파킨슨병의 Neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법

이 절차의 주요 목적은 곰팡이가 핀 이미징 질량 분석법을 사용하여 얇은 뇌 섹션에서 뉴로펩타이드, 특히 오피오이드 펩타이드의 공간 분포를 밝히는 것입니다. 이것은 먼저 스냅 냉동 쥐 뇌의 12마이크로미터 얇은 조직 절편을 수집하고 전도성 유리 슬라이드에 장착하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 화학 잉크젯 프린터를 사용하여 섹션 전체에 걸쳐 곰팡이가 핀 Matrixx를 어레이로 적용한 다음 각 매트릭스 스폿에서 하나의 질량 스펙트럼을 획득하는 것입니다.

다음으로, 실험의 전반적인 성공을 보장하기 위해 여러 펩타이드 피크를 시각화합니다. 그 다음에는 질량 스펙트럼 내보내기의 검사 및 처리와 펩타이드 데이터의 사후 처리 및 통계 평가가 이어집니다. 마지막 단계는 곰팡이가 핀 이미징 질량 분석법으로 얻은 펩타이드 데이터를 분석하고 검증하는 것입니다.

궁극적으로, 결과는 서로 다른 치료 그룹 간에 뇌의 다른 영역에서 상대적인 오피오이드 펩타이드 수치에 상당한 차이가 있음을 보여줍니다. 무선 면역 SAO 젤 기반 접근법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다중 이미징을 통해 높은 분자 특이성을 유지하면서 치료로 유도된 변화의 국소화를 가능하게 한다는 것입니다. 이를 통해 이전에 감지되지 않았던 번역 후 수정 사항의 잘림을 감지할 수 있는 가능성을 제공합니다.

이 방법을 처음 접하는 개인은 이 기술이 심오한 샘플 준비와 데이터 처리를 필요로 하기 때문에 처음에는 어려움을 겪을 것입니다. 여기서 초점은 조직의 품질, 매트릭스, 응용 프로토콜, 데이터 평가 및 다음 검증 실험입니다. 단백질 분해 분해를 피하기 위해 조직을 해부하는 동안 빠르고 부지런히 작업하는 것이 중요합니다.

승인된 프로토콜에 따라 쥐를 희생시킨 후 즉시 뇌를 제거하고 분말 드라이아이스로 옮기고 뇌를 비교적 천천히 얼게 하고 뇌를 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오. 전체 뇌는 MS 신호 품질의 손실 없이 절편 전에 몇 년 동안 보관할 수 있습니다. 절차를 시작할 준비가 되면 조직 기술, 임베딩 미디어를 사용하여 홀더에 뇌를 장착하고, 임베딩 미디어가 펩타이드의 이온화 및 탈착을 방해하므로 절단할 뇌 부분의 오염을 방지합니다.

저온 유지 장치 마이크로톰에서 냉동 조직을 12미크론 슬라이스로 절단하고 전도성 말디 유리 슬라이드에 조직 절편을 장착합니다. 이 시점에서 조직 절편의 염색이 수행될 수 있으며 검사된 조직의 품질을 검사할 수 있습니다. 이 그림은 액체 질소에 얼어붙은 뇌 조직의 능선 보라색 염색으로 인해 조직이 갈라지고 찢어지는 것을 보여줍니다.

이 조직은 매트릭스가 확산되고 고르게 결정화되지 않고 진공 상태에서 15분 동안 절편을 건조시키고 섭씨 영하 80도에서 슬라이드를 보관해야 하며, 섭씨 영하 80도에서 보관하더라도 절편 후 가능한 한 최단 시간 내에 조직 절편을 분석해야 하기 때문에 고해상도 곰팡이 이미징 질량 분석에 적합하지 않습니다. 첫째, 1 시간 동안 건조제에 있는 단면도를 녹이고, 그 후에 실온에 있는 70%에타놀에 있는 단면을 10초 동안 그 후에 활주를 세척하고, 그 후에 각각 10 초 동안 실온에 있는 95%에타놀에 있는 2회 세척에 의하여 세척합니다. 세척 후 슬라이드를 건조제로 10분 동안 건조시킵니다.

