 동물들의 Parkinsonian stri AUM은 저도 이상운동증 그룹 및 병변 대조 그룹과 비교하여 증가하였습니다.통계 분석 결과, 말단 타이로신이 제거된 절단된 alpha neo endorphin에 해당하는 펩타이드 질량의 유의미한 증가가 확인되었습니다. 실제로 시각적 검토 결과, 영상 분석 데이터는 녹색으로 표시된 모체 di norphine 펩타이드와 적색으로 표시된 관련 DES 타이로신 대사물질의 높은 공국소화를 보여주며, 오른쪽의 중첩 패널에서 황색은 지역적 중첩을 나타냅니다. 이 기술의 뛰어난 잠재력은 다른 방법으로는 검출할 수 없는 다양한 뇌 구조 내의 선택적 펩타이드 프로세싱에 관한 발견을 통해 강조됩니다.여기에서 빨간색으로 표시된 특정 DES 티로신 대사물들은 초록색으로 표시된 모체 펩타이드와 함께 국소화되었으며, 운동이상증 쥐의 흑질 치밀부(substantial nigra)가 아닌 선조체(striatum)에서만 관찰되었습니다. 흑질 치밀부(sub nigra)의 이미지 분석 결과, 빨간색으로 표시된 분해 산물 lu 및 kelin arch는 초록색으로 표시된 di norphine B와 역으로 국소화되어 있었으며, 이는 운동이상증 동안 DI norphine B가 외측 흑질 치밀부에 국소적으로 방출된 후 lu 및 careful in AR One 설정으로 대사되었음을 나타냅니다. 다중 모드 이미징을 이용한 단일 실험은 샘플 준비와 데이터 획득을 위해 하루 또는 이틀에 걸쳐 수행될 수 있습니다.그 후 데이터 평가를 위해 하루나 이틀이 더 소요됩니다. 샘플 크기에 따라, 검증 실험을 적절히 수행하려면 실험실에서 실제 실험을 위해 추가로 하루나 이틀이 더 필요할 수 있습니다. 다음 단계들에서는 특히 주의를 기울이는 것이 중요합니다.펩타이드 분해를 방지하기 위해 조직 절제 및 동결을 신속하게 수행해야 하며, 세척 및 매트릭스 도포 프로토콜은 각 실험에 맞게 최적화해야 합니다. 과도한 정규화 효과나 불충분한 피크 검출로 인한 위양성을 방지하기 위해 데이터 평가 및 통계 분석을 신중하게 수행해야 합니다.

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