피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 피부 및 뼈와 같은 조직에 신경 분포를 제공하는 말초 신경 섬유에서 특정 단백질의 발현 및 국소화 프로파일뿐만 아니라 해부학적 조직에 대한 통찰력을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 고정제로 전체 동물 관류를 수행한 다음 관심 조직을 해부 또는 제거함으로써 수행됩니다. 다음으로, 분리된 조직을 postfix로 하고 뼈를 저온 유지 장치를 사용하여 석회질을 제거하며, 피부와 뼈 조직의 미세한 부분을 생성하여 슬라이드에 장착합니다.

절차의 마지막 단계는 말초 신경 섬유에서 특이적으로 발현되고 국소화된 단백질에 대한 항체로 이러한 조직 절편을 단일 또는 다중 라벨 면역 염색을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, epi 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용한 면역형광 현미경을 통해 말초 신경 섬유에서 특정 단백질의 발현 및/또는 국소화 패턴뿐만 아니라 특정 유형의 말초 신경 섬유의 분포 패턴을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 접근 방식은 피부와 뼈와 같은 조직의 혁신 패턴이 무엇인지와 같은 말초 신경계에 대한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

그리고 이 접근법은 내장 기관 및 기타 조직으로 확장될 수 있습니다. 또한 감각 신경 섬유의 이러한 하위 집합 내에서 단백질의 발현 변화와 이러한 단백질의 발현에서 발생할 수 있는 변화에 대해 알려줄 수 있습니다. 병리학적 또는 발달 과정 중에 4%PFA가 관류된 동물을 절단 매트나 기타 견고한 표면에 놓고 뒷발에서 조직 샘플을 채취합니다.

발바닥 표면이 위를 향하도록 발을 잡고 발 중앙에 위치한 3mm 펀치 생검 도구로 단단히 누릅니다. 바이옵시 도구를 앞뒤로 180도 돌려 바이옵시 도구가 발 전체를 절단했는지 확인합니다. 발에서 생검 도구를 부드럽게 제거하고 1ml의 4%PFA 또는 5%PA 용액이 들어 있는 멸균된 2밀리리터 튜브로 조직을 배출하여 대퇴골에서 사지 뼈 샘플을 수집합니다.

골반 높이에서 동물의 등을 따라 양쪽 뒷다리를 따라 아래로 내려갈 수 있는 측면 절개를 만듭니다. 골반과 주변 근육을 절개하여 대퇴골과 골반을 분리하고 대퇴골의 근위두는 그대로 둡니다. 다음으로, 경골이나 비골을 절개하여 원위두를 그대로 두고 골간에서 주변 근육과 골막을 제거합니다.

1밀리리터의 4%PFA 또는 5%PA 용액이 들어 있는 2밀리리터 튜브에 대퇴골을 넣은 다음 두 샘플을 섭씨 4도에서 16-18시간 동안 로커에서 부드럽게 혼합하여 접붙이기로 둡니다. 고정 후 두 샘플을 1.5ml의 석회질 제거 용액이 들어 있는 멸균 2밀리리터 튜브로 옮겨 석회질을 측정합니다. 발바닥 펀치는 섭씨 4도에서 16-18시간 동안, 대퇴골은 6-7일 동안 부드럽게 흔들립니다.

24시간마다 용액을 교체하고 석회질 제거 후 한 쌍의 집게로 뼈 조직의 강성 손실이 있는지 모니터링합니다. 조직 샘플을 1.5ml의 동결 보호 용액이 담긴 멸균 2밀리리터 튜브에 옮기고 튜브를 로커에 다시 올려 놓고 섭씨 4도에서 16-18시간 동안 부드럽게 혼합합니다. 절단을 위해 조직을 준비하려면 저온 유지 장치 조직 장착 블록에 최적 절단 온도 화합물의 베드 부피를 놓고 섭씨 영하 20도의 저온 유지 장치 챔버에서 동결합니다.

원하는 경우 OCT에 극저온 에어로졸을 분사하여 동결 과정을 서두르십시오. 발바닥 펀치 조직을 위해 OCT 침대에 조직 표본을 놓습니다. 뼈 조직에 대해 균일한 횡단면을 얻을 수 있도록 표본을 배치합니다.

뼈 길이에 대해 세로로 뻗어 있는 단면을 얻기 위해 시편을 배치합니다. 두 표본을 OCT의 얇은 층으로 덮습니다. 그런 다음 조직이 얼 때까지 극저온 에어로졸을 부드럽게 분사합니다.

저온 유지 챔버의 절단 헤드에 표본을 놓고 조직 표본 블록이 부서지기 쉬운 부분을 피하기 위해 최소 1시간 동안 절단 온도와 평형을 이루도록 합니다. 조직이 최적의 온도에 도달하면 표본을 절단하여 발바닥 펀치 조직을 위한 40미크론 절편을 생성합니다. 0.1몰 PB와 10밀리몰 아지드나트륨을 포함하는 12개의 웰 조직 배양 플레이트에서 극저온 절편을 수집합니다.

