Name: 조직 문화에 대한 손상 소의 꼬리 척추 디스크의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 학습하세요 소 꼬리 척추 디스크 분리 및 제트 세척을 통한 조직 배양 준비 방법을. 이 기술은 생체 반응기에서 기계적 하중 연구를 위한 완전한 디스크 절편을 확보하여 세포 생존율을 유지합니다.

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이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단 (SNF # 310030-127586/1)에 의해 지원되었다.

1. 척추 디스크 착취 <ol><li> 피부의 존재가 오염의 가능성 (그림 2) 증가 이후 전체 길이 소 꼬리는 피부없이 가능한 경우, 로컬 도살장에서 얻은 것입니다. </li><li> 대형 절단 보드를 준비하고 도마 (그림 2)의 상단에 살균 작업 스테이션과 악기를 준비합니다. </li><li> 멸균 층류 후드 멸균 거즈 아래의 준비는 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened과 6 잘 플레이트의 각 우물에 넣어. </li><li> 분지를 준비하고 수돗물로 1:100 Betadine 솔루션을 희석. </li><li> 5 분 1 % Betadine 솔루션을 포함 분지 전체 소 꼬리 젖어. </li><li> 간단히 건조 멸균 거즈와 꼬리 및 살균 작업 스테이션에 배치하십시오. </li><li> 조심스럽게 메스 블레이드 # 22 꼬리 주위 근육을 제거합니다. </li><li> 필요하지 않다 꼬리 부분, 비교적 크고 아주 작은 포함된 꼬리 일반적으로 양쪽을 잘라 거리IVDs (그림 3). </li><li> 메스 블레이드 # 10을 사용하여 IVD 주위 더욱 근육과 힘줄을 낸다. 디스크의 바깥 고리를 잘라하지 조심. </li><li> 외과 피부 마커와 IVD의 앞쪽에 표시 (이 단계는 선택 사항입니다, 우리의 생물 반응기의 축 회전의 중심을 결정하는 데 도움). </li><li> 부드럽게 꼬리를 이동하여 IVD와 척추의 연결 지점을 찾습니다. 메스 블레이드의 지루한 면을 IVD와 뼈 사이의 국경을 느낍니다. cleaving 사이트는 척추쪽으로 IVD의 거리 1-2mm해야합니다. 장소 지정이 cleaving 사이트 (그림 4)에서 산업 블레이드 홀더했다. </li><li> 사용자 정의 - 만든 산업 블레이드 홀더 (그림 3)의 위에 망치질로 다니엘 IVD 및 척추골. </li><li> IVD - 척추골 연결의 반대편에 반복합니다. </li><li> 랩은 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened 멸균 거즈로 IVD 격리. </li><li> 원하는 샘플 숫자 (보통 6 주변 수있는 IVDs의 절연을 계속) 10-20mm 사이의 직경이 수확됩니다. </li><li> 멸균 Lactated 울리는의 솔루션으로 제트 세척 시스템 (짐머, INC.) 연결, 5L 가방 (또는 멸균 PBS 또는 0.9 % 생리 식염수) 유용한 사이즈입니다. </li><li> 짐머 Pulsavac 제트 세척 시스템 (그림 1C)을 사용 포셉 및 endplate 표면의 제트 세척 양측으로 IVD 잡아. 제트 총 30 사이의 각도로 endplate 표면에 주사한다 - 60 °의 각 면에 약 30 초. (Figs. 1, 7) </li><li> 제트기가 다른 디스크 샘플을 세척하는 동안 6 잘 플레이트와 포장에 다시 IVDs 올려 것은 거즈를 moistened. </li><li> IVDs는 장기 문화와 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 세포 생존 능력, 기계 로딩, 장기 문화) (그림의 1D)에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 대표 결과 성공적인 척추 디스크 준비를 판단하는 성과 측정 확산 실험을 할 수있는 작은 분자량 형광 염료 (예 : procion 빨간색)PBS 2 1 %의 솔루션으로 준비가되어 있습니다. IVD 그러면 최소한 100 염료 솔루션의 ML과 염료가 다음 자유 팽창에 따라 24 시간을위한 IVD에 수동적으로 확산하기 위해 허용과 함께 보관됩니다. IVD 다음 액체 질소 플래시 - 냉동 및 객실 온도와 아세톤 전송 시리즈 (첫번째 -80에 ° 다음 C, -20 ° C, 후 4 ° C 마침내 실온에 미리 냉각에 의한 탈수로 다시 데려 ). 