Name: 피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 피부와 사지 뼈를 지배하는 말초 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 면역염색 기법을. 이 방법은 단백질 발현과 신경 분포 패턴을 시각화하여 말초 감각 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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그녀의 지속적인 도​​움을이 작품에서 건설적인 비판과 박사 도나 L. 해먼드, 우리는 공촛점 현미경 / 마우스 발바닥 펀치 생검 immunostaining의 이미징의 초기 표준화 그의 도움 박사 유리 M. Usachev 감사합니다. 이 작품은 NINDS / NIH (NS069898)에서 보조금 및 DPM에 국방 전립선 암 연구 프로그램의학과 (DOD - PCRP - 101096)에서 아이디어 개발 보조금 수상에 의해 투자되었다

1. 동물 재관류 이 연구에서 수행한 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을, 그리고 연구에 동물 사용에 대한 NIH의 지침을 따르 있습니다. <ol><li> 재관류 전날 4 ° C. 1 인산 버퍼의 L (더블 소주 H 2 O, pH를 7.4에서 0.2 M PB) 및 저장을 준비 이것은 재관류 후 - 고정 공정에 사용됩니다. </li><li> 30 초위한 유리 비커에 ddH 2 O의 전자 레인지 200 ML : 재관류 당일 (PFA, 산도 7.4) 0.1M PB에 4.0 %의 paraformaldehyde의 고정력있는 솔루션이 생쥐의 재관류에 대한 충분한 볼륨을 500 ML 준비 아니면 끓는 접​​근까지. 연기 후드 아래에 지속적인 교반과 함께 비커에 세분화된 paraformaldehyde 20 G (PFA)를 추가합니다. 드롭 현명하고 솔루션 나올 때까지 저어 5 N NaOH의 5 ML을 추가합니다. PFA가 완전히 해소되면, 실온 (RT)에 솔루션을 냉각. Slo지속적으로 교반하면서 wly 0.2 M PB 250 ML를 추가합니다. 점차적으로 약한 HCL 솔루션 (6 N 1 N 0.1 N)를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 500 ML 얼음에 진정 최종 볼륨을 조정합니다. 또한 얼음 ddH 2 O와 냉기의 1시 1분을 diluting하여 0.2 M 주식의 0.1 M PB 400 ML을 준비합니다. </li><li> 마취 (27G 바늘로 투여 pentobarbital 나트륨, 80 MG / kg)의 과다 복용의 intraperitonial 주입하여 마우스를 마취. </li><li> 재관류 동안, 0.1 M PB (ddH 2 O로 희석 0.2 M PB 주식 1:1) 및 PFA 150 ML의 50 ML는 마우스 순환에 순차적으로 전달됩니다. PB와 튜브를 작성 한 끝에 23 2분의 1 G 나비 바늘을 고정하여 연동 펌프를 설정합니다. 0.1 M PB가 들어있는 비커에 튜브의 다른 쪽 끝을 젖어. 튜브에 공기 거품이 없다는 것을 보장하기 위해 솔루션의 충분한 양의를 통해 10 ML / 분 연동 펌프의 속도, 그리고 펌프를 설정합니다. </li><li> 때까지 기다립니다nesthetized 마우스는 더 이상 같은 발가락 / 꼬리 핀치와 깜박 반사와 같은 반사 활동을 보여줍니다 않습니다. 퓸 배출 후드 안쪽까지 절개 트레이 복부 측면에 동물을 배치하고 테이프로 발 확보. 70 % 에탄올로 모피를 스프레이. 복부 벽의 ribcage과 최고의 분기를 노출하는 중간선을 따라 피부 절개를 통해하십시오. 그런 다음 ribcage의 기지에 복벽을 통해 했네요. 이 절개 후, 횡경막과 흉골의 하단부가 표시되어야합니다. 조심스럽게 폐에 손상되지 간병, 다이아 프램의 여백을 통해 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 가슴의 전체 길이를 따라 했네요. 이 단계에있는 흉골에서 약간의 출혈이 정상이며 재관류를 타협하지 않습니다. 일단 흉골을 따라 절개가 만들어되었으며 격막 컷, 그것은 심장이 노출되는 등 ribcage 위쪽과 바깥쪽, 각각의 절반을 리프트 수 있어야한다. 필요한 경우 폐 옆으로 이동합니다. ribcage 모두 반쪽 수 있습니다hemostatic 클램프의 사용이 위치에 개최됩니다. 동물의 긴 축에 평행하게 좌심실에 연동 펌프 3-4mm에 부착된 나비 바늘 (23 2분의 1 G), 넣습니다. 이 위치는 바늘이 dislodged되기의 위험을 최소화합니다. 반환 순환이 심장 밖으로 흐름 수 있도록 오른쪽 안뜰에 작은 절개를합니다. </li><li> 10 ML / 4-5 분 분 0.1 M PB로 재관류를 시작합니다. 이 시점에서 오른쪽 아트리움에서 냄새가 나는데 혈액의 상당량이 아직있다면 흐름이 명확 때까지 계속합니다. </li><li> PB의 흐름을 중단하고 4 % PFA 솔루션 연동 펌프의 입구를 전환합니다. 5 ML / 분 유량을 절감하고 20-25 분 PFA 솔루션을 펌핑 재개하십시오. PFA의 순환을 입력으로, 근육이 몇 분 후, 경련으로 가서, 동물은 말 그대로 위치에 "고정"됩니다. 이 강성은 동물에게 이동하지 돌보는, 부드럽게 hindpaws에 대한 밀어 테스트 수ND는 정맥을 이동시키다. 