Name: Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 Drosophila 태아에서 활성 키네신을 분리하고 정제하는 방법을 단일 분자 생물물리학 연구에 활용하세요. 미세소관 중합 및 ATP 매개 방출 기법을 통해 기능성 모터 단백질을 확보할 수 있습니다.

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크리스 Ngai이 프로젝트들의 지원과 도움 제이슨 델 리오에 대한 특별 감사합니다. 이 작품은 RO1 SPG에 부여 GM070676에 의해 지원되었다.

파리의 변종이 구입하여 실험실에서 증폭하실 수 있습니다. 받은 Drosophila 문화 튜브의 크기에 따라 하나는 자주 일단 튜브가 최대 용량에 도달했습니다, 문화 튜브를 '뒤집기'해야합니다. 약 50 Drosophila 문화 튜브가 채워진까지 확대가 계속됩니다. 한 후 (컵 만들기 들아 다음 섹션에서 논의된다) 100 ML tricorn 비커로 '컵 비행을'있습니다. 24 시간 이내에, 아래쪽에 부착된 플라이 음식이 컵에서 종자 새로운 Drosophila 문화 유리병에 배아를 사용합니다. 실온에서 하룻밤 배아에서 전체 재배 파리에 Drosophila의 배아의 성장 시간은 약 8.5 일 수 있습니다. 씨앗을 품고 배아는 첫 번째 애벌레 단계로 12~15시간 후에 부화. 유충 약 4 일 부화 후 24 및 48 시간에, 두 번째 및 세 번째 애벌레 단계로 두 번 털갈이를 위해 성장. 애벌레 다음 pupariums로 캡슐과 T에서 신흥까지 4 일간의 변형에 제출후계자 pupal 가지 경우 1. 각 파리의 양을 증가 Drosophila 문화 유리병에 세 할 약 일간 더 성장하실 수 있습니다. 400 튜브가 채워진 경우, 50 달걀 누워 컵 (잔 당 약 1,000여 파리)에 대한 파리 충분한 양의있을 것입니다. 파리들은 새로운 환경에 적응하는데 시간이 필요합니다. 그것은 보통 종이컵에 전송 후, 컬렉션에 대한 준비를 그들을 위해 이틀 정도 걸립니다. 일일 한천 번호판을 교체하는 것은 파리가 더 오래 살 수있는 파리 컵 깨끗하게 유지됩니다. (Drosophila 관리 및 증폭에 대한 이해를 들면, DB 로버츠 'Drosophila를 참조하십시오 : 실용 접근법 2). Drosophila의 배아의 대량 취득하는 좋은 소스가 상업적으로 사용할 수있는 인구 케이지 3입니다. 인구 케이지의 조립 및 유지 보수는 책에 Drosophila Melanogaster에 제 5 장 및 7에서 볼 수 : P세포 및 분자 생물학 4 ractical 용도. 그러나 인구 연습장은 비싼이며 유지 관리가 어렵다. 인구 케이지는 파리의 풍부한 양을 저장할 수 있기 때문에 이산화탄소의 사용은 파리를 전송하고 먹이가 필요합니다. 전에 언급한 바와 같이, 이산화탄소뿐만 누워 말라고의 원인, 파리의 건강을 감소시킵니다. 작은 규모에, 100 ML tricorn의 비커를 사용할 수 있습니다. 쉰 100 ML의 비커로 dechorionated 배아의 9g을 획득 수 있습니다. 위해서는 우리가 서로 다른 메쉬 크기로 이중 계층 체의 포수를 만들었 죽은 파리, 미사용 효모 붙여넣기 및 기타 불순물을 제거합니다. 죽은 파리와 같은 하나의 체 트랩 원하지 않는 자료 배아는 (350 마이크론 기공 크기)를 통과하도록 허용하는 동시에. 두번째 부분은 메쉬 통과하게된다 Drosophila의 배아 및 기타 불순물을 잡는 의미 메쉬 (120 미크론의 기공 크기)를 포함합니다. 1. 컵 준비 및 배아 컬렉션 들아 <ol><li> 뒤집기빈 플라스틱 약병을 여러 개의 튜브에서 증폭 파리가까지 파리의 양은 유리병의 높이 1 인치에 도달했습니다. 다음 100 ML 계란 컬렉션 컵 (나일론 메쉬 창문 tricon의 비커)에 그 파리를 전송합니다. 파리를 전송할 때 파리의 탈출을 방지하기 위해 하드 표면에 잔을 도청 유지. 한천 플레이트가 들어있는 효모 페이스트와 컵 커버 및 안정화 시간은 24-48 시간을 허용합니다. </li><li> 쉰 플라이 컵에서 하룻밤 한천 플레이트를 수집하고 깨끗한 페인트 브러시 및 실행 물을 사용하여 체의 포수로 접시의 내용을 씻는다. 육체는 모든 효모 페이스트는 물이 가득한 체의 배아를 씻겨 때까지. </li><li> 3 분 동안 50 %의 표백제에 그들을 immersing하여 청소 배아를 Dechorionate. </li><li> 배아 표백제 냄새 느슨한까지 광범위하게 증류수로 씻어. 그런 다음 AC 접이식 수건으로 여러 번 그것을 배치하여 배아와 메쉬를 건조시키십시오. 깨끗한 유리병에 배아를 전송하고 체중을 기록합니다. &lt;/ 리&gt; </li></ol> 2. 배아 균질화 및 명시 <ol><li> 얼음처럼 차가운 추출 버퍼의 1.5 X 볼륨으로 다운스 호모 지 나이저에 dechorionated 배아를 놓습니다. </li><li> 느슨한 유봉과 함께 5 스트로크를 해. 깨끗한 원심 분리기 튜브로 나누어지는 homogenate합니다. 40 분 동안 15,000g에서 원심 분리기. 4에 ° C. </li><li> 위쪽 흰색 지질 층 또는 낮은 펠렛없이 맑은 뜨는 액체를 조심스럽게를 수집합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브를 청소하고 30 분 동안 50,000g에서 원심 분리기에 뜨는 전송합니다. 4에 ° C </li><li> 위에서 설명했던 것과 같이 수집된 결과 고속 뜨는 즉시 사용할 수 또는 개월간 냉동 및 -80 ° C에 저장된 스냅이 될 수 있습니다. </li></ol> 3. 미세 소관의 중합 및 Kinesin 바인딩 <ol><li> 실내 온도에 냉동 고속 뜨는을 녹여. , microtubules을 중합 GTP (0.3 ㎜)와 taxol (20 μm의) 추가하고 20 분 동안 실온에서 부드럽게 선동하려면회전 흔드는. </li><li> kinesin을 바인딩하려면 회전 통에 상온에서 10 분 교반 다음에 2.5 밀리미터 nonhydrolyzable ATP 아날로그 5'-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP)를 추가합니다. </li></ol> 4. Microtubules 및 Kinesin의 차동 침강 <ol><li> 30 분 대한 2만3천그램 (sw41ti 로터, TLS-55)에서 원심 분리하여 동일한 볼륨 자당 쿠션 (추출 버퍼에 20 % 자당 및 10 μm의 제품 taxol)를 통해 침전물. 4에 ° C. </li><li> 10 μm의 제품 taxol 75 MM NaCl을 포함한 추출 버퍼에 원래 homogenate 볼륨의 10 %에 resuspension하여 펠렛 씻으십시오. </li><li> 단계 4.1에서와 같이 다른 동등한 볼륨 자당 쿠션과 침강을 반복합니다. </li><li> 20 μm의 taxol, 75 MM NaCl, 10 MM MgSO 4, 및 10 밀리미터 ATP로 5 % 추출 버퍼에 소금 세차에서 펠릿를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 4에 20 분 대한 ° C. 120,000그램 (42,000 RPM : 31,000 RPM, TLS-55 sw41ti 로터)의 침전물 뜨는을 (kinesin 수집분수). </li><li> 4 15 분 14,000그램에서 원심 여과 ° C를 수행 농축 샘플을 복구하고 30 분 이상 같은 새 필터로 여과를 반복하여 농축 샘플을 수집합니다. </li><li> 농도를 결정하는 단백질 분석을 수행합니다. 