Name: 전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 Maedi-visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 전파하고 GFP 형광 현미경 및 유세포 분석으로 검출하는 방법을 양의 맥락막초세포에서 실시하는 기술입니다.

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이 작품은 아이슬란드어 연구 기금과 연구 기금 아이슬란드 대학에 의해 투자되었다.

1. Transfection 분자 복제는 각각 12킬로바이트 및 4.5 킬로바이트 두 plasmids, p8XSp5 - egfp과 p67r에 포함되어 있습니다. 9,10 <ol><li> 두 plasmids, 즉 p8XSp5 - egfp의 4.4 μg과 transfection 전에 XbaI과 ligate과 p67r의 1.6 μg의 몰 수량 잘라. </li><li> 내고 들어, 16 ° C 하룻밤에 50 μl 반응과 부화에 ligase 1 와이즈 단위를 사용합니다. </li><li> 결합이 완료되면 ° C ligase의 불활 성화 15 분 65 내고 믹스를 품어. 이 단계는 생략할 수 있습니다. </li><li> 이틀 전 transfection, 종자 10 6 SCP의 T25 조직 문화 플라스크에 세포, 그리고 confluency 90 % monolayer에 항생제없이 5 ML DMEM + 10% 양고기 혈청과 2mM의 글루타민에서 이틀 동안 세포를 성장. 세포 이틀 후 confluency 90 %에 도달하지 않은 경우 세포가 하나의 추가 일 성장을 둡니다. </li></ol> 참고 : 양고기 혈청이 태아 소 혈청 (FBS)으로 대체하실 수 있습니다. MVV의 일부 변종은 FBS에 의해 저해되기 때문에 우리는 정기적으로, 양고기 혈청을 사용하여,이 MVV 변형은 그러나, FBS에 의해 저해하지 않습니다. <ol start="5"><li> 세포 transfection에 대한 준비가되면, 항생제없이 1 %의 혈청 (양 혈청 또는 FBS)과 DMEM에 매체를 변경합니다. 우리는 transfection에 대한 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)을 사용합니다. </li><li> 500μl Opti - 가상 매체에서 DNA를 희석. </li><li> 500μl Opti - 가상 매체에 20μl Lipofectamin 2000을 희석하고 5 분 실온 (RT)에 둡니다. </li><li> 5 분 부화 후 희석 Lipofectamine 2000 (총 부피 = 1000 μl)로 희석 DNA를 결합. 부드럽게 믹스와 RT에서 20-30 분 알을 품다. </li><li> SCP 세포와 미디어 (5 ML)이있는 T25 술병에 transfection 믹스 (1 ML)를 추가합니다. 부드럽게 락을로 섞는다. </li><li> 37 품어 ° C와 5% CO 밤새 2 (18-24 H). </li><li> 1 %의 묘약, 2mM 글루타민, 100IU 페니실린과 스트렙토 마이신과 100IU DMEM 중간 다음날을 변경합니다. </li><li> 거꾸로 형광 현미경으로 SCP 세포에서 GFP의 생산을 모니터링합니다. 15 % - 낮은 transfection 효율은 보통 5이 기본 세포와 기대하실 수 있습니다. </li><li> 37 더 품어 ° C, 5 %는 술병에있는 바이러스의 확산 있도록 몇 일 동안 CO 2. 그것은 일반적으로 전체 감염 7~14일 소요됩니다. </li><li> Eppendorf 튜브에 뜨는를 aliquoting하여 바이러스를 수확. 세포 파편을 제거하는 5 분 3,000 RPM에서 microfuge에 스핀. 새로운 튜브에 바이러스를 포함하고있는 뜨는을 전송합니다. -80에서 보관 ° C. </li></ol> 2. 바이러스의 적정 <ol><li> 10% 혈청, 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 스트렙토 마이신의 100IU/ml, 당 우물에 96 잘 판과 보충 100 μl DMEM 매체의 씨앗 3x10 4 SCP 세포를. 37 품어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 세포 다음날 합류하는 경우, 1 % 혈청, 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 스트렙토 마이신 100IU/ml의 각 물론 100 μl와 DMEM에 매체를 변경합니다. </li><li> 다음과 같은 방법으로 바이러스를 희석 : <ol><li> 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 96 잘 원형 바닥이나 V - 하단 플레이트 4 X 10 우물에 잘 따라 100IU/ml 스트렙토 마이신, 1 %의 혈청 180 μl DMEM을 추가합니다. </li><li> 사통으로 작성된 열배 시리얼 dilutions 들어, 샘플이 완전히 혼합되는 것을 보장하기 위해 아래 판의 첫 ​​번째 열에 4wells 각 바이러스의 20 μl를 추가하고, 4 채널 피펫을 사용하여 최대 피펫합니다. 피펫 팁을 변경하고 다음 네 우물 등 20 μl를 전송. 부정적인 제어를위한 바이러스 않고 마지막 우물을 둡니다. </li></ol></li><li> SCP 세포와 매체 바이러스 dilutions 100 μl를 추가합니다. </li><li> 37 ° C와 5% CO 2를 품어. 두 주 동안 GFP 형광 및 cytopathic 효과를 관찰. Cytopathic 효과 multinuclear 나타나는 세포 및 세포 죽음으로 끝나는, 둥글게 뻗어 프로세스 정상 세포보다 투명되고 세포로 이루어져 있습니다. </li><li> 리드 Muench 방법 11을 사용하여 바이러스 titer (TCID50)를 계산합니다. </li></ol> 3. 감염된 세포의 FACS 분석 참고 : 바이러스의 복제의 신속한 모니터링, 감염된 세포 유동세포계측법 검사를하실 수 있습니다. <ol><li> 감염된 세포를 (CA 10 5) Trypsinize, 500μl의 PBS PBS와 resuspend와 1X 씻는다. </li><li> 30 분 RT에서 품어 500 μl 4 % paraformaldehyde 용액 (2 % 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 5 분 3,000 RPM에서 microfuge의 펠릿 세포. </li><li> PBS 2x5 분들과 씻고 FACScan 분석기에서 분석합니다. 10000 이벤트를 계산합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 10 7 TCID 50 / ML -이 바이러스는 전염성이 완전히 10 6 titer로 복제되어야합니다. 감염된 세포는 형광되며 det 수 있습니다유동세포계측법 및 형광 현미경에 의해 ected. 일반적으로, GFP는 유동세포계측법 (그림 1)를 사용하여 감염된 세포 배양에서 세포의 60 % 이상에서 발견하실 수 있습니다. 마찬가지로, 형광 현미경에 의해 시각 때, 세포의 대부분은 (그림 2A와 B) 형광 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 감염 7 일 후 KV1772 - egfp 바이러스에 감염된 세포의 SCP FACScan 분석. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 배양 7 일 (A) 이후 KV1772 - egfp에 감염 SCP 전지의 그림 2. 위상 콘트라스트 현미경. 같은 세포는 형광 현미경 (B)에 의해 시각.