좋은 재관류는 응답 flexing에서 다리를 방지할 수 있습니다. PFA와 재관류가 완료되면, 정맥 및 hemostatic 클램프가 연결되고 그 시신이 조직 해부 준비하실 수 있습니다. 사용되는 절개 방식은 특정 조직에 따라 다릅니다. </li><li> 4퍼센트 PFA로 포화 picric 산 솔루션을 추가하여, 4퍼센트 PFA / 5 % (V / V) 피크르산 (단 발바닥 펀치의 수집 및 사후 고정을위한 PA)를 준비합니다. PA의 포함은 주변 장치의 연결을 티슈 1 항원 detectability를 대폭 향상 </li><li> 0.07 %의 글리세롤 15 %의 자당과 0.1 M PB에서 1​​0 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 뼈 / 연골 조직 decalcifying / cryoprotectant 솔루션을 준비합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 기반 솔루션은 epitopes 2 보존 반면 조직을 decalcify. </li><li> 0.1 M PB로 30 % 자당 - cryoprotectant 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 2. 조직 해부 / 제거, 후 고정 및 Sectioning <ol><li> 발바닥 펀치 perfu를 배치아래 커팅 매트 또는 기타 단단한 표면에 SED 동물 복부 쪽. 기슭의 중앙으로, 발을 발바닥이 표면 위로, 펀치 생검 도구 (해리스 마이크로 펀치, 테드 펠라 주식 3mm 직경)으로 단단히 눌러 개최. 생검 도구가 뒷다리 넘어 전체를 자르고 확인하기 위해 180도를 통해 앞뒤 생검 도구를 켭니다. 부드럽게 기슭에서 생검 도구를 제거하고 뚜껑과 멸균이 ML 튜브에 조직을 꺼내, 4% PFA / 5% PA 솔루션의 한 ML을 포함. </li><li> 사지 뼈 (대퇴골의 예) 둘 다 두 다리를 따라 아래로 계속, 골반의 수준에있는 동물의 뒷면을 따라 수평 절개를합니다. 골반과 대퇴골의 근위 머리는 그대로 둔 반면 골반에서 대퇴골을 분리하는 주위의 근육에 절단. 말초 머리를 유지하기 위해 경골 / 비골로 잘라 뼈 축에서 주변 근육 / 골막을 제거. 4퍼센트 PFA / 1 ML을 포함하는 2 ML 관에 몽둥이를 놓으십시오5% PA 솔루션입니다. </li><li> 4 16-18 H의 로커에서 부드러운 혼합으로 4퍼센트 PFA / 5퍼센트 PA 솔루션의 조직 샘플을 사후 수정 ° C </li><li> 다음과 같이 조직을 Decalcify : 발바닥 펀치 (기슭의 작은 뼈를 decalcify까지) 장소 뚜껑이있는 멸균이 ML 관의 조직 펀치는 0.07 %의 글리세롤과 15 0.1 M PB에서 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML을 포함하는 %의 자당. 4 16-18 H에 대한 약한 믹싱과 로커 ° C. 사지 뼈가 0.07 %의 글리세롤과 0.1 M PB에서 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML을 포함, 모자와 함께 멸균이 ML 튜브에 조직을 장소에 튜브를 놓고 15 % 자당. 4 6~7일 ° C.에 대한 약한 믹싱과 로커에 튜브를 놓고 decalcification 솔루션은 24 시간 포셉 한 쌍의과 강성 손실에 대한 모니터링 조직마다 변경해야합니다. </li><li> cryoprotectant 솔루션의 1.5 ML (0.1 M PB로 30 % 자당)와 뚜껑이있는 멸균이 ML 튜브에 조직을 전송하고, 로커 w에 튜브를 삽입4 16-18 H ° C.에 대한 ith 온화한 혼합 </li><li> sectioning을위한 조직을 준비 : 장소 침대 최적의 절삭 온도 볼륨 (-10 월) 그라 이오 스탯 조직 장착 블록에 대한 화합물 (사쿠라 Finetek 미국 주식) 및 (일반적으로 -20 ° C로 유지) 그라 이오 스탯 챔버에서 정지 수 있습니다. 극저온 에어로졸 (Cyto - 냉동, 제어 주식 회사 미국)도 냉동 과정을 가속 OCT에 뿌려놓은 수 있습니다. 장소 조직 OCT의 침대에 시료와 OCT의 추가 얇은 레이어와 커버. 그것이 강화된하고 내에서 조직이 냉동 때까지 부드럽게 극저온 에어로졸이 OCT를 스프레이. 장소 그라 이오 스탯 챔버에서 절단 머리에 표본 및 조직 표본 블록 절삭 온도 평형 수 있도록 - 적어도 1 시간. 퍼가기 화합물 아직 취성 섹션과 조직 손상에 너무 추운 결과 때 섹션 중입니다. </li><li> 일단 조직이 최적의 절삭 온도에 도달, 표본을 절단 시작 40 μm의 섹션을 생성합니다. </li><li>발바닥 펀치 10 MM 나트륨 azide와 0.1 M PB를 포함한 12 잘 조직 문화 접시에 cryosections를 수집합니다. 섹션은 4 ° C.에이 솔루션에 빠져들 남아 있는지 확인 섹션은 최대 4~6개월에 immunostaining 목적으로이 방식으로 저장할 수 있습니다. 또는, 자유 부동 섹션은 -20 ° C (500 ML 0.1 M PBS, pH를 7.2, 30g의 자당, 10g PVP40 300 ML의 에틸렌 글리콜)에서 cryoprotectant 솔루션 무기한 저장할 수 있습니다. ) 증류수로 1L에 최종 볼륨을 조정 3. 사지 뼈는 젤라틴 사전 코팅 슬라이드 (또는 Superfrost에 직접 cryosections 수집을 위해 또한 슬라이드, 피셔 과학) 및 -20 ° C.