Name: 지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 형광 상관 분광학을 이용하여 살아있는 세포의 지질 뗏목에서 형광 프로브의 분포를 정량화하는 방법을. 이 기술은 막 미소구역 동역학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 회사 직원 Nationale 드 라 공들인 (ChoAD)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 그들의 재정 지원을위한 Fondation ICM (Institut 뒤 Cerveau 동부 표준시 드 라 Moelle)에 감사를드립니다.

1. FCS 설치의 보정 <ol><li> 공촛점 현미경, 레이저, 컴퓨터, 온도에 대한 보육 및 CO 2 제어를 시작합니다. </li><li> SPAD는 (단일 광자의 애벌 란시 다이오드)에 있고 SPAD 내부의 형광 필터가 잘 샘플에 적합되어 있는지 확인하십시오. SPAD는 시간에 동기화되었는지 확인합니다. 당신의 SPAD 설정이 인수 준비에 한번에만 FCS 소프트웨어를 시작합니다 조심하십시오. </li><li> 1 μg / ML (17.5 NM)의 농도에 도달하기 위해 PBS에 희석 콜레라 독소-Alexa488의 새로운 솔루션을 준비합니다. </li><li> 현미경의 내부 검색을 사용하여 솔루션의 공촛점 이미징을 최적화합니다. </li><li> 스캔 모드를 가리 키와 솔루션 예제에서 지점을 선택하여 전환합니다. 레이저 조명의 기간은 (&gt; 5 분)하여 FCS의 인수를 수행할 충분히 있는지 확인하십시오. </li><li> SPAD에 의한 외부 감지와 FCS 소프트웨어로 전환합니다. 당신의 형광 신호를 모니터링하고 잘 수이인지 확인SPAD에 테드 (충분한 신호 그런데 채도, 10 50 000 카운트로 000 / s는 상관 없습니다.) 필요한 경우, Z 위치, 이득 및 / 또는 정확한 형광 신호를 달성하기위한 레이저 전원을 수정합니다. </li><li> 삼십초 측정의 10 세트를 취득. 수집 시간 (최고 샘플링과 photobleaching 문제 사이의 절충) 샘플에 최적화되어야합니다. </li><li> 당신 솔루션에서 diffusing 한 형광 종이에 대응하는 자동 상관 관계 곡선 (그림. 2의 방정식)가 있는지 확인하고 피팅 후 얻은 확산 시간 (그림 (약 0.2 MS)가 올바른지하는 데이터를 (4 단계 참조) 분석 . 3). </li></ol> 2. 지질 보트 마커로 살아있는 세포의 염색법 <ol><li> 폴리-L-라이신 (1mg/ml)은 접착이 올바른지 확인하기 위해 이미징 전날 코팅 8도 Labteks에 플레이트 HEK293 세포. 형광 신호에 대한 불안의 원인이 없다는 보장 페놀 레드 않고 매체를 사용하십시오. </li><li>HBSS (행크의 버퍼 식염수)로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 37시 30 분 세포를 500 μl HBSS에 콜레라 독소-Alexa488 (1 μg / ml) 쇼핑 / BSA (0,1 %)를 추가 ° C. 콜레라 독소는 우선적 지질 보트에 분할 것으로 알려져 ganglioside GM1,에 바인딩됩니다. </li><li> HBSS (행크의 버퍼 식염수)로 두 번 세포를 씻으십시오. </li></ol> 3. 리빙 셀에 FCS 데이터 수집 <ol><li> 현미경 스테이지에있는 스테인드 세포를 놓습니다. 이 조건이 확산 시대 유물로 이어질 수도 달리 최적 있는지 온도 및 CO를 확인하십시오. </li><li> 현미경의 내부 검출 (그림 4)를 사용하여 관심있는 셀 공촛점 이미징을 최적화합니다. </li><li> 스캔 모드를 지정과 관심의 세포의 플라즈마 막에서 지점을 선택하여 전환합니다. 세포가 인수하는 동안 움직이지 않고지지 않도록하기 위해 세포에서 한두 라이브 이미지를 수행합니다. </li><li> SPAD에 의해 외부 감지로 전환하여 FCS 소프트에야키. 