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
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<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
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<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 제시 MVV의 분자 클론을 표현 GFP는 호스트 세포의 상호 작용과 체외 및 생체내 두 MVV의 pathogenicity을 분석하는 데 유용합니다. 복제 7~14일 후 얻은 바이러스는 의심할 여지없이 반전 transcriptase의 부정확으로 인해 일부 변이를 인수했다. 그러나, 단일 사이클 벡터로 복제의 사용에 제한이 있습니다. 하나는 복제의 사용이 양 염소 원산지 세포로 제한되어 있기 때문입니다. 우리의 구조를 사용하여 이러한 세포의 transfection 효율은 5~15%이며, pEGFP - N3 벡터를 사용하여 transfection 효율은 293 - T 세포를 사용하여 90 % 이상에 비해 15~20%입니다. 293 - T 세포는 MVV 벡터에 대한 포장 세포로 테스트하지만, 결과 바이러스 입자는 양 세포와 정체 불명의 제한 요인으로 인해 아마도 293 - T 세포 모두 12 비 전염성이 입증되었습니다. 전염성 클론은 다른 단점이다이 plasmids에 포함되어 있습니다. 이것은 전체 길이 복...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti - 가상 </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

전파와 녹색 형광 단백질을 표현 maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi - visna 바이러스 (MVV) 천천히 진보 간질성 폐렴 및 뇌염 1 원인, 양 lentivirus입니다. 생체내의 MVV의 주요 대상 세포는 단핵구 혈통의 2로 간주됩니다. MVV의 일부 변종 그러나 3,4, 다른 세포 유형에 복제할 수 있습니다. 녹색 형광 단백질은 살아있는 세포에 lentiviruses 공부를 위해 일반적으로 사용되는 마커입니다. 우리는 MVV의 dUTPase에 대한 유전자에 egfp 유전자를 삽입했습니다. dUTPase 유전자는 잘 양과 염소의 대부분 lentivirus의 변종에 보존하고 CAEV 5 복제에 중요하다고 표시되었습니다. 그러나, dUTPase는 체외에서 생체내 6 모두 본 연구에 사용된 MVV의 분자 클론의 복제 소모품으로 표시되었습니다. MVV 복제는 엄격히 양이나 염소 원산지 세포에 국한됩니다. 우리는 transfection 및 바이러스 7 전파에 대한 양의 맥락막 얼기 (SCP 세포)에서 기본 세포 라인을 사용합니다. 형광 MVV 완전히 전염성이며 EGFP 표현은 적어도 6 구절 8 이상의 안정이다. TCID 50 EGFP 측정 사이 좋은 상관 관계가있다. 이 바이러스는 따라서 세포 tropism와 체외에서 생체내 8 pathogenicity 연구에 감염된 세포의 신속한 검출에 유용합니다.