절편이 물에 잠겨 있는지 확인하고 뼈 조직에 대한 면역 염색이 준비될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 극저온 절편을 젤라틴 사전 코딩된 슬라이드에 직접 모은 다음 섭씨 영하 20도에서 보관하기 전에 1시간 동안 자연 건조시킵니다. 이러한 방식으로 보관된 슬라이드의 뼈 절편은 2-3개월 이내에 면역 염색 목적으로 사용할 수 있습니다.

면도날을 사용하여 1ml 마이크로 피펫 팁의 끝에서 6-7mm를 절단하여 0.1몰 PB에서 1%의 소 태아 혈청을 여러 번 흡인하여 팁 내부를 전처리하여 조직 섹션이 팁 벽에 달라붙지 않도록 합니다. 8-10개의 발바닥 펀치 절편을 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 그런 다음 웰당 0.1몰 PB의 500마이크로리터로 실온의 로커에서 격렬하게 혼합하여 5분 동안 세 번 세척합니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하여 차단 용액의 절편을 배양한 다음 1차 및 2차 항체 배양을 계속합니다. pb로 최종 세척한 후 새로운 FBS 처리된 트리밍된 마이크로 피펫을 사용하여 섹션을 슬라이드로 옮깁니다. 붓으로 섹션을 정렬하고 빛에 노출되지 않도록 여분의 수분을 흡수합니다.

5-30분 동안 표면 위에서 섹션을 건조시키기 위해 슬라이드를 실온에서 배양합니다. 건조되면 장착 매체를 몇 방울 떨어뜨리고 천천히 바르십시오. 섹션 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.

슬라이드를 5분 동안 어둠 속에 두었다가 투명 매니큐어로 커버 슬립 가장자리를 밀봉합니다.실온에서 슬라이드를 해동한 후 이미징하기 전에 소수성 장벽 펜을 사용하여 뼈 부분이 포함된 슬라이드의 영역을 둘러싼 다음 10-15분 동안 자연 건조합니다. 피펫 사용. 해당 부위에 0.1몰 PB 250마이크로리터를 바르고 5분 동안 뼈 부분을 씻습니다.

슬라이드를 기울여 PB를 빼내고 두 번 더 반복합니다. 다음으로, 250마이크로리터의 차단 용액을 바르고 섭씨 4도에서 1시간 동안 섹션을 배양합니다. 차단 후, 1차 및 2차 항체 배양으로 진행하여 하룻밤 배양을 위해 슬라이드를 가습된 챔버에 보관해야 합니다.

마지막으로 500마이크로리터의 0.05몰 PB로 15분 동안 세척합니다. 실온에서 증류된 탈이온수에 잠시 담가 슬라이드를 헹구고 뼈 부분을 실온에서 5-30분 동안 자연 건조시켜 빛에 장기간 노출되지 않도록 합니다. 장착 매체를 적용하고 슬라이드를 5분 동안 어둠 속에 두었던 후 유리 덮개 슬립을 섹션에 놓습니다.

epi 형광 현미경을 사용하여 매니큐어로 커버 슬립 가장자리를 밀봉합니다. 수많은 CGRP 및 NF 200 양성 섬유가 발바닥 영역의 표피 피부 접합부의 기저막 전체에 분포된 빨간색 영역으로 여기에서 볼 수 있으며, 이는 녹색으로 안티 콜라겐 4로 염색되었으며, 발바닥 영역의 CGRP 및 NF 200 양성 섬유는 화살촉으로 표시된 대로 빨간색으로 다시 표시된 컨포칼 현미경을 사용하여 볼 수도 있습니다. 범 신경 마커 베타 3 튜불린은 발바닥 영역에서 널리 발현됩니다.

TRP V one 염색은 주로 CG RRP 양성인 작은 직경의 섬유에 국한되며, CGRP 및 NF 200 양성 섬유는 모두 사지 뼈 조직에서 검출될 수 있으며, 여기에 표시된 바와 같이 epi 형광 및 컨포칼 현미경을 사용하여 적색 마우스 대퇴골의 해면상 머리 부위의 뼈 매트릭스 전체에 분포되어 있습니다. T RRP V one은 사지에도 존재합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 빨간색으로 표시된 뼈 조직과 녹색의 anti CGRP와 함께 공동 국소화합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 피부 및 뼈와 같은 조직에서 말초 감각 혁신의 해부학적 특징과 이러한 감각 신경 섬유 내에서 다양한 단백질의 발현 및 국소화에 대한 통찰력을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 해부에서 현미경 분석에 이르는 전 과정은 피부의 경우 약 4일, 뼈 조직의 경우 11일이 소요됩니다.