당신의 형광 신호를 모니터링하고 그것을 잘 (충분한 신호 그런데 채도, 10 000-50 000 건의 / s는 상관 없습니다) SPAD에 적합해야합니다. 필요한 경우, Z 위치, 이득 및 / 또는 정확한 형광 신호를 달성하기위한 레이저 전원을 수정합니다. 이것이 충분하지 않다면, 당신은 염색법 상태를 변경해 볼 수도 있습니다. </li><li> 삼십초 측정 10 표본을 습득. 대부분의 세포가 자동 형광있는 바와 같이, 당신은 자동 형광 페이딩으로 인해, 첫 번째 인수 중에 형광의 감소를 볼 수 있습니다. </li></ol> 4. FCS 데이터 분석 <ol><li> 상관 관계 간격을 설정하고 FCS 소프트웨어와 자동 상관 관계 곡선을 생성합니다. 상관 간격은 일반적으로 짧은 확인할 지연 시간에서 최대 가능한 최장 시간 (측정의 통계가 점점 더 불충 분한 최대 상관 관계 시간이 총 획득 시간에 도달하면되면서, 최대 지연 시간의 80 %로 제한됩니다로 다양합니다 Picoqua의 획득 시간NT 소프트웨어). </li><li> 각 샘플의 경우, 시간의 함수로 형광 변동 및 자동 상관 관계에 해당하는 파일을 내보냅니다. </li><li> 데이터 분석과 같은 파일을 가져올 프로 유래 등의 맞춤 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 각 샘플의 경우 형광이 삼십초 동안 안정적으로 유지 즉, 아무런 photobleaching가 수집하는 동안이 없습니다 있는지 확인하십시오. 이것이 인공 더 이상 확산 시간을 일으킬 수 있으므로 photobleaching 표시하는 어떠한 조치를 폐기하십시오. </li><li> 남은 FCS 곡선의 모양은 (그림 5 참조)이 올바른지 확인합니다. 평균 FCS 곡선을 결정합니다. </li><li> 적절한 수학적 모델 (그림 2)와 함께 커브를 맞습니다. 이 맞는 사람에게 확산 시간 (s)이 (ESE) 확산 시간 (s)와 diffusing 분자의 비율을 제공합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 콜레라 독소-Alexa488 솔루션 FCS 교정의 예제는 그림 3에 나와 있습니다 강한&gt;. 시간의 함수로 형광의 개별 조치가 어떤 photobleaching (그림 3A), 개별을 표시하고 FCS 곡선 건 아니었지만 확인 후 계산되었다. 민 FCS 곡선은 다양한 확산 모델 (그림 2의 예제)에 해당하는 방정식으로 장착되었다. 고전적인 발작의 품질을 결정하는 것으로 간주 매개 변수는 결정 계수 R 2입니다. 가까이 R 2는 더 적합, 1입니다. 이 경우 평균 FCS 곡선에 맞게 가장 정확한 모델은 세 가지 차원 (그림 2 및 그림 3B의 방정식 1) 자유롭게 diffusing 형광 분자의 인구를 설명하는 하나이다. 맞춤에서 파생된 확산 시간은 0.32 MS입니다. 커브 - 피팅 (그림 3C) 및 R 2 요인 (0.99906)에서 Residuals는 적합의 품질의 견적을 제공합니다. 콜레라 독소-Alexa488 스테인드 HEK2위한 FCS 분석의 예93 전지는 그림 5에 표시됩니다. multiphasic 평균 FCS 곡선의 모양이 서로 다른 확산 시간과 형광 분자의 인구의 존재를 보여준다. 방해 확산 (막 비행기에서와 같이 2 차원 확산) 및 3 차원에 자유롭게 diffusing 한 (그림 2와 그림 5의 방정식 2) 두 :이 커브를위한 최고의 경우엔 형광 프로브 세 인구와 모델에 해당합니다 . 이 후자의 인구 분비이나 재활용 경로를 통해 세포막에 도달하거나, endocytosis에 의해 세포막을 떠나는 그들의 멤브레인 목표에 바인딩하거나 unbinding 중 막 비행기, 즉 밖으로 나간 형광 분자에 해당합니다. GM1에 바인딩 콜레라 독소에 해당하는 멤브레인에서 두 확산 번, 지질 보트의 외부 확산에 대응하는 두 석사 (분자의 25 %), 그리고 지질 보트의 확산에 대응하는 75 MS (분자의 50 %), 있었다 . 