현미경으로 절편을 검사하여 조직 절편이 조직 뒤틀림, 미세 찢어짐 또는 곰팡이 EMS 품질을 손상시킬 수 있는 작은 균열이 없는 양호한 품질인지 확인하십시오. 다음으로, 물 중 밀리리터 50mg, DHB 및 50% 메탄올, 10% 150 밀리몰 암모늄 아세테이트 및 0.3% 트리플루오로 아세트산으로 구성된 새로운 매트릭스 용액을 준비합니다. 티슈 섹션이 있는 유리 슬라이드 홀더를 스캔하고 칩 소프트웨어의 이미지 분석 기능을 사용하여 홀더를 해당 기준점에 정렬합니다.

그런 다음 뇌 영역과 표적 분석물 모두에 대해 적절한 매트릭스 응용 파라미터를 선택합니다. 다음으로, 다음으로 공간 해상도를 지정합니다. 이제 케미컬 링크 Jett 프린터에서 최적화된 프로토콜을 사용하여 매트릭스를 적용합니다.

최종 매트릭스 발견 섹션을 스캔하고 다중 데이터 요청 전에 사진을 저장합니다. 이것은 나중에 매트릭스 퇴적물을 maldi 단계의 모터 좌표와 상호 참조하는 데 사용됩니다. 즉시 사용하지 않는 경우, 매트릭스 스폿 섹션은 필요할 때까지 진공 상태에서 건조제에 보관할 수 있습니다.

대부분의 실험에서는 여기에서 볼 수 있듯이 여러 섹션을 동시에 분석합니다. 각 슬라이드 홀더는 두 개의 유리 슬라이드에 맞으므로 모든 홀더에 대해 두 개의 여러 세트를 분석해야 합니다. 금형 TOF 획득 방법 및 매개변수는 동일해야 하지만 각 슬라이드에 대해 펩타이드 질량 보정을 확인해야 합니다.

그런 다음 레이저 초점 및 레이저 강도를 포함하여 조직 샘플에 대한 획득 매개변수를 최적화합니다. 그런 다음 피크 해상도를 낮추는 기준선을 높이지 않고 최적의 MS 신호를 달성하는 데 필요한 샷 수를 입력합니다. 검출기를 포화시키거나 인접한 매트릭스 침전물에서 매트릭스를 절제하고 레이저 움직임을 선택합니다.

여기에서 노이즈만 감지될 때까지 매트릭스 스폿당 촬영할 수 있는 최대 샷 수를 추정합니다. 각 매트릭스 증착에서 25샷 단계로 600샷이 누적되며, 무작위 이동 패턴을 사용하여 총 24단계 수가 됩니다. 플렉스 이미징 소프트웨어를 사용하여 모든 점박이 부분의 스캔을 MALDI 스테이지의 모터 좌표와 상호 참조합니다.

그런 다음 자동 실행 배치 러너 소프트웨어를 사용하여 배치 모드에서 데이터 수집을 수행합니다. Flex 이미징과 같은 데이터 시각화 도구를 사용하여 Maori IMS 이미지를 육안으로 검사하여 피크 강도 분포를 평가하고 피크 강도 분포가 조직 특징, 스포팅 품질 또는 정규화 효과와 관련이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 예는 9개의 서로 다른 동물에서 10개의 서로 다른 펩타이드 피크의 분포를 보여줍니다.

정규화에 사용되는 총 철 전류 또는 TIC는 흰색으로 표시됩니다. TIC는 질량 스펙트럼의 모든 intensity 값의 합입니다. 동물 3에서는 TIC 값이 매우 낮으며, 펩타이드 이미지는 특정 정보보다 더 많은 노이즈를 보여줍니다.

6번 동물의 뇌는 매우 높은 TIC 값이 있는 영역의 맨 아래에 영역을 표시합니다. 이는 펩타이드 이미지 C와 D의 해당 영역에서 비정상적으로 높은 강도로 반영되며, 이는 데이터 분석에 영향을 미칠 수 있는 정규화 효과에 대한 잠재력입니다. 과도한 정규화 효과는 하나의 치료 그룹에만 특이적으로 존재하는 경우 부정확한 결과로 이어질 수 있습니다.

이 예에서 TIC는 그룹 C에서 훨씬 더 높으며, 이는 개별 피크 강도에 비정상적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 사이토크롬 C의 평균 피크 강도는 원시 데이터에서 그룹 B보다 그룹 C에서 더 높지만, 정규화 후에는 이제 피크 강도가 더 낮습니다. 그룹 C의 경우, 이는 결과에 대한 심각한 오해로 이어질 수 있습니다.