우리는 GFP를 표현하고 완전히 전염성이있다 maedi - visna 바이러스의 분자 클론을 설명합니다. 이 바이러스의 복제는 형광 현미경과 유동세포계측법를 사용하여 검색하실 수 있습니다.

전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

Maedi-visna 바이러스(MVV)는 양의 렌티바이러스로, 서서히 진행되는 간질성 폐렴과 뇌염을 유발합니다1. ... 내에서 MVV의 주요 표적 세포는...

이 절차의 전반적인 목표는 녹색 형광 단백질을 발현하는 Mildy vs. No 바이러스의 감염성 클론을 증식시키고 검출하는 것입니다. 이 녹색 형광 단백질은 Myy Ner 바이러스 게놈의 D utp Ace 코팅 유전자에 클로닝되었습니다.감염성 클론은 두 개의 플라스미드에 포함되어 있습니다. 첫째, myy Ner 서열을 포함하는 두 플라스미드를 xpa one 제한 효소로 절단한 후 연결합니다. 둘째, 구축물을 양 맥락총 세포에 형질전환합니다.마지막으로, myy vino virus에 감염된 세포를 형광 현미경과 유세포 분석법으로 검출합니다. 안녕하세요, 저는 아이슬란드 대학교 TER 실험병리학 연구소의 Stefano Neron입니다. 오늘은 녹색 형광 단백질을 발현하는 my vascular virus의 감염성 분자 클론을 증식하고 검출하는 절차를 보여드리겠습니다.분자 클론은 각각 12 kilobases와 4.5 kilobases 크기의 플라스미드 P eight XSP five EGFP 및 P six seven or에 포함되어 있습니다. 두 플라스미드의 등몰량, 즉 4.4 micrograms의 P eight XSP five EGFP와 1.6 micrograms의 P six seven or를 XPA one으로 절단한 후, 형질전환 전에 연결(ligate)합니다. 연결 반응이 완료되면 연결 혼합물을 65 °C에서 15분 동안 배양합니다. 형질전환 이틀 전에 10⁶개의 SCP 세포를 T 25 조직 배양 플라스크에 접종하고, 항생제가 없는 5 milliliter DMEM에 10% lamb serum과 2 millimolar glutamine을 첨가하여 세포가 90% 합류도(confluency)의 단일층을 이룰 때까지 이틀 동안 배양합니다.이틀 후에도 세포의 합쳐짐(confluency)이 90%에 도달하지 않은 경우, 세포를 하루 더 배양합니다. 어린 양 혈청(lamb serum)은 소 태아 혈청(FBS)으로 대체할 수 있습니다. 다만, 일부 MVV 균주는 FBS에 의해 억제되므로 일반적으로 어린 양 혈청을 사용합니다.하지만 이 MVV 균주는 FBS에 의해 억제되지 않습니다. 세포가 transfection 준비가 되면 배지를 항생제가 없는 1% lamb serum 또는 FBS가 포함된 DMEM으로 교체합니다. transfection에는 Lipofectamine 2000을 사용하며, DNA를 500 microliters의 opti MEM 배지에 희석하고 20 microliters의 lipofectamine 2000을 500 microliters의 opti MEM 배지에 희석한 후, 실온에서 5분 동안 방치합니다.5분간 배양한 후, 희석된 DNA와 희석된 Lipofectamine 2000을 혼합하여 총 부피 1000 µL로 만듭니다. 가볍게 섞어 20~30분 동안 배양합니다. 실온에서, SCP 세포와 배지 혼합물이 들어 있는 T 25 플라스크에 형질전환 혼합물을 넣고 가볍게 흔들어 섞어줍니다.37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1% serum, 2mM glutamine, 100 IU/mL penicillin 및 100 IU/mL streptomycin이 포함된 DMEM으로 배지를 교체합니다. 도립 형광 현미경을 통해 SCP 세포의 GFP 발현 여부를 관찰합니다.이러한 일차 세포의 경우 일반적으로 5%에서 15% 정도의 낮은 형질전환 효율이 예상됩니다. 플라스크 내에서 바이러스가 확산될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 수일간 더 배양하십시오. 완전한 감염까지는 보통 7일에서 14일이 소요됩니다. 상층액을 에펜도르프 튜브에 분취하여 바이러스를 수확하십시오.세포 파편을 제거하기 위해 마이크로 원심분리기로 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리합니다. 