유의하십시오 어떤 photobleach인수 기간 동안 ING는 인공 더 이상 확산 시간이 있으므로 가능한 지질 뗏목 도메인에서 GM1의 국산화 향해 편견을 만드는 이어질 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. FCS 설정 (Marquer 외으로부터 수정한 그림. 12)의 도식 표현 <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 확산 모델과 상관 곡선에 맞게 사용하는 해당 방정식의 예. 구조 매개 변수 S는 1 / E 2 농도와 w0 효과 라의 광학 축을 따라 S = Z와 z는 0 / w 0 0 유효 초점 반경과 같이 쓸 수1 / E 2 농도에서 teral 초점 반경. 이 값은 고전 점 확산 함수 (PSF) 측정에서 추출 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. FCS 보정을위한 솔루션에서 콜레라 독소-Alexa488의 확산 시간 평가. 30 초 인수의 대표적인 예를 들어 시간의 함수로) 형광 변동. B) 방정식 1 들으며 삼십초 취득 10 샘플 (그림 2 참조). C) 커브 피팅에서 Residuals에서 얻은 상관 곡선을 뜻합니다. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. HEK-293 세포는 콜레라 독소-Alexa488 물들일. 전지는 내부 488nm 레이저 라인 SP5 공촛점 현미경 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일)에 몇 군데 있었다. 형광 500 사이 x60 계획 고차 색지움 기름 침지 목표로 수집되었습니다와 650 nm의. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. HEK293 세포의 플라즈마 막에서 콜레라 독소-Alexa488의 확산 시간 평가. ) (그림 2 참조) 방정식이 장착되어 상관 곡선을 뜻합니다. B 커브 피팅에서) Residuals. (Marquer 외에서 수정했습니다. 12)

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

FCS 메서드는 여기에 제시된 것은 살아있는 세포에 대한 관심의 형광 프로브의 지질 뗏목 파티션의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. FCS는 단일 광자 계수 장치의 감도와 공촛점 현미경의 국산화에의 정확성을 결합한 제품입니다. FCS 및 표준 생화 학적 기법의 주요 차이점은 DRMs 절연 또는 공동 패치의 경우는 같이 FCS가 대상의 지질 보트 파티션이 아닌 상대적인 파티션의 절대적인 판단을 가능하게한다는 것입니다. FCS 데이터의 수집은 각 샘플에 대해 약 5 분 (30 초 10 인수) 소요되며 일상 생화 학적 기법에 비해 따라서 상당히 빠른 속도이다. 이 급속도는 가능한 시간에 약물뿐만 아니라 인해 발생할 수있는 지질 뗏목 파티션의 섭동를 따릅니다 수 있습니다. 피팅에 대한 서로 다른 모델을 결정 훑어해야 그러나 상관 곡선의 분석은 조금 까다롭습 될 수 있습니다가장 정확한 하나. 또한, 수집하는 동안 photobleaching 것은이 유물을 초래할 수 있으므로 피해야한...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 콜레라 독소의 subunit B-알렉사 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamer) = 57kg / 몰 </td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> 온도 및 CO 2 제어를위한 인큐베이터 </td><td> 생활 이미징 서비스 </td><td> 큐브와 상자 </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (단일 광자의 애벌 란시 다이오드) </td><td> MPD (마이크로 광자 장치) </td><td> PDM 세리 (100 μm의 민감한 영역) </td><td></td></tr><tr><td> 하이 패스 488 nm의 필터 </td><td> Semrock </td><td> 에지 BrightLine 긴 패스 필터를 차단하는 488 nm의 부품 #ails.aspx? ID = FF01-488/LP-25 &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS 검출 장치 </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 모듈 </td><td></td></tr><tr><td> 수집 및 자동 상관 관계 소프트웨어 </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> 피팅 소프트웨어 </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (fcs)에 의해 살아있는 세포에서 fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

한 것 같아요 년 동안 세포 점막이 동질하지 않습니다 그들의 기능을 발휘하기 위해 microdomains에 의존하는 개념이 널리 인정되고있다. 지질 보트는 콜레스테롤과 sphingolipids에 풍부한 멤브레인 microdomains입니다. 그들은 같은 신호 전달과 같은 셀룰러 생리적 과정에 역할을하고, 인신 매매 1,2뿐만 아니라 바이러스성 또는 세균성 감염과 neurodegenerative 질병 셋 등 여러 질병의 주요 선수가 될 것으로 생각됩니다. 그러나 그들의 존재는 아직 논란 4,5의 문제입니다. 사실, 지질 뗏목 크기 때문에 그들의 직접적인 이미지를 precluding, 지금까지 기존의 현미경 (200 nm의 정도)의 해상도 제한을, 약 20 nm의 6 것으로 추정되었습니다. 지금까지 지질 보트 내부에 관심 단백질의 파티션을 평가하는 데 사용되는 주요 기술은 세제 강한 세포막 (DRMs) 항체와 고립과 공동 패치했다. 비록 널리 사용 베카자신보다는 쉬운 구현의 사용,이 기술은 유물하는 경향이 있었다 그래서 7,8를 비난했다. 기술 개선 따라서 이러한 유물을 극복하는 생활 세포에 지질 보트 파티션을 알아내기 수있을 필요가 있었다. 여기에서 우리는 살아있는 세포의 플라즈마 막의 fluorescently 태그가 추가된 단백질 또는 lipids의 지질 보트 파티션의 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 방법은, 형광 상관 분광학 (FCS) 되나, 지질 보트 내부 또는 외부에있는 형광 프로브의 확산 시간의 차이에 의존합니다. 사실, 같은 인공 세포막과 세포 배양 모두에서 입증, 프로브는 훨씬 빠르게 외부 조밀한 지질 보트 9,10 내부보다는을 무마 것이다. 확산 시간을 확인하려면, 분 형광 변화는 (그림 공촛점 현미경으로 세포의 플라즈마 막에 위치, 초점 부피 (약 1 femtoliter)에서 시간의 함수로 측정1). 자기 상관 곡선 그러면 이러한 변화에서 그려진하고 적절한 수학적 확산 모델 11가 장착되어 수 있습니다. FCS는 그들이 fluorescently 태그만큼 다양한 프로브의 파티션 지질 뗏목을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 태그는 형광등 융합 단백질의 표현이나 형광 리간드의 바인딩에 의해 형성될 수 있습니다. 또한, FCS는 등 최근 12 설명된 인공 세포막과 세포 라인에서뿐만 아니라 차 문화에서뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 또한 약물 외에이나 멤브레인 지질 조성의 변화 12 이후 지질 뗏목 파티션의 역학을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

지난 15년 동안 세포막이 균질하지 않으며, 그 기능을 수행하기 위해 마이크로도메인(microdomain)에 의존한다는 개념이 널리 받아들여졌습니다. ...