에 저장하기 전에, 1 H를위한 공기 건조 수 이런 방식에 저장된 슬라이드에 뼈 부분은 2~3개월 이내에 목적을 immunostaining 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 감각 신경 섬유에 대한 조직 섹션의 Immunostaining 3.1. 발바닥 펀치섹션 - 부동 섹션 염색법 <ol><li> 면도날을 사용하여 1 ML micropipette 팁의 마지막 6~7밀리미터를 잘라. (이것은 팁의 벽에 조직 섹션의 고집 억제) 0.1 M PB 여러 번에 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 aspirating하여 끝 사전 조건 내부. 24 잘 조직 문화 판으로 물들일 수 발바닥 펀치 섹션을 전송합니다. 일반적으로 80-10 섹션은 여러 가지 고품질 섹션 immunostaining 당 생성되도록 잘 따라 얼룩이되어야합니다. </li><li> 0.1 M PB 500 μl 당 자에 대한 활발한는 RT에서 로커에 혼합 5 분과 발바닥 펀치 섹션을 씻으십시오. 두 번 더 반복합니다. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 1 H의 로커에서 부드러운 혼합과, 10 % 염소 혈청 및 0.3 % Triton은 0.1에 X - 100 M PB (사람마다 잘 솔루션을 차단 500 μl)의 구성, 솔루션을 차단에 발바닥 펀치 섹션을 품어 4 ° C. </li><li> 차단 솔루션을 취소하고 기본 antibo의 조직 섹션을 품어4 로커에서 부드러운 혼합과 18-24 H 250 μl 차단 솔루션에 희석 다이 / 항체 ° C. 조사의 실험 요구 사항, 하나의 immunolabeling (특정 단백질이나 신경 섬유 마커에 대한 하나의 기본 항체와 함께) 또는 더블 immunolabeling (두 단백질이나 신경 섬유 마커에 대한 두 가지 기본 항체 포함)에 따라 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다. 이중 immunolabeling을 수행하는 동안 다른 면역 글로불린 G (IgG) isotypes (예 :의 단클론 항체를 정화, 또는 사용하는 두 가지 기본 항체가 (예 : 쥐 한마리와 토끼에서 제기된 하나의 제기) 다른 호스트 수종에 제기되었는지 확인하는 것이 중요하다, 또는 한 IgG1 하나 IgG2a)을 사용할 수 있습니다. 과도한 증발을 피하기 위해 야간 incubations에 대한 Parafilm과 번호판을 봉인하는 것이 좋습니다 좋습니다. 말초 감각 신경 섬유를 얼룩하기​​ 위해서는 몇 가지 특정 항체를 사용할 수 있습니다. 단백질에 대한 항체 neurofilament 200 (NF200, 시그마)는 라벨 고맙다을GE - 직경 섬유, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP, 시그마) 반면, 및 과도 수용체 잠재적인 vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) 라벨 peptidergic, 작은 직경 주변 감각 섬유. 모든 말초 신경 섬유는 β3 - tubulin에 대한 항체 물들일 수 있습니다. 피부에서 콜라겐 IV (Abcam)은 진피에서 표피를 분리 지하 막을 윤곽을 그리다하는 데 사용됩니다. 일반적으로 항체는 일반적으로 μg / ML 50-10의 작동 농도에서 교양 셀 기반 immunofluorescence assays에 대한보다 집중 50-10 번해야합니다. </li><li> 차단 용액 500 μl (트리톤 X - 100) 당 잘에 대한 RT에서 로커에서 활발한 혼합과 5 분과 조직 섹션을 씻으십시오. 3 번 이상 반복합니다. </li><li> 4 로커에서 부드러운 혼합과 함께 적절한 형광단 - 복합 차 항체 (일반적으로 용액 500 μl를 차단에 1:1000 희석)에서 세탁 솔루션 및 품어 조직 섹션 ° C.을 삭제하시겠습니까 플레이트 뮤스t는 fluorophores의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일에 싸여 있습니다. </li><li> 차단 솔루션마다 잘에 대한 RT에서 로커에서 활발한 혼합과 10 분 500 μl와 조직 섹션을 씻으십시오. 다음 RT 10 분 활발한 혼합과 0.1 M PB 500 μl로 씻으십시오. 마지막으로, RT 10 분 활발한 혼합과 0.05 M PB 500 μl로 씻으십시오. </li><li> FBS - 대우 팁 (끝부분 6-7mm를 잘라)으로 1 ML의 micropipette를 사용 SuperFrost로 조직 문화 플레이트와 전송에서 섹션을 기음 플러스 현미경 슬라이드. 섹션을 정렬하고 좋은 붓을와 함께 여분의 세척 버퍼를 흡수. 빛에 장시간 노출을 피하십시오. 섹션 슬라이드 (50-30 분)에 대한 섹션을 건조 수 있도록, RT에있는 슬라이드를 품어. </li><li> 설치 매체 (ProLongGold, Vectashield 또는 이와 유사한 것)의 몇 방울을 적용, 천천히 섹션에 유리 coverslip을 넣으십시오. 슬라이드 5 분 어둠에 앉아서, 다음 투명 손톱으로 coverslip의 가장자리를 밀봉하도록 허용폴란드어. 15-20 분 공기 건조 수 있습니다. 