간단히, 알려진 단백질의 농도를 변화시키는 것은 (소 혈청 알부민, BSA) 브래드 포드 시약의 알려진 볼륨과 혼합하고 파장 595nm에서 광학 밀도를 측정했습니다. 그렇다면 광학 밀도 대 농도 표준 곡선은 표준 BSA 샘플 있으므로 유사한 조건 하에서 측정이 샘플의 광학 밀도를 사용하여 kinesin 분획을 정제의 미지의 농도를 계산하기 위해 설립되었습니다. 젤 전기 영동은 물론 서양의 모래 바닥도 정화 kinesin의 알려진 금액을 사용하여 수행되었다. </li><li> 액체 질소에서 원하는 농도와 스냅 동결 작은 볼륨으로 나누어지는의 kinesin 분율은 -80에 저장합니다 ° C. </li></ol> 전체 길이 기능성 Kinesin은 Drosophila의 배아에서 정화되었다. 그림 1은 정화하는 동안 다른 분수를 보여주는 실버 스테인드 젤 모습. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin 샘플이며, 레인 9 필터링된 kinesin 샘플이며, 레인 10 마커입니다. 115 주위 KD에서 레인 8 9 농축 밴드 Figur과 일치 kinesin 무거운 체인 1입니다E 1, 1988 5 게시된 Saxton 용지의 레인 8. 그림 2는 정화 kinesin 분율의 C 서양 얼룩을 나타내는가 kinesin 중쇄 항체를 사용하여 감지. 항체 AKINO1 - 크게 다른 kinesin의 가족 6 교차 반응하지 않습니다. 참고이기는하지만 분수는 kinesin-1에 대한 풍부한하는 동안 잠재적으로 다른 kinesins 및 기타 모터 단백질을 포함 가능성이 오염 있는데, 기능성 kinesin의 좋은 원천이 프로토콜은 결과를. 우리는 여과하여 작은 오염 물질의 종류를 제거했습니다. 멀리 혼자의 크기로 할 수없는 다른 모터를 제거로 정화는 kinesin 7을 공부하고 다른 사람에 의해 수행하고 있었는지와 유사한, 우리는 적극적으로 모터의 대부분 Kinesin-1입니다 있다고 생각하지만,보다 정교한 정화가 허용됩니다 같은 잠재적인 모터 오염 물질의 제거는 콜 외 8 Saxton 외 의해 수행되었다 9. kinesin의 processivity가로 "모터 단백질에 대한 운동성 분석"10 자격 Scholey하여 책에 자세히 설명되어 체외 단일 분자 미세 소관 결합 분석에 의해 평가되었다. 간단히, 단일 활성 모터 폴리스티렌 구슬은 포화의 존재 (1 ㎜) ATP에 미세 소관과 접촉 반입되었다. 모터 미세 소관에 붙어 있으며 레이저 트랩의 중심 꿈쩍도 시작했다. 트랩 센터 (100 nm의)에서 구슬의 사전 정의된 변위에서 레이저 빔을 전원이 자동으로 모터가 부하없이 MT를 따라 걸을 수 있도록 해제되었다. 영화는 MT를 따라 도보로 하나의 kinesin과 구슬 500 nm의 직경을 보여줍니다. 비디오 화면의 길이는 20 μm의에 해당합니다. 그림 3은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 정화, 하나의 장편 Drosophila kinesin 분자에 대한 런타임 길이의 측정 분포를 나타냅니다. exponenti알이 배포에 맞게하는 것은 하나의 kinesin 1.55의 평균 runlength ± 0.1 μm의 및 1.28 ± 필터링 및 필터없는 샘플을위한 0.12 μm의 각각을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1은 정화 분수의 실버 스테인드 겔 :. 샘플 각 분획으로부터는 10 % 젤에서 실행되었다. 단백질 10 μg은 각 차선에로드되었습니다. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin이다샘플 레인 9 100 KD 컷 - 오프 Amicon 울트라 0.5 ML 원심 필터 (Millipore, 미국)를 사용하여 필터링 kinesin이다. 파란 화살표가 누구 금액 감소와 빨간색 화살표가이 프로토콜에 사용되는 원심 여과 단계로 인해 kinesin의 농도를 표시했습니다 단백질을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> . 그림 2 정화 KHC 분율는 안티 kinesin 항체에 대해 blotted : 정화 kinesin 샘플 AKINO1가 - 1 시간 정도합니다 (TBST에 1:1,000) 상온에서 부화 다음 겔 전기 영동에 노출 및 기본 항체에 대해 (nitrocellulose 막에서) blotted되었습니다 상온에서 시간 동안의 돈키 - 안티 - 토끼 항체 (TBST에서 1:10,000). ECL (chemiluminescent) 키트는 위의 그림 kinesin 신호를 감지하는 데 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Drosophila 전체 길이 kinesin의&gt; Runlength과 속도 ()와 (B) 필터링 kinesin 샘플의 Runlength과 속도. (C)와 (D) 필터없는 kinesin 샘플의 Runlength과 속도. 그림 4. Kinesin의 운동성의 비디오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22The+genetics+and+biology+of+Drosophila%22">The genetics and biology of Drosophila</a>. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).</li>
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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

