전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

이 절차의 전반적인 목표는 녹색 형광 단백질을 발현하는 Mildy vs. No 바이러스의 감염성 클론을 증식시키고 검출하는 것입니다. 이 녹색 형광 단백질은 Myy Ner 바이러스 게놈의 D utp Ace 코팅 유전자에 클로닝되었습니다.

감염성 클론은 두 개의 플라스미드에 포함되어 있습니다. 첫째, myy Ner 서열을 포함하는 두 플라스미드를 xpa one 제한 효소로 절단한 후 연결합니다. 둘째, 구축물을 양 맥락총 세포에 형질전환합니다.

마지막으로, myy vino virus에 감염된 세포를 형광 현미경과 유세포 분석법으로 검출합니다. 안녕하세요, 저는 아이슬란드 대학교 TER 실험병리학 연구소의 Stefano Neron입니다. 오늘은 녹색 형광 단백질을 발현하는 my vascular virus의 감염성 분자 클론을 증식하고 검출하는 절차를 보여드리겠습니다.

분자 클론은 각각 12 kilobases와 4.5 kilobases 크기의 플라스미드 P eight XSP five EGFP 및 P six seven or에 포함되어 있습니다. 두 플라스미드의 등몰량, 즉 4.4 micrograms의 P eight XSP five EGFP와 1.6 micrograms의 P six seven or를 XPA one으로 절단한 후, 형질전환 전에 연결(ligate)합니다. 연결 반응이 완료되면 연결 혼합물을 65 °C에서 15분 동안 배양합니다. 형질전환 이틀 전에 10⁶개의 SCP 세포를 T 25 조직 배양 플라스크에 접종하고, 항생제가 없는 5 milliliter DMEM에 10% lamb serum과 2 millimolar glutamine을 첨가하여 세포가 90% 합류도(confluency)의 단일층을 이룰 때까지 이틀 동안 배양합니다.

이틀 후에도 세포의 합쳐짐(confluency)이 90%에 도달하지 않은 경우, 세포를 하루 더 배양합니다. 어린 양 혈청(lamb serum)은 소 태아 혈청(FBS)으로 대체할 수 있습니다. 다만, 일부 MVV 균주는 FBS에 의해 억제되므로 일반적으로 어린 양 혈청을 사용합니다.

하지만 이 MVV 균주는 FBS에 의해 억제되지 않습니다. 세포가 transfection 준비가 되면 배지를 항생제가 없는 1% lamb serum 또는 FBS가 포함된 DMEM으로 교체합니다. transfection에는 Lipofectamine 2000을 사용하며, DNA를 500 microliters의 opti MEM 배지에 희석하고 20 microliters의 lipofectamine 2000을 500 microliters의 opti MEM 배지에 희석한 후, 실온에서 5분 동안 방치합니다.

5분간 배양한 후, 희석된 DNA와 희석된 Lipofectamine 2000을 혼합하여 총 부피 1000 µL로 만듭니다. 가볍게 섞어 20~30분 동안 배양합니다. 실온에서, SCP 세포와 배지 혼합물이 들어 있는 T 25 플라스크에 형질전환 혼합물을 넣고 가볍게 흔들어 섞어줍니다.

37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1% serum, 2mM glutamine, 100 IU/mL penicillin 및 100 IU/mL streptomycin이 포함된 DMEM으로 배지를 교체합니다. 도립 형광 현미경을 통해 SCP 세포의 GFP 발현 여부를 관찰합니다.

이러한 일차 세포의 경우 일반적으로 5%에서 15% 정도의 낮은 형질전환 효율이 예상됩니다. 플라스크 내에서 바이러스가 확산될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 수일간 더 배양하십시오. 완전한 감염까지는 보통 7일에서 14일이 소요됩니다. 상층액을 에펜도르프 튜브에 분취하여 바이러스를 수확하십시오.

세포 파편을 제거하기 위해 마이크로 원심분리기로 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리합니다. 바이러스가 포함된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

-80°C에 보관된 3×10⁴개의 SCP 세포를 웰당 10% serum, 2mM glutamine, 100 IU/mL penicillin 및 100 IU/mL streptomycin이 첨가된 100µL의 DMEM 배지에 분주하여 배양합니다.

96-웰 플레이트에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양합니다. 다음 날 세포가 confluent 상태가 되면, 배지를 1% serum이 포함된 DMEM으로 교체합니다. 각 웰에 100 µL씩 넣은 후, 다음과 같은 방법으로 바이러스를 희석합니다.

96웰 라운드 바텀 또는 V 바텀 플레이트의 10개 웰씩 4개 군에 1% serum이 포함된 DMEM 180 µL를 각각 분주하여, 4회 반복(quadruplicate)의 10배 단계 희석을 준비합니다. 플레이트 첫 번째 열의 4개 웰에 각각 바이러스 20 µL를 첨가합니다. 그 다음, 4채널 피펫을 사용하여 상하로 피펫팅함으로써 샘플이 충분히 혼합되도록 합니다.

피펫 팁을 교체하고 20 µL를 다음 네 개의 웰에 순차적으로 옮깁니다. 음성 대조군으로 사용하기 위해 마지막 웰들에는 바이러스를 넣지 않고 비워 둡니다. 바이러스 희석액 100 µL를 SEP 세포와 배지가 들어 있는 인큐베이터에 추가합니다.

37 °C 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 2주 동안 GFP 형광과 세포변성효과(cytopathic effects)를 관찰합니다. 세포변성효과는 세포가 둥글게 변하고 돌기가 뻗어 나오며 정상 세포보다 투명도가 낮아지다가, 최종적으로 다핵 세포가 나타나고 세포 사멸로 이어지는 과정으로 구성됩니다.

바이러스 복제를 신속하게 모니터링하기 위해 Reid Munch 방법을 사용하여 바이러스 역가를 계산하십시오. 감염된 세포는 유세포 분석용 트립신을 사용하여 검사할 수 있습니다. 약 10⁵개의 감염된 세포를 관찰하십시오.

PBS로 한 번 세척한 후 500 µL의 PBS에 다시 부유시킵니다. 최종 농도가 2%가 되도록 4% Paraformaldehyde 용액 500 µL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

PBS로 5분씩 2회 세척한 후 fact scan 분석기로 분석합니다. 10,000개의 이벤트를 계수합니다. 본 연구에서 제시한 GFP 발현 바이러스 분자 클론은 in vivo 및 in vitro 모두에서 신경 바이러스의 바이러스-숙주 상호작용과 병원성을 분석하는 데 유용하게 활용될 수 있습니다.

본 연구의 뉴로바이러스가 인간 세포에 영향을 미칠 수 있다는 점이 입증되지는 않았으나, 세포와 플라스미드 모두 본 실험실에서 제공받을 수 있으므로 모든 생물 안전 등급(biosafety level) 주의 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.