슬라이드 지금은 형광의 큰 손실없이 몇 년 동안 시각 또는 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3.2. 사지 뼈 부분 -에 - 슬라이드 염색법 <ol><li> 슬라이드는 -20 ° C 저장에서 RT로 돌아갈 수 있습니다. 소수성 장벽 펜 (슈퍼 아빠 액체 차단 펜, 테드 펠라 주식 회사)를 사용하면 솔루션의 풍부한 레이어 물들일 수 뼈 섹션을 포함하는 슬라이드 영역을 제한하다. 10-15 분 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 5 분 슬라이드 당 0.1 M PB 250 μl와 뼈 섹션을 깨끗이 씻어 2 번 이상 반복하십시오. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 10 % 염소 혈청과 4에서 1 H를 위해 0.3 % Triton은 0.1에 X - 100 M PB (슬라이드 당 솔루션을 차단 250 μl) ° C. 구성, 솔루션을 차단의 뼈 부분을 품어 </li><li> , 차단 솔루션을 취소하고 기본 항체 (또는 차 항체의 조합에 뼈 부분을 품어 경우로 3.1.4 아래 언급된 두 immunolabeling의) 4시 18-24 H 250 μl 차단 솔루션 ° C.에 희석 이것은 슬라이드가 기본 항체 솔루션의 건조 방지하기 위해, 밀폐 뚜껑이있는 humidified 챔버에 배치해야합니다 매우 중요합니다. 말초 감각 신경 섬유를 얼룩하기​​ 위해서는 (섹션 3.1.4 참조) 항체의 세트 위에서 언급한는 유사한 작업 농도와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> RT 15 분 슬라이드 당 차단 솔루션을 250 μl (트리톤 X - 100)로 조직 섹션을 깨끗이 씻어 3 번 이상을 반복. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 4 적절한 형광단 - 복합 차 항체 (일반적으로 차단 솔루션, 250 μl의 1:1000 희석)의 뼈 부분을 품어 ° C. 얼룩 챔버는 fluorophores의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일에 싸여 있어야합니다. 편의를 위해, 그것은 어두운 색 얼룩의 회의소 (예 : 슬라이드 배양 트레이 / 상자 RPI 주식 회사)를 사용하는 것이 바람직하다. </li><li> WRT 15 분 슬라이드마다 솔루션을 차단 250 μl와 재가 뼈 부분. 다음 RT 15 분 0.1 M PB 500 μl로 씻으십시오. 마지막으로, RT 15 분 0.05 M PB 500 μl로 씻으십시오. ddH 2 O에서 수영을 잠시는 슬라이드를 씻어 후 공기 건조 (50-30 분)에 뼈 부분을 허용하기 위해 RT에서 부화. 빛에 장시간 노출을 피하십시오. </li><li> 설치 매체 (ProLongGold 또는 이와 유사한 것)의 몇 방울을 적용하고 천천히 섹션에 유리 coverslip을 넣으십시오. 슬라이드 5 분 어둠에 서서, 그리고 투명 매니큐어로 coverslip의 가장자리를 밀봉합시다. 15-20 분 건조 수 있습니다. 슬라이드는 형광의 손실없이 몇 년 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 4.1. 발바닥 펀치 섹션 발바닥 펀치 조직 섹션은 10X, 40X 또는 63X 목적으로 공촛점 현미경 또는 epifluorescence 현미경 시각하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 표피 - 피부 교차점에서, 연골과 근육에 지하 점막에 콜라겐 IV 항체 (녹색)와 얼룩 광고 보여줍니다. 수많은 CGRP - (AB, 빨강)와 NF200 - 긍정적인 섬유 (CD, 빨간색)은 발바닥 지역에서 마우스 피부 (화살표)를 통해 배포됩니다. (; 적색 F​​)를 중심으로도 (; 화살촉 녹색) CGRP - 양성 작은 ​​직경의 섬유에 국한됩니다 TRPV1 얼룩이 반면, β3 - tubulin은 팬 -의 연결 마커 (E, 레드)입니다. A와 C는 10X 목표 (스케일 바 -500 μm의)에서 찍은 epifluorescence 이미지되며 B, D, E와 F는 60X 목표 (규모에 따라 2 μm의 단위에서 찍은 11 이미지 Z - 스택에서 생성된 공촛점 이미지 합성 아르 바 - 50 μm의). 4.2. 사지 뼈 섹션 사지 뼈 조직 섹션도 epifluorescence 현미경, 또는 공촛점 microscop 아래에서 시각 수 있습니다10X, 40X 또는 63X 목적으로 전자. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> ., 안티 - NF200 (CD, 빨강, 화살표), 안티 - β3 - tubulin (E, 적색) 및 안티 TRPV1 (F, 적색) 공동 묻은, 그림 2는 안티 CGRP (화살표 AB, 빨강)과 immunostaining 보여줍니다 안티 CGRP 항체와 함께 (녹색, 화살표). 이러한 이미지는 마우스 대퇴부의 해면 머리 지역에있는 뼈 매트릭스에 걸쳐 분산 감각 신경 섬유의 subtypes을 보여줍니다. A와 C는 10X 목표 (스케일 바 -500 μm의)에서 찍은 epifluorescence 이미지되며 B, D, E와 F는 60X 목표 (규모에 따라 2 μm의 단위에서 찍은 11 이미지 Z - 스택에서 생성된 공촛점 이미지 합성 아르 바 - 50 μm의).