디스크 다음 폴리 - 메틸 아크릴 레이트 (PMMA)에 포함된 및 100 μm의 두께 섹션을 생산하기 위해 날카로운 칼날로자를 수 있습니다. 이 섹션은 다음 표준 brightfield 현미경으로하지만, 우선적으로 procion 빨간색은 빨간색 형광 (Figs. 5-6)를 방출 이후 형광 현미경의 사용으로 볼 수 있습니다. 뼈다귀 표면 trabeculi은 제트 lavaging 단계 (그림 7) 후 매우 깨끗하게 나타납니다. 성공적인 장기 문화에 대한 매개 변수 오염, 유지 세포 생존의 모든 부재 (Figs. 8-9), 디스크 높이의 첫 번째이며,histological 섹션 및 safranin O / 빠른 그린 얼룩이나 마이어의 Hematoxilin 3 측정 전체 "디스크 무결성". 우리는 살아 디스크 조직을 얼룩과 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 및 라이브 / 죽은 얼룩 키트 (분자 프로브, Invitrogen, 바젤, 스위스)를 사용하여 3D에서 세포 생존 능력을 검사하는 다른 4,5 출판 프로토콜 및 매크로를 개발했습니다. 우리는 더 이상 3D 조직이나 NIH ImageJ 플랫폼 4-6을 사용하여 3D 통신사 셀 가능성을 추정 계산 자동 세포를 수행하기 위해 매크로와 루틴을 개발했습니다. 대체 프로토콜 pronase 및 collagenase 형식을 사용하여 세포외 기질의 연속 소화를 사용하여 초기 소화하여 디스크 세포의 세포 생존을 결정하는 2 다음 세포 현탁액 7 얼룩이 제안되었습니다. 프로토콜의 이전 버전은 PBS 전에 디스크의 수확 기관 세제곱 후 10 분에 대한 열 배는 더 집중 페니실린 / 스트렙토 마이신 농도를 포함에 인큐베이션 단계를 참여lture. 이 단계 culturing을 위해 도움이 것 때문에 제트 세척 단계이 단계는 쓸모됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 방법론 단계의 개요 그대로 endplates와 뼈의 얇은 레이어 (1-2밀리미터)와 소 coccygeal 척추 디스크를 준비합니다. 척추 디스크 (IVD) 및 영양 경로의) 도식보기. B) 절차 블레이드 - 홀더 정의와 산업 날카로운 칼날로 IVD을 했구요. C) 제트 세척 단계 높은 세포 생존을 보장하고 endplates와 양쪽에 부착 뼈 1-2하셔야 지키는 영양 교환을 활성화합니다. D) 마지막 IVD은 생물 반응기의 표본 챔버에서 교양 수 있습니다 또는 다운 스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2 TOP :. 전체 길이 신선한 소 꼬리 (이상 obta높은 세포 생존을 보장하기 위해 사후 2-3시간 이내 ined. 하단 : 뼈다귀 endplates (EP)과 척추 단체 (VB) 사이의 성장 플레이트 (GP), 골화의 보조 중심의 존재를 보여주는 육개월 주변의 세 소 꼬리 X - 선 이미지. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3.) 도구 무균 조건 하에서 소 꼬리를 해부하다 있습니다. B) 맞춤형 블레이드 - 홀더에 척추 디스크를 깎다가 행동에 소 꼬리에서 운동의 세그먼트 아웃 컷. 표준 산업 블레이드 (Lutz, 독일)와 블레이드 홀더 - 사용자 정의의 C) 측면 - 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 그리기와 운동의 세그먼트를 잘라 cleaving 사이트를 설명하는 주변 근육과 인대를 제거 후 소 꼬리 그림. 부분 척추골은 WI를 "금이"이어야합니다사용자 정의 만든 블레이드 홀더 회 이상 1~2mm 떨어진 연골 endplates에서 전체 뼈 표면을 보장합니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 전에 제트 세척 단계의 효과적인 세척의 데모 (A)과 후 (B). 분사 절차 후 척추 디스크 세그먼트의 깨끗한 뼈다귀 표면을 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 성장 판으로 차단 효과를 보여주는 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 확산 실험. 의 디지털 X - 레이 화살보기 2 후에도 연골과 뼈가 endplate와 coccygeal 소 척추​​ 디스크 explant 통해 성장 판과 화살 컷의 뼈 형광 현미경 이미지의 두 번째 레이어를 포함한 IVD4h 무료로 확산. GP : 성장 플레이트, 2ndry CO : 골화 중심의 보조. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 실험, 제트 세척 치료의 효과를 보여주는 청소. 