murine 두뇌는 물론 12 사용되고 있지만 소의 머리, 전신 kinesin을 정화하기 위해 가장 널리 사용되는 출발 물질 11. kinesin 원본으로 소 두뇌를 사용하는 큰 단점은 신선한 시작하는 자료를 사용할 수있다 : slaughterhouses은 일반적으로 액세스할 수 있으며, 두뇌 활성 kinesin를 얻기 위해 매우 신선해야합니다. 또한, 젊은 암소만을 두뇌가 효과적입니다. 마지막으로, 암소의 유전자 조작은 현재 실행 가능한 옵션이되지 않으므로 전용 &#39;야생 타입&#39;단백질은 공부를 할 수 있습니다. 마우스가 더 접근하지만, murine 두뇌를 수확하는 것은 정화가 50 개 이상 머리를 요구할 수 있으므로 다소 어렵고 시간이 소요됩니다. 또한, 마우스 식민지를 유지하는 것은 매우 비쌉니다. 소의 또는 Murine 소스와는 달리, Drosophila는 장점을 가지고...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 또는 재료의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 한천 (과립) </td><td> 어부 </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> 덱스 트로 오스 (D-포도당) 무수 </td><td> 어부 </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시 </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm 스타일 (폴리에스터) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila 문화 튜브 </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorn의 비이커 </td><td> 이코노 연구소 주식 회사 </td><td> B700-100 </td><td> 볼륨 : 100ml, 크기 : 58x72mm </td></tr><tr><td> 누룩 </td><td> 레드 스타 </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 </td><td> Genesse 과학 </td><td> 57-102 </td><td> 120micron의 기공 크기 </td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 </td><td> 소형 부품 </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> 파이프 </td><td> 시그마 </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> 파이프 </td><td> 시그마 </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (무수) </td><td> 어부 </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> 길들이다 </td><td> 시그마 </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65,635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> 시그마 </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP 아날로그 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate </td><td> 시그마 </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> 시그마 </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon 울트라 원심 필터 : 0.5 ML, 100kD가 잘려, 8 팩 </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