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 마우스 피부 immunostaining 및 주변 감각 신경 섬유의 검출을위한 뼈 조직 섹션의 준비를위한 방법을 상세있다. 발바닥 펀치 biopsies에서 생산 섹션 모두 glabrous와 털이 피부를 포함하는이 프로토콜은 모든 피부 타입에 사용할 수 수있다는 것을 의미합니다. 이 기술은 또한 (예 : leukocytes, 혈관 endothelia 다른 중에서 평활근)이 조직에서 다른 세포 유형을 얼룩이 고용 수 있습니다. 이러한 방법은 우수한 최적의 ultrastructural 보존 간의 타협 (글루 타 알데히드 고정에 의해 달성될 수 있지만 자주 epitopes 및 감소 immunostaining의 얼룩 품질 장애의 결과) 및 immunocytochemical detectability, 엄격한 방식으로 절차가 뒤에있다면 단계별로 제공합니다. 이러한 조직의 감각 신경 섬유의 탐지, 주변 neurite의 파생물의 규정에 대한 우리의 이해에 도움과 4 돋...

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 3mm 해리스 마이크로 펀치 </td><td> 자료 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 15,094 </td><td></td></tr><tr><td> 재관류 펌프 </td><td> 자료 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> 피크르산 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 239,801 </td><td></td></tr><tr><td> OCT의 삽입 화합물 </td><td> 시약 </td><td> 조직 테크 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto - 꼼짝마 극저온 에어로졸 스프레이 </td><td>자료 </td><td> 제어 회사 </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 세럼 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Immunostaining을위한 인큐베이션 트레이와 덮개 (대형) </td><td> 자료 </td><td> RPI 주식 회사 </td><td> 248270 (트레이) 248270 - A (뚜껑) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge 소수성 장벽 펜 </td><td> 자료 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H - 4000 </td><td></td></tr><tr><td> 낙타 헤어 브러쉬 (# 1 두께) </td><td> 자료 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 11,859 </td><td></td></tr><tr><td> 프로 롱 골드 매체를 마운트 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