치료 (오른쪽) 제트 lavaged 치료하지 않고 제트 세척 치료 (왼쪽) 제어 측면을 받았습니다 ~ 1.5 mmthick 뼈다귀 엔드 플레이트와 excised 소 IVDs의 화살 굵은 부분 (~ 100mm). 입구는 스프레이 짐머 상처 debridement 시스템에서 사용되던 패턴 1 % procion의 빨간색으로 소 척추​​ 디스크 explants의 24 시간 무료로 확산 실험.을 보여줍니다 <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 공촛점 이미징 스택의 예측의 라이브 / 죽은 이미지 (250μm) bovin에서 촬영한E 척추 디스크 세그먼트는 핵 pulposus (NP), 내부 고리를 fibrosus (IA)과 바깥 고리 fibrosus (OA)에 각각 0, 14 일 무료 팽창에 따라 보관이 제트 세척 방법으로 준비했습니다. ethidium homodimer - 1에 의해 스테인드 calcein AM (아세틸 methylester)에 의해 스테인드 = 라이브 세포, 붉은 세포가 = 죽은 세포의 핵 그린 세포. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 9"> 그림 9. 살아있는 조직을 3 차원 스택 검사에 대한 현미경을 검색 공촛점 레이저를 사용하여 척추 디스크의 세포 생존 능력. 자유 팽창 상태에서 21 일 문화를 통해 본질 Pulposus (NP)와 고리 섬유증 (AF)의 세포 생존 능력. (± SEM, N = 6 평균) 통계 차이가 아닌 파라메 트릭 Kruskal - 월리스는 그룹 간의 순위 합 테스트를 체결 사용하는 테스트되었습니다. 중요한 차이점은 21 일 NP 다른 모든 시간 지점 사이에 발견되었다. AF 중요한 차이점에 일 7 일 사이 찾을 수있는 동안일 0. (* P &lt;0.05, ** P &lt;0.01).

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<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

성공적인 장기 문화에 대한 첫 번째 단계는 explant가 오염해서는 안됩니다 있는지 확인하는 것입니다. 당신이 절차를 시작하기 전에 꼬리는 피부해야합니다. 무균 실험실로 데려 모든 동물의 머리는 오염의 측면에서 문제가 될 수 있습니다. 소 꼬리가 이상 (이것은 초기 세포 생존에 영향을 미치는) 가능한 신선해야합니다. 또한 betadine의 세척 단계는 더욱 오염의 위험을 줄이기 위해 권장합니다. 대신 척추 본체에서 IVD를 구분하기 위해 사용자 정의 - 만든 블레이드 홀더와 망치를 사용하는, 이것은 histological bandsaw을 (깎다 다이아몬드 블레이드가 PBS 또는 울리는 솔루션으로 냉각한다)를 사용하여 수행할 수 있습니다. bandsaw, 샘플 홀더 및 절단 칼날은 멸균되어야한다는주의. 기술 여기서 보여주는 소 꼬리 IVD 고립에 국한되지지만 같은 돼지의, 양의와 토끼 꼬리 또는 요추 IVD 절연과 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다. IVD H에 대한척추 프로세스가 존재하는 지역의 arvest, 먼저 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td colspan="4"> 지역 도축 하우스 (이상적으로 시간 사후 이내에 피부없이)에서 소 꼬리에서 신선한 소 척추​​ 디스크 조직. </td></tr><tr><td> Pulsavac 플러스 AC 시스템 </td><td> 짐머 INC., 스위스 </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> 힙합 스프레이 머리와 AC 전원 공급 장치와 함께 최고의 성능 (8 AA 배터리 팩이 하나도 작동하지만, 덜 편리 않습니다) </td></tr><tr><td> 고용량 팬 스프레이 W / 플래쉬 실드, 12.7cm 길이 </td><td> 짐머 INC., 스위스 </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> 사용 가능한 여러 가지 스프레이 헤드가 있습니다, 우리는 성공적으로이 테스트를 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 22 # 10 </td><td> 스완 - 모트영국에 </td><td> # 10 : 0201 # 22 : 0208 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 