바이러스가 포함된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.-80°C에 보관된 3×10⁴개의 SCP 세포를 웰당 10% serum, 2mM glutamine, 100 IU/mL penicillin 및 100 IU/mL streptomycin이 첨가된 100µL의 DMEM 배지에 분주하여 배양합니다.96-웰 플레이트에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양합니다. 다음 날 세포가 confluent 상태가 되면, 배지를 1% serum이 포함된 DMEM으로 교체합니다. 각 웰에 100 µL씩 넣은 후, 다음과 같은 방법으로 바이러스를 희석합니다.96웰 라운드 바텀 또는 V 바텀 플레이트의 10개 웰씩 4개 군에 1% serum이 포함된 DMEM 180 µL를 각각 분주하여, 4회 반복(quadruplicate)의 10배 단계 희석을 준비합니다. 플레이트 첫 번째 열의 4개 웰에 각각 바이러스 20 µL를 첨가합니다. 그 다음, 4채널 피펫을 사용하여 상하로 피펫팅함으로써 샘플이 충분히 혼합되도록 합니다.피펫 팁을 교체하고 20 µL를 다음 네 개의 웰에 순차적으로 옮깁니다. 음성 대조군으로 사용하기 위해 마지막 웰들에는 바이러스를 넣지 않고 비워 둡니다. 바이러스 희석액 100 µL를 SEP 세포와 배지가 들어 있는 인큐베이터에 추가합니다.37 °C 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 2주 동안 GFP 형광과 세포변성효과(cytopathic effects)를 관찰합니다. 세포변성효과는 세포가 둥글게 변하고 돌기가 뻗어 나오며 정상 세포보다 투명도가 낮아지다가, 최종적으로 다핵 세포가 나타나고 세포 사멸로 이어지는 과정으로 구성됩니다.바이러스 복제를 신속하게 모니터링하기 위해 Reid Munch 방법을 사용하여 바이러스 역가를 계산하십시오. 감염된 세포는 유세포 분석용 트립신을 사용하여 검사할 수 있습니다. 약 10⁵개의 감염된 세포를 관찰하십시오.PBS로 한 번 세척한 후 500 µL의 PBS에 다시 부유시킵니다. 최종 농도가 2%가 되도록 4% Paraformaldehyde 용액 500 µL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.PBS로 5분씩 2회 세척한 후 fact scan 분석기로 분석합니다. 10,000개의 이벤트를 계수합니다. 본 연구에서 제시한 GFP 발현 바이러스 분자 클론은 in vivo 및 in vitro 모두에서 신경 바이러스의 바이러스-숙주 상호작용과 병원성을 분석하는 데 유용하게 활용될 수 있습니다.본 연구의 뉴로바이러스가 인간 세포에 영향을 미칠 수 있다는 점이 입증되지는 않았으나, 세포와 플라스미드 모두 본 실험실에서 제공받을 수 있으므로 모든 생물 안전 등급(biosafety level) 주의 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

우리는 태트 - 응답성 LTR 이외에, 가지고 lentiviral 벡터를 개발, HIV - 1 태트 및 레브 종속적인 방식으로 기자의 유전자 발현을 조절 할 수 레브 - 반응 요소 (RRE). 벡터는 GFP의 표현을 통해 살아있는 세포에서 HIV 복제의 구체적인 검색을 허용합니다.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

여기에서는 바이러스 입자 또는 형광 마이크로비즈를 신생아 쥐의 뇌에 뇌내실 및 혈관 내 주입하는 간단한 방법을 설명합니다. 바이러스와 나노 입자의 국소화 패턴은 현미경 평가 또는 현장 혼성화에 의해 검출될 수 있습니다.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

배우세요 Maedi-visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 전파하고 GFP 형광 현미경 및 유세포 분석으로 검출하는 방법을 양의 맥락막초세포에서 실시하는 기술입니다.

전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

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