kinesin의 분리 및 정제에서 drosophila 태아

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

모터 단백질은 microtubules 따라 cargos를 이동하고, 구체적인 하위 세포 위치로 그들을 수송. 변경된 전송이 미세 소관 기반 모터 수송 및 그 규정을 이해하고, neurodegenerative 질병의 다양한 기초하도록 권장되기 때문에 가능성이 궁극적으로 향상된 치료 접근법으로 이어질 것입니다. Kinesin-1은 ATP의 가수 분해에 의해 구동 microtubules (MTS)를 따라 anterograde (플러스 엔드) 방향으로 이동 진핵세포 모터 단백질이다. 여기에서 우리는 따라서 단일 분자 biophysical 연구와 Drosophila 유전자의 조합을 허용, Drosophila의 배아에서 활성 전체 길이 kinesin를 분리하기위한 세부적인 정화 프로토콜을보고합니다. 잔 당 약 1000 여성과 함께 약 50 누워있는 컵 것부터 시작해서, 우리는 밤새 컬렉션을 수행. 이것은 포장 배아들 중 약 10 ML을 제공했습니다. 배아는 (배아의 약 9g을하였으며) dechorionated 표백했다, 그리고 균질. AFter 장애는 homogenate는 고속 원심 분리에 의해 다음 저속 회전을 사용하여 명확히했다. 명확히 뜨는는 MTS를 중합하기 위해 GTP와 taxol로 치료되었다. Kinesin는 ATP 아날로그, 상온에서 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate을 추가하여 polymerized MTS에 고정화되었다. kinesin 구속력 후 microtubules은 자당 쿠션을 통해 고속 원심 분리를 통해 sedimented되었다. 미세 소관 펠렛 그런 다음 다시 중지되고,이 과정이 반복되었다. 마지막으로 ATP는 MTS에서 kinesin을 출시하도록 추가되었습니다. 고속 원심 분리 후 뜨는에서 kinesin두고, MTS를 불러 냈어요. 이 kinesin이 더 정화를 위해 필터 100 KD 인하를 이용하여 원심 여과를 받게되었다 aliquoted, 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 모래 바닥 SDS 겔 전기 영동과 서양은 정화 샘플을 사용하여 수행되었다. 최종 원심 여과 단계 전후 정화 샘플 모터 활동체외 단일 분자 미세 소관 분석에 사용하여 평가되었다. 이전 문헌에 보고된대로 원심 여과 전후 kinesin의 분수는 processivity을 보여주었다. 또한 실험 kinesin 및 기타 운송 관련 단백질 간의 상호 작용을 평가할 진행되고 있습니다.