블레이드 홀더 # 3와 # 4 </td><td> Hausmann, 독일 </td><td> # 3 : 06.103.00 # 4 : 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz 산업 블레이드 </td><td> Lutz, 독일 </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 </td><td> Invitrogen, 스위스 </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM) </td><td> Gibco, 스위스 </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated 울리는의 솔루션 (포도당 제외) </td><td> Bichsel, 스위스 </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 멀티 잘 플레이트 </td><td> TPP, 스위스 </td><td> 92,006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine 용액 </td><td> Mundipharma, 스위스 </tD&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 피부 마커 </td><td> Pore​​x 외과, 스위스 </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> 대형 절삭 보드 </td><td></td><td></td><td> 모든 브랜드는 가능합니다 </td></tr></tbody></table>

조직 문화에 대한 손상 소의 꼬리 척추 디스크의 준비

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

척추 디스크 (IVD)는 척추에 척추를 연결하는 척추 관절입니다. 그것은 척추의로드를 전송하고 척추에 유연성을주는 기능을 수행합니다. 그것은 세 가지 구획의 작성할 : 환대 fibrosus (AF), 그리고 양쪽의 척추 기관에 NP와 AF를 연결하는 두 연골 endplates에 의해 포함한 내면 핵의 pulposus (NP)를. 아마도 퇴행성 척추 디스크 질환 (DDD)와 디스크 herniations에 의한 Discogenic 고통은 우리의 현대 사회의 주요 문제로 확인되었습니다. IVD 변성 가능한 메커니즘을 연구하기 위해, 라이브 디스크 세포로 체외 장기 문화 시스템에서 매우 매력적입니다. 그대로 소 coccygeal IVDs의 체외 문화가 잘 제어 생리학 및 기계적 환경에서 메카 - 생물 학적 측면의 연구를 수있는 관련 모델 시스템으로 고급하고 있습니다. 소의 꼬리 IVDs가 높은 숫자를 비교적 쉽게 구할 수 있습니다D 세포 밀도, 세포 인구 및 크기와 관련하여 인간의 허리 IVDs 매우 유사합니다. 영양 경로가 명백하게 응고된 피가에 의해 차단된 이후 단, 연골이 endplates 및 뼈다귀 endplates을 유지 이전 소 꼬리 IVD 수확 기술 문화 1-2 일 후에 실패했습니다. IVDs 가장 큰 avascular 장기 있으며, 따라서 NP에있는 세포에 영양분은 인접 척추 신체에서 모세관 꽃봉오리를 통해 확산에 전적으로 의존하고 있습니다. endplate 표면에 뼈 파편과 응고된 피가의 존재는 디스크와 손상 세포 생존의 중심에 영양 보급을 저해 수 있습니다. 우리 그룹은 오염에 대한 낮은 위험 아웃 꼬리에서 IVDs을 &quot;균열&quot;에 비교적 빠른 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 혈전 및 절단 부스러기를 제거하고 매우 효율적으로 영양 보급 경로를 다시 태어난다 수술 제트 세척 시스템을 사용하여 갓 컷 뼈다귀 endplate 표면을 permeabilize 수 있습니다IVD의 중심 있습니다. 척추 뼈 양쪽에 성장 플레이트의 존재는 피할 수 있으며, 문화 이전에 제거할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 준비 중에 중요한 단계를 설명합니다 무료 붓기 문화에 따라 14 일 동안 높은 세포 생존을 유지하는 성공적인 장기 문화의 열쇠를 보여줍니다. 문화 시간은 적절한 기계적 환경 기계 로딩 생물 반응기를 사용하여 유지 수있을 때 확장할 수 있습니다. 기술 여기서 보여주는 등 돼지의, 양의와 토끼 꼬리와 허리 IVD 격리와 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다.