피부와 사지 본즈 innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 immunostaining

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

말초 감각 신경 섬유에 의해 감지 및 물리적, 화학적 및 열 감각 자극의 기본 처리는 동물과 인간의 감각 지각의 열쇠입니다. 이러한 말초 감각 신경 섬유는 특정 감각 자극을 감지하고 시작 수용체 및 이온 채널 단백질의 과다를 표현한다. 방법은 다음과 섬유에서 특정 이온 채널 단백질의 기능 표현을 식별할 활용할 수 피부를 innervating 말초 감각 신경 섬유의 전기적 특성을 특징 사용할 수 있습니다. 그러나, 유사한 electrophysiological 방법을 사용할 수 없습니다 (또한 개발하기가 어렵습니다) 같은 뼈으로 가장 어려운 조직을 포함하여 다른 내장 기관을 innervating 말초 감각 신경 섬유에있는 수용체와 이온 채널 단백질의 기능 표현의 검출을위한. 또한, 그러한 electrophysiological 방법은 아닌 고르기 단백질의 표현을 결정하는 이용 수 없습니다말초 감각 신경 섬유에의. 따라서, 감각 신경 fivers을위한 주변 기기 / 내장 조직 샘플 immunostaining이 신경 섬유에 대한 관심의 특정 단백질의 표현을 결정하는 최선의 방법을 제공합니다. 지금까지, 감각 뉴런의 단백질 표현 연구의 대부분은 정보가 특정 유형이나 감각 신경의 일부의 세포 본문에 특정 단백질의 표현에 제한됩니다 감각 신경에 절차를 immunostaining 활용했습니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 주변 / 내장 조직 샘플의 준비에 대한 자세한 방법 / 프로토콜을보고합니다. 우리 피부 발바닥 펀치 생검 및 뼈 (대퇴골) 말초 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 생쥐에서 섹션의 준비를 위해 특별히 세부 방법. 이러한 방법은 주변 감각 뉴런의 단백질 표현의 질적 결정에만 주요되지뿐만 아니라위한 양적 분석 방법을 제공감각 섬유의 특정 유형 또는 하위 집합의 단백질 발현 수준의 변화를 결정뿐만 아니라, 여러 병적인 상태 동안 감각 섬유의 수와 밀도의 형태학의 및 / 또는 해부 학적 변화를 결정하십시오. 또한, 이러한 방법은 감각 신경 섬유의 얼룩에 국한되지 않은, 또한 피부, 뼈 및 기타 내장 조직에있는 신경 섬유의 종류 얼룩 사용할 수 있습니다.