이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는 프로토콜입니다<em&gt; Drosophila</em&gt; 단일 분자 biophysical 연구를위한 배아. 우리는 배아를 수집 배아 lysate를 확인한 다음 microtubules (MTS)를 중합하는 방법을 보여줍니다. Kinesin는 MTS에 immobilizing Kinesin-MT 컴플렉스를 회전 후 ATP 첨가를 통해 MTS에서 kinesin를 공개함으로써 정화된다.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

모터 단백질은 미세소관을 따라 화물을 이동시키며, 이를 특정 세포 내 위치로 운송합니다. 운송 기능의 변화가 ...의 근저에 있는 것으로 시사되기 때문에...

본 절차의 전체적인 목표는 단분자 생물물리학 연구를 위해 초파리 배아로부터 활성 상태의 전체 길이 키네신(kinesin)을 분리하는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 배아를 수집하고 표백제로 코팅하는 것입니다. 다음으로, 코팅된 배아를 균질화하고 용해물을 정제합니다.그 다음, 정제된 배아 용해물 내에서 미세소관을 중합시키고 키네신을 미세소관에 안정적으로 결합시킵니다. 마지막으로, 키네신-미세소관 복합체를 침전시킨 후 미세소관으로부터 키네신을 분리합니다. 최종적으로, 광학 트랩을 이용한 단분자 비드 분석법을 통해 미세소관을 따라 이동하는 키네신의 능력을 평가할 수 있습니다.본 프로토콜은 초파리 키네신(kinesin) 정제를 위해 Saxton 등이 개발한 프로토콜을 수정한 것입니다. 많은 초심자 생물물리학자들이 직면하는 어려움 중 하나는 기능성 단백질을 확보해야 한다는 점입니다. 물리학자들은 대개 단백질 제조 교육을 받지 않기 때문에, 생물물리학자들이 키네신을 쉽게 공급받을 수 있도록 단백질 정제 방법을 명확하고 간편하게 설명하고자 본 프로토콜을 개발하였습니다.키네신(Kinesin)은 기계 화학 효소(mechano enzyme)로서 흥미로운 대상입니다. 단순히 단백질일 뿐만 아니라, 실제로 걷고 힘을 가하는 매우 작은 나노 머신 또는 분자 모터이기 때문입니다. 본 프로토콜은 키네신의 작동 원리를 더 잘 이해할 수 있도록 돕기 위해 작성되었습니다. 일반적으로 이 분야를 처음 접하는 연구자들은 정제 프로토콜에 필요한 충분한 양의 배아를 확보하는 데 어려움을 겪습니다. 초파리를 세심히 사육하여 58개의 산란 컵에서 약 10g의 배아를 확보함으로써 이를 해결할 수 있으며, 본 프로토콜을 완료하면 최종적으로 약 200µg의 키네신을 얻을 수 있습니다.초파리의 산란이 원활하지 않은 경우, 수집 플레이트와 하룻밤 배양 플레이트를 세 세트 수집하여 4°C에서 보관하십시오. 또는 모든 용해물과 하룻밤 수집물을 최대 한 달 동안 -80°C에서 보관한 후 다음 단계를 진행할 수도 있습니다. 충분한 BR 8이 확보되는 대로 프로토콜의 다음 단계를 진행하십시오.파리는 부화 후 2일에서 10일 사이에 가장 잘 움직이며, 15일 이후에는 이러한 능력이 감소합니다. 파리 컵을 준비하려면, 먼저 마커를 사용하여 100 milliliter 트라이콘 비커 측면에 외곽선을 그리고 가열된 칼날로 구멍을 뚫습니다. 끈적이는 고릴라 테이프를 사용하여 구멍

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이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을...

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

우리 삶의 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을...

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜은 kinesin-5의 소분자 억제제에 민감한 초파리 S2 세포주를 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 기반 오류 수정 분석에서 이러한 세포를 사용하는 방법도 간략하게 설명되어 있습니다.

&quot;인간 답게&quot;를 생성<em&gt; 초파리</em키네신-5의 약리 억제에&gt; S2 세포주 민감성

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

학습하세요 Drosophila 태아에서 활성 키네신을 분리하고 정제하는 방법을 단일 분자 생물물리학 연구에 활용하세요. 미세소관 중합 및 ATP 매개 방출 기법을 통해 기능성 모터 단백질을 확보할 수 있습니다.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

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