이 프로토콜은을 위해 장기 문화에 대한 coccygeal 소 척추​​ 디스크 수확 기술을 보여줍니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 장기 문화.

추간판(IVD)은 척추뼈와 척추뼈를 연결하는 척추의 관절입니다. 이는 척추의 하중을 전달하고 ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 배양 및 기타 후속 응용 단계(본 사례의 경우, 복합 기계적 하중을 이용한 바이오리액터 내 추간판 배양)를 위해 소 꼬리에서 손상되지 않은 추간판을 준비하는 것입니다. 먼저 송아지 꼬리를 소독한 후 근육을 제거하여 뼈와 추간판 구조가 명확히 보이도록 합니다. 그다음, 맞춤형 절단 도구를 사용하여 양측에 2~3 mm 정도의 부분 척추뼈가 부착된 상태로 단일 추간판을 절단합니다.세 번째 단계는 제트 세척 시스템(jet lavage system)을 사용하여 추간판의 골 표면을 세척하는 것이며, 이를 통해 glucose와 같은 작은 용질이 추간판 중심부까지 확산되도록 합니다. 마지막 단계는 추간판을 안정화 완충액에 넣거나 멸균 거즈로 감싸 후속 응용 단계 전까지 습윤 상태를 유지하는 것입니다. 최종적으로, 이 절차의 성공 여부는 추간판 배양 시작 14일 또는 21일 후에 생사 염색(live dead stain)을 사용하여 살아있는 세포의 존재 여부를 확인함으로써 평가합니다.다음 프로토콜은 역전 가능한 디스크 분절을 장기 배양을 위해 보존하는 방법을 보여주며, 이는 메카노바이올로지와 조직 공학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 소 꼬리 디스크가 조직 공학에서 일종의 모델 시스템이 된 데에는 타당한 이유가 있습니다. 우선, 세포 밀도가 인간의 수핵 디스크와 매우 유사하며 매우 낮기 때문입니다.둘째로, 해당 세포 집단에는 척삭 세포가 없으며, 이는 인간의 상황과 매우 유사합니다. 셋째로, 크기와 생화학적 조성 또한 인간의 상황과 매우 유사합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람은 뼈 끝판(bony endplate)과 척추뼈를 구별하기 어렵기 때문에 고전할 수 있으며, 따라서 연골 성장판의 존재를 확인하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.우리는 개별 배양을 위해 엔드플레이트가 포함된 가역적 디스크를 분리할 수 있는 빠르고 무균적인 기술을 찾던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 절단 부위가 골판에서 단 1mm 떨어진 곳에 위치하여 찾기 어렵기 때문에 이러한 방법들을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저, 지역 도축장에서 소 꼬리 전체를 확보하십시오.이상적으로는 사후 4시간 이내의 꼬리를 사용해야 하며, 피부를 제거한 상태로 수집해야 합니다. 피부가 있으면 오염 가능성이 높아지므로, 해부 과정에 사용되는 모든 기구가 멸균 상태인지 확인하십시오. 또한, 작업 표면에 오토클레이브 멸균 처리된 커팅 보드를 배치하여 멸균 작업 공간을 조성하십시오.그 다음, 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 55 millimolar sodium citrate가 포함된 0.9% 멸균 염화나트륨 용액으로 멸균 거즈 한 조각을 적십니다. 적신 거즈 조각을 6-웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 이어서, 깨끗한 대야에 수돗물로 희석한 1:100 Betadine 용액을 채우고 꼬리를 해당 용액에 5분 동안 담급니다.