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

말초 감각 신경 섬유에 의한 물리적, 화학적 및 열적 감각 자극의 검출 및 1차 처리는 ...에서의 감각 인지에 핵심적입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 피부 및 뼈와 같은 조직에 분포하는 말초 신경 섬유의 해부학적 구조뿐만 아니라 특정 단백질의 발현 및 국소화 프로파일에 대한 통찰을 얻는 것입니다. 이는 먼저 고정액으로 전신 관류를 수행한 후, 관심 조직을 박리 또는 제거함으로써 달성됩니다. 다음으로, 분리된 조직을 후고정하고 뼈를 탈칼슘화하며, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 피부 및 뼈 조직의 미세 절편을 제작하여 슬라이드에 부착합니다.절차의 마지막 단계는 말초 신경 섬유에 특이적으로 발현되고 국소화된 단백질에 대한 항체를 사용하여 이러한 조직 절편의 단일 또는 다중 표지 면역 염색을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 이용한 면역 형광 현미경 검사를 통해 특정 유형의 말초 신경 섬유의 분포 패턴뿐만 아니라 말초 신경 섬유 내 특정 단백질의 발현 및 국소화 패턴을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 피부 및 뼈와 같은 조직에서 신경 침범 패턴은 어떠한가와 같은 말초 신경계에 관한 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다.이러한 접근 방식은 내장 기관 및 기타 조직으로 확장될 수 있습니다. 또한, 이러한 감각 신경 섬유의 하위 집합 내 단백질 발현의 변화와 이러한 단백질의 발현 과정에서 발생할 수 있는 변화에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 병리학적 또는 발달 과정 동안, 4% PFA로 관류된 동물을 커팅 매트나 다른 견고한 표면 위에 놓고 뒷발에서 조직 샘플을 수집합니다.발의 바닥면이 위를 향하도록 잡고, 발 중앙에 3mm 펀치 생검 도구를 배치하여 강하게 누릅니다. 생검 도구를 180도 방향으로 앞뒤로 돌려 도구가 발 전체를 관통하여 절단했는지 확인합니다. 발에서 생검 도구를 조심스럽게 제거하고, 조직을 1mL의 4% PFA 또는 5% PA 용액이 들어 있는 멸균된 2mL 튜브에 배출하여, 이 경우 대퇴골에서 사지 뼈 샘플을 수집합니다.골반 높이에서 동물의 등 쪽을 따라 양쪽 뒷다리까지 이어지는 외측 절개를 실시합니다. 대퇴골의 근위두는 온전하게 남겨둔 채, 골반과 주변 근육을 절개하여 대퇴골을 골반에서 분리합니다. 다음으로, 경골 또는 비골을 절개하여 원위두를 온전하게 남기고, 뼈의 간질(shaft)에서 주변 근육과 골막을 제거합니다.대퇴골을 4% PFA 또는 5% PA 용액 1 mL가 들어 있는 2 mL 튜브에 넣고, 로커(rocker)에서 부드럽게 혼합하며 4°C에서 16~18시간 동안 후고정합니다. 후고정 후, 두 샘플을 1.5 mL의 탈칼슘화 용액이 들어 있는 멸균 2 mL 튜브로 옮겨 탈칼슘화합니다. 발바닥 펀치 샘플은 4°C에서 16~18시간 동안 부드럽게 흔들어 주고, 대퇴골은 6~7일 동안 둡니다.24시간마다 용액을 교체하고, 탈석회화 후 핀셋으로 골 조직을 확인하여 강직도 손실 여부를 모니터링합니다. 조직 샘플을 1.5 mL의 Cryoprotectant 용액이 들어 있는 멸균 2 mL 튜브로 옮긴 후, 튜브를 다시 로커에 올려 4°C에서 16~18시간 동안 부드럽게 혼합합니다. 절편 제작을 위해, 크라이오스탯 조직 마운팅 블록에 적정량의 optimal cutting temperature compound를 도포하고 -20°C의 크라이오스탯 챔버 내에서 동결시킵니다.원하는 경우, 냉동 과정을 가속화하기 위해 OCT에 극저온 에어로졸을 분사하십시오. 족저 펀치 조직의 경우, 조직 표본을 OCT 베드 위에 배치하십시오. 골 조직의 경우, 균일한 횡단면을 얻을 수 있도록 표본을 배치하십시오.뼈의 길이에 따라 세로 방향으로 절편을 얻을 수 있도록 표본을 배치합니다. 두 표본 모두에 OCT 층을 얇게 추가로 덮습니다. 그다음 조직이 얼 때까지 극저온 에어로졸을 조심스럽게 분사합니다.검체를 크라이오스탯 챔버의 절단 헤드 위에 놓고, 조직 절편이 부서지는 것을 방지하기 위해 조직 검체 블록을 절단 온도에서 최소 1시간 동안 평형 상태로 둡니다. 조직이 최적 온도에 도달하면, 발바닥 펀치 조직을 위해 40 micron 두께로 검체 절단을 시작합니다. 절단된 냉동 절편을 10 millimolar sodium azide가 포함된 0.1 molar PB가 들어 있는 12-well 조직 배양 플레이트에 수집합니다.절편이 계속 잠겨 있도록 확인하고, 골 조직의 면역 염색을 실시할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 동결 절편을 젤라틴 코팅 슬라이드에 직접 수집한 후, 1시간 동안 자연 건조시키고 -20°C에서 보관하십시오. 이렇게 보관된 슬라이드 상의 골 절편은 2~3개월 이내에 면역 염색 용도로 사용할 수 있습니다.면도날을 사용하여 1 mL 마이크로 피펫 팁의 끝부분에서 6~7 mm를 잘라냅니다. 조직 절편이 팁 벽면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 0.1 M PB에 희석된 1% 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)을 여러 번 흡입하여 팁 내부를 사전 처리합니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 8~10개의 발바닥 펀치 절편을 옮깁니다. 그 다음, 실온에서 로커(rocker)를 이용해 강하게 섞으며 웰당 500 µL의 0.1 M PB로 5분씩 3회 세척합니다.다음으로, 절편을 블로킹 용액에 넣고 4°C에서 가볍게 섞어주며 1시간 동안 반응시킨 후, 1차 및 2차 항체 반응을 순차적으로 진행합니다. 마지막으로 pb로 세척한 후, FBS 처리된 새로운 트리밍 마이크로 파이펫을 사용하여 절편을 슬라이드로 옮깁니다. 