지질 래프트(Lipid rafts)는 세포막 내의 미세 도메인으로, 신호 전달 및 트래피킹과 같은 세포 프로세스를 위한 조직 센터 역할을 합니다. 본 실험에서는 형광 상관 분광법을 사용하여 살아있는 세포의 세포막에서 지질 래프트 분할을 정량화함으로써 강글리오사이드 GM1의 지질 래프트 분할을 조사합니다. 포유류 세포는 Alexa 488이 표지된 콜레라 독소 B 서브유닛으로 분석합니다.공초점 현미경을 사용하여 지질 뗏목(lipid rafts)에 우선적으로 분배되는 ganglioside GM1에 형광 단백질을 결합시킵니다. 세포막에서의 미세한 형광 변동을 측정합니다. 자동 상관 곡선을 생성하고 이를 적절한 수학적 확산 모델에 맞추어 Fluor의 확산 시간을 결정합니다.프로브는 조밀한 지질 래프트 내부보다 외부에서 훨씬 더 빠르게 확산되므로, 얻어진 결과는 분배 수준을 나타냅니다. 세제 내성 막 분리 또는 항체와의 공동 패칭과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 FCS를 통해 표적의 상대적 패턴이 아닌 절대적인 지질 래프트 패턴을 결정할 수 있다는 점입니다. 또한, 형광 표지되어 있다면 지질과 단백질 모두에 사용할 수 있습니다.이 방법은 아밀로이드 베타 생성에 있어 지질의 중요성은 무엇인가와 같은 알츠하이머병 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 지질 그라프트 성분에 특이적으로 결합하는 새로운 억제제와 같은 중요한 발견으로 이어질 것입니다. 형광 상관 분광법(FCS) 시스템을 교정하여 이 절차를 시작하십시오.이 FCS 설정은 검출 필터와 아발란체 광다이오드가 포함된 외부 검출 장치 및 시간 상관 단일 광자 계수 시스템에 연결된 공초점 현미경으로 구성됩니다. 공초점 현미경 레이저, 공초점 이미징 컴퓨터 및 FCS 데이터 획득 컴퓨터를 시작하십시오. 그 다음 인큐베이터를 켜고 37 °C 및 5% CO2로 설정하십시오.단일 광자 아발란체 다이오드(single photon avalanche diode) 또는 SPAD의 전원이 켜져 있는지, 그리고 SPAD 내부의 형광 필터가 시료에 적합한지 확인하십시오. SPAD의 시간 동기화 여부를 확인하십시오. SPAD 설정이 데이터 획득 준비가 되면, FCS PICO quant 소프트웨어를 실행하십시오.최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 PBS에 희석한 콜레라 독소 Alexa 488 신선 용액을 준비합니다. 해당 용액을 커버슬립 위에 피펫팅합니다. 그 다음, 현미경의 Z축 설정을 조정하여 형광이 가장 강하게 나타나는 평면을 찾습니다.포인트 스캐닝 모드로 전환하려면 bleach point 버튼을 클릭한 다음, 이미지 화면을 클릭하여 용액 샘플에서 관심 포인트 영역(ROI)을 선택하십시오. 소프트웨어를 사용하여 노출 시간을 5분 이상으로 설정합니다. 이렇게 하면 FCS 획득을 수행하기에 충분한 시간 동안 레이저 조사가 이루어집니다.그런 다음 FCS 소프트웨어를 사용하여 spad의 외부 검출 모드로 전환하십시오. 형광 신호가 초당 10,000에서 50,000 counts 범위 내에 있는지 확인하십시오. 목표는 포화 상태가 되지 않으면서 양호한 신호를 얻는 것입니다.동일한 영역에서 32회 측정을 10세트 수행합니다. 광퇴색 없이 고품질 샘플링이 이루어질 수 있도록 샘플에 맞춰 획득 시간을 최적화해야 합니다. 최적화 샘플 데이터가 획득되면, 이를 사용하여 형광 종의 확산 시간을 결정할 수 있는 자기상관 곡선을 생성합니다. 첫째.FCS 소프트웨어를 사용하여 상관 시간 간격을 설정하고 용액 내에서 확산되는 형광 종에 해당하는 자기 상관 곡선을 생성합니다. 32번째 측정마다 소프트웨어는 각 32번째 샘플을 독립적으로 분석하며, 관찰값 사이의 시간 간격에 따른 유사도를 나타내는 고전적인 수학 함수를 사용하여 형광 강도로부터 자기 상관 곡선을 생성합니다. 상관 시간 간격은 일반적으로 분해 가능한 가장 짧은 LAC 시간부터 가능한 가장 긴 시간까지의 범위로 설정됩니다.여기서 볼 수 있듯이, 최대 상관 시간(correlation time)이 총 획득 시간에 가까워질수록 측정 정확도는 떨어집니다. 여기서는 최대 지연 시간(lag time)을 획득 시간의 80%로 제한했습니다. 다음으로, 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 형광 변동 및 자기 상관에 해당하는 파일들을 내보냅니다. 그런 다음 Origin Pro와 같은 데이터 분석 및 피팅 소프트웨어로 파일들을 가져와 획득 과정 동안 광퇴색(photo bleaching)이 발생하