침지 후 꼬리를 꺼냅니다. 멸균 거즈로 짧게 건조시킨 후 멸균 작업대에 놓습니다. 먼저 20번 또는 22번 메스를 사용하여 꼬리 주변의 근육을 제거합니다. 그 다음 기요틴을 사용하여 꼬리의 불필요한 부분, 주로 상대적으로 크거나 매우 작은 추간판이 포함된 근위 및 원위 말단을 잘라내어 제거합니다.그 다음 10번 메스를 사용하여 추간판 주변의 근육과 건을 다듬습니다. 필요한 경우 추간판의 외측 섬유륜을 절단하지 않도록 주의하십시오. 방향 표시를 위해 외과용 피부 마커를 사용하여 추간판의 전면을 표시합니다.다음으로, 꼬리를 조심스럽게 움직여 추간판과 척추의 연결 지점을 찾습니다. 메스 날의 뭉툭한 면을 사용하여 추간판과 뼈 사이의 경계선을 채웁니다. 그런 다음, 추간판에서 척추 방향으로 1~2mm 떨어진 절단 부위를 찾습니다.특수 제작된 산업용 칼날 홀더를 절단 부위에 배치합니다. 이 도식은 절단 부위를 매우 명확하게 보여줍니다. 특수 제작된 산업용 칼날 홀더의 윗부분을 망치로 두드려 추간판과 척추뼈를 절단합니다. 그런 다음 칼날 홀더를 추간판-척추뼈 연결부의 반대편으로 이동시킨 후, 추간판-척추뼈 연결부의 이쪽 면을 망치로 두드려 추간판을 분리합니다.그 다음, 55 millimolar sodium citrate가 포함된 0.9% sodium chloride로 적신 멸균 거즈를 사용하여 추간판을 빠르게 분리합니다. 원하는 수의 추간판을 얻을 때까지 이 과정을 반복합니다. 일반적으로 꼬리 하나에서 직경 10 to 20 millimeters의 추간판을 약 6개 정도 얻을 수 있습니다.모든 가역 디스크를 수확한 후, 제트 세척 시스템을 3리터 용량의 멸균 젖산 링거액, 멸균 PBS 또는 0.9% 멸균 식염수 백에 연결합니다. 그런 다음 핀셋으로 가역 디스크를 잡고, 제트 세척기를 종판 표면에 대해 30~60도 각도로 유지하면서 종판 표면의 양면을 각각 30초 동안 제트 세척합니다. 이 이미지는 제트 세척의 세척 효과를 보여줍니다. 위쪽 행의 디스크는 세척 전의 가역 디스크를 나타내며, 아래쪽 행은 세척 후의 동일한 디스크를 나타냅니다.첫 번째 추간판 세척이 완료되면, 다른 추간판들을 세척하는 동안 이를 젖은 거즈로 감싸 둡니다. 세척 후 추간판은 장기 배양을 위한 준비가 완료된 상태가 됩니다. 또한, 층류 후드 내에서 작업하는 동안 추간판 준비의 성공 여부를 확인하기 위해 확산 실험을 수행할 수 있습니다.디스크당 5% fetal calf serum이 포함된 멸균 DMEM 배양액 40 milliliters를 준비합니다. 배양액을 비커로 옮긴 후, 단일 추간판을 배양액에 침전시킵니다. 비커를 37 °C 및 5% carbon dioxide로 설정된 조직 배양 인큐베이터 내의 쉐이킹 플랫폼 위에 놓습니다.추간판은 이러한 방식으로 약 14일 동안 배양할 수 있습니다. 이렇게 맞춤 제작된 시료 챔버를 사용하면 적절한 기계적 하중이 유지되어 배양 기간을 연장할 수 있습니다. 먼저, 이전과 동일하게 추간판당 5% fetal calf serum이 포함된 멸균 DMEM 배양액 40 milliliters를 준비합니다.다음으로, 가역 디스크를 맞춤 제작된 배양 챔버 중 하나에 넣고 갓 준비한 배지 40 milliliters를 추가합니다. 클린벤치 내에서 챔버를 닫습니다. 맞춤 제작된 검체 챔버를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.디스크의 표면적에 따라 챔버에 무게추를 추가합니다. 먼저, 추간판 한 개당 PBS에 용해한 proso red와 같은 형광 염료의 1% 용액 100 milliliters를 준비합니다. 그다음 디스크를 해당 용액에 담그고 동일한 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.