광범위한 데이터 검증을 진행하기 전에 항상 각 치료 그룹의 평균 TIC를 계산하는 것이 중요합니다. 다음으로, 관심 영역을 정의하기 위해서는 pro di norphine messenger RNA가 14 kilodalton pro norphine propeptide로 번역된다는 것을 인식하는 것이 중요합니다. 줄무늬 또는 뉴런에서 prod norphine은 수지상을 통해 다른 줄무늬 또는 뉴런을 표적으로 하고 축삭돌기를 통해 세포체에서 수 밀리미터 떨어진 실질적인 흑질로 운반되는 소포로 포장됩니다.

소포는 알파 네오 엔돌핀 디 노르핀 A 또는 DI 노르핀 B와 같은 디 노르핀 펩티드로 프로펩티드를 추가로 처리하는 효소를 함유하고 있으며, 각각은 표적 구조를 방출할 때 다른 아편 수용체를 활성화할 수 있으며, 실질적인 흑질, 디노르핀은 엔도 및 엑소 펩티다제에 의해 추가로 처리되고 제거됩니다. 이러한 펩타이드 중 일부는 기존 항체가 펩타이드의 C 말단 말단만 표적으로 하고 말단 말단은 표적으로 하지 않기 때문에 질량 분석법으로만 검출할 수 있습니다. 오피오이드 수용체 활성화를 담당하는 Y-G-G-F-L 서열, 디 노르핀 생산 세포는 표유 AUM에 상주하며 상당한 흑질로 돌출합니다.

따라서 다음 실험에서는 stray AUM과 subs nigra를 모두 각 관심 영역의 스펙트럼인 moldy IMS에 의해 분석되었습니다. dorson medial and dorsal lateral stri aum과 medial and lateral nigra는 플렉스 분석 소프트웨어에서 정의되고 데이터 분석을 위해 내보내졌습니다. 데이터 감소를 위해 다른 소프트웨어에 포함된 피크 탐지 툴을 사용하여 피크 검출을 수행합니다.

예를 들어, 원점에서 피크 분석을 사용하거나 MATLAB에서 MS 피크를 사용합니다. 모든 스펙트럼의 피크 목록을 하나의 탭으로 구분된 텍스트 파일로 내보내고, 피크 시작 및 중지 경계를 결정합니다.고속도로 P bin과 같은 소프트웨어를 사용하여 피크 경계 사이의 곡선 아래 면적을 계산하고 이를 통계 분석에 사용합니다. 미시시피. 처리군 간의 재현성은 각 질량 값에 대한 평균 MS trace와 표준 오차를 계산하여 평가할 수 있습니다.

이 예에서는 온전한 대조군 nigra에 대한 평균 스펙트럼을 사용하여 분석된 질량 범위 전반의 변동성을 평가합니다. 우수한 재현성은 피크 강도가 두 대조군에서 동일하고 표준 편차가 낮기 때문에 볼 수 있습니다. 이를 통해 유효한 통계 분석이 보장됩니다.

데이터 세트가 높은 수준의 변동을 나타내는 경우 거의 항상 Maori IMS 실험을 반복하여 실험 변동 원인을 최대한 줄여야 합니다. 일반적으로 우리는 한 번의 세션에서 가능한 한 많은 섹션과 동물을 처리하며, 때로는 여러 사람이 교대로 작업하는 것을 포함합니다. 그러나 어떤 경우에는 여전히 이것만으로는 충분하지 않으며 다른 전략을 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 일부 스펙트럼이 노이즈로 구성된 경우 TIC의 주파수 분포를 플로팅할 수 있으며 차단 임계값을 사용하여 최적이 아닌 데이터를 제거할 수 있습니다. 데이터를 평가하는 또 다른 방법은 같은 그룹 내의 두 동물에 대한 모든 피크를 서로 비교하여 표시하는 것입니다. 두 동물에서 최고 농도가 같으면 강도 농도 플롯에 좁은 직선이 표시됩니다.

한 동물에 저품질 스펙트럼 데이터가 포함된 경우 플롯은 일반적으로 오른쪽에서 볼 수 있듯이 직선으로부터의 비대칭 이동을 표시합니다. 펩타이드 염기서열 식별을 위해 고분해능 질량 분석법으로 연결된 다차원 액체 크로마토그래피를 사용하여 쥐 뇌 조직 추출물에 대한 펩티드 Dominic 분석을 수행합니다. 간단히 말해서, 뉴로펩티드는 쥐의 뇌 절편에서 추출하고 강력한 양이온 크로마토그래피를 사용하여 사전 분획합니다.