붓을 이용해 절편을 정렬하고, 빛에 노출되지 않도록 주의하며 남은 수분을 흡수시킵니다.절편이 표면에 건조되도록 슬라이드를 상온에서 5분에서 30분 동안 배양합니다. 건조가 완료되면 마운팅 용액(mounting medium)을 여러 방울 천천히 가합니다. 절편 위에 유리 커버슬립을 덮습니다.슬라이드를 5분 동안 암소에 둔 다음, 투명 매니큐어로 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다. 실온에서 해동한 슬라이드를 이미징하기 전, 소수성 배리어 펜을 사용하여 슬라이드 상의 뼈 절편이 포함된 영역을 둘러싸고 10~15분 동안 공기 중에서 건조합니다. 피펫을 사용하여 해당 영역 내에 0.1 M PB 250 µL를 가하고 5분 동안 뼈 절편을 세척합니다.슬라이드를 기울여 PB를 따라내고 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 다음으로, blocking solution 250 µL를 처리하고 절편을 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다. blocking 후, 1차 및 2차 항체 배양을 진행하며, 하룻밤 동안 배양할 때는 슬라이드를 습윤 챔버에 보관해야 합니다.마지막으로, 0.05 molar PB 500 µL로 15분 동안 세척합니다. 실온에서 슬라이드를 증류 탈이온수에 짧게 담가 헹궈낸 후, 빛에 장시간 노출되지 않도록 주의하며 뼈 절편을 실온에서 5~30분 동안 자연 건조시킵니다. 마운팅 용액을 도포하고, 슬라이드를 암소에서 5분 동안 방치한 후 유리 커버슬립을 절편 위에 덮습니다.에피 형광 현미경(epi fluorescent microscopy)을 사용하여 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 여기서 다수의 CGRP 및 NF 200 양성 섬유가 발바닥 부위의 표피-진피 접합부 기저막 전체에 걸쳐 분포된 붉은색 영역으로 관찰되며, 기저막은 항-콜라겐 4(anti collagen four)로 녹색으로 염색되었습니다. 발바닥 부위의 CGRP 및 NF 200 양성 섬유는 화살표로 표시된 바와 같이 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해서도 다시 붉은색으로 확인할 수 있습니다. 한편, 범-뉴런 마커인 베타 3 튜불린(beta three tubulin)은 발바닥 부위에 널리 발현되어 있습니다.TRPV1 염색은 주로 CGRP 양성인 소경 섬유에 국한되어 나타나며, CGRP와 NF200 모두 양성인 섬유 또한 사지 골조직에서 검출될 수 있습니다. 여기서는 에피 형광 및 공초점 현미경을 사용하여 생쥐 대퇴골의 해면골 두부 영역 내 골기질 전체에 적색으로 분포된 것을 보여줍니다. TRPV1은 또한 사지 골조직에 존재하며, 여기서는 공초점 현미경을 통해 적색으로 나타나며 녹색의 anti-CGRP와 공국소화(co-localize)됩니다.이 영상을 시청한 후, 피부 및 뼈와 같은 조직 내 말초 감각 신경의 해부학적 특징뿐만 아니라, 이러한 감각 신경 섬유 내 다양한 단백질의 발현 및 국소화에 대한 통찰력을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 해부부터 현미경 분석까지의 전 과정은 피부의 경우 약 4일, 뼈 조직의 경우 약 11일이 소요됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 뇌 절편의 Meynert 영역의 핵 기저부에 있는 콜린성 섬유의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 절편을 차단하고 콜린 아세틸전이효소에 대한 1차 투여한 후 비오틴화된 2차 항체를 투여합니다. Avidin-biotin-peroxidase 복합체가 추가되어 2차 항체에 결합한 다음 발색 기질에 결합합니다. 그런 다음 단면을 탈수하고 장착한 후 현미경으로 시각화합니다.

마우스 뇌의 Meyner의 핵 기저부에서 신경 섬유의 면역조직화학적 염색

출처: Boyer, N. P. et. al., 절제된 마우스 경골 신경에서 신경필라멘트 수송의 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2020)  이 비디오는 분석을 위한 형광 광활성화 방법을 보여줍니다. 말초 신경의 수초화된 축삭돌기에서 neurofilament 수송. 광활성화 녹색 형광단이 부착된 신경필라멘트를 추적함으로써 이 기술은 신경퇴행성 질환의 축삭 수송에 대한 통찰력을 제공합니다.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons(수초화된 마우스 축삭돌기에서 신경필라멘트 수송의 형광 광활성화 이미징) 

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다.

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여기에서는 스티릴 피리디늄 염료로 염색 및 탈색하는 동안 마우스, 귀 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말뚝 말단의 살아있는 피침형 감각 말단을 이미징하기 위한 새로운 준비에 대해 설명합니다.

의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 귀 피부

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이 논문은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경을 외과적으로 제거하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 원위 조직 표적에서 교감신경 분포의 역할을 조사하기 위한 다양한 연구를 용이하게 할 것입니다.

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피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

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