배양 후 자유 팽창 배양(free swelling culture)을 위해, 디스크를 액체 질소로 급속 냉동시킨 다음 -80 °C 아세톤에 담급니다. 그다음, -20 °C, 4 °C, 그리고 마지막으로 상온의 아세톤에서 각각 24시간 동안 배양하여 추간판의 온도를 서서히 상온으로 되돌립니다. 디스크가 상온으로 복원되면, 표준 절차에 따라 1~2주 동안 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate)에 완전히 매립합니다.완전히 매립되면, 디스크를 날카로운 칼로 절단하고 그라인더로 연마하여 처리합니다. 처리가 완료되면, 디스크 전체에 걸친 pro cy red의 확산을 현미경으로 평가할 수 있습니다. 이 이미지들은 자유 팽윤 확산 실험의 결과를 보여줍니다.패널 C는 본 연구의 방법으로 두 뼈 끝판을 준비한 가역 디스크의 X선 개요도를 보여줍니다. 위쪽은 성장판을 제거하지 않은 상태로 형광 현미경 하에서 촬영되었습니다. gp로 표시된 성장판의 존재로 인해 적색 형광 염료의 확산이 차단된 것을 볼 수 있으며, 이는 연골 끝판과 가역 디스크의 더 깊은 층으로 염색되는 것을 막는 장벽 역할을 합니다.성장판은 co로 표시된 1차 및 2차 골화 중심 사이에 위치합니다. 성장판이 성공적으로 제거되었다면, 적색 형광 염료가 np로 표시된 추간판 수핵까지 방해 없이 확산될 수 있습니다. 이 이미지들은 제트 세척 치료의 세정 효과를 보여줍니다.시상면 절편의 두께는 약 100 microns이며 골성 종판의 두께는 약 1.5 millimeters입니다. 여기에서 추간판은 제트 세척(jet lavage) 처리를 받았으며, 종판 전체에 걸쳐 염료의 확산이 관찰됩니다. 반면, 제트 세척 처리를 하지 않은 대조군 측에서는 염료가 잘 확산되지 않습니다.여기 제트 세척법으로 준비하고 자유 팽창 조건에서 유지한 소의 가역성 디스크 분절에서 촬영한 live/dead 공초점 현미경 이미지가 있습니다. nucleus pole process는 np, 내측 섬유륜은 IA, 외측 섬유륜은 oa로 표시되었습니다. 녹색 영역은 calcium acetyl methyl ester로 염색된 살아있는 세포이며, 적색 영역은 ethidium homodimer-1로 염색된 죽은 세포의 핵입니다. 동일한 부위의 이미지들은 자유 팽창 조건 하에 14일이 지난 후에도 녹색 형광으로 표시되는 다수의 생존 세포가 남아 있음을 보여줍니다.이 그래프는 21일의 배양 기간 동안 추간판의 수핵 및 섬유륜 부위의 세포 생존율을 나타내며, 6개 샘플에 대한 평균 결과와 표준 오차를 표시합니다. 표시된 바와 같이, 그룹 간의 통계적 차이는 비모수적 Wilcoxon signed rank sum 검정을 사용하여 테스트되었습니다.핵수핵(nucleus pulsus)에서는 21일째와 다른 모든 시점 사이에 유의미한 차이가 발견된 반면, 섬유륜(annulus fibrosis)에서는 7일째부터 0일째 사이에 유의미한 차이가 발견되었습니다. 이 절차를 통해, 기계적 하중, 영양분 또는 성장 인자가 이러한 퇴행 또는 재생의 진행에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 배양 조건을 수정할 수 있습니다. 본 프로토콜은 수확 기술을 가속화하여 조직 공학적 접근법, 생리학적 측정 또는 기계생물학적 연구에 활용 가능한 해석 가능한 디스크 분절을 얻을 수 있게 합니다. 기존 방법에서는 조직학적 밴드소(bandsaw) 또는 베어링 기술을 사용하며, 이는 본 프로토콜보다 약 2시간 더 소요됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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