그런 다음 나노 흐름 역상 HPLC를 사용하여 다른 분획을 추가로 분리합니다. 다음으로, 하이브리드 선형 이온 트랩 리아 변환 이온 사이클로트론 공명 기기를 사용하여 전기 스프레이 탠덤 질량 분석법을 통해 뉴로펩티드를 특성화하고, 최종적으로 일부 뉴로펩티드 및 면역조직화학 실험에 사용할 수 있는 특정 항체를 매칭하여 데이터베이스에 의한 펩타이드 서열 식별을 수행하고, 펩타이드 식별 및 실험 결과를 검증할 수 있습니다. 해상도는 Maori 이미징 질량 분석법보다 높으며 추가 정보를 얻을 수 있습니다.

이 예시에서 Dior bee의 면역 반응성 신경 섬유는 해마, 좌측 상단 및 실질적 흑질 좌측 하단 패널에서 볼 수 있으며, 오른쪽 하단의 마오리 IMS 이미지는 서로 다른 뇌 영역 수준의 국소화를 보여줍니다. 피크 질량이 특정 펩타이드에 명백하게 할당될 수 있다는 궁극적인 증거는 pronin knockout 마우스의 펩타이드 knockout 동물에 대해 곰팡이가 핀 IMS를 수행하는 것입니다. 화살표로 표시된 여러 피크가 녹아웃에서 누락되었지만 와일드 유형 제어는 없습니다.

동물: 물질 P 및 P 잉크와 같은 관련 없는 펩타이드 피크는 녹아웃과 대조 동물 간에 차이를 나타내지 않습니다. Di norphine B 및 alpha neo 엔돌핀 피크 강도는 6개의 하이드록시 도파민 병변에서 크게 증가합니다. 화살표로 표시된 고도의 운동이상증 동물의 파킨슨병 stri AUM은 낮은 운동이상증 및 병변 대조군과 비교했습니다.

통계 분석은 또한 말단 티로신이 제거된 절단된 알파 네오 엔돌핀에 해당하는 펩타이드 질량에 대한 상당한 증가를 보여주었습니다. 실제로, 육안 검사에서 이미징 결과는 녹색으로 표시된 모 디 노르핀 펩타이드의 높은 공동 국소화를 보여주며, 빨간색 노란색으로 표시된 관련 DES 티로신 대사 산물은 오른쪽의 오버레이 패널에서 지역 중복을 나타냅니다. 이 기술의 큰 잠재력은 다른 방법으로는 검출할 수 없는 다양한 뇌 구조에서 선택적 펩타이드 처리에 관한 발견에 의해 강조됩니다.

여기서, 빨간색으로 표시된 특정 DES 티로신 대사 산물은 녹색으로 표시된 모 펩타이드와 함께 국소화되었으며 선조체에서만 관찰되었지만 dyskinetic rats의 실질적인 흑색은 관찰되지 않았습니다. sub nigra 이미지 분석에서 빨간색으로 표시된 분해 산물 lu 및 kelin arch는 녹색으로 표시된 di norphine B와 반비례하여 국소화된 것으로 밝혀졌으며, 이는 dyskinesia 동안 DI norphine B가 측면 subs, nigra에서 국소적으로 방출된 다음 AR One 설정에서 lu 및 조심스럽게 대사되었음을 나타냅니다. 금형 이미징을 사용한 단일 실험은 샘플 준비 및 데이터 수집을 위해 하루나 이틀 만에 수행할 수 있습니다.

그런 다음 데이터 평가를 위해 하루나 이틀 더 걸립니다. 샘플 크기에 따라 검증 실험이 제대로 수행될 경우 실험실에서 하루나 이틀 더 실습 실험이 필요할 수 있습니다. 다음 단계에서 특히 주의

펩 분해를 방지하기 위해 조직 해부 및 동결을 신속하게 수행해야 하며, 세척 및 매트릭스 적용 프로토콜은 각 실험에 대해 최적화되어야 합니다. 데이터 평가 및 통계 분석은 과도한 정규화 효과 또는 잘못된 피크 감지로 인한 거짓 긍정을 방지하기 위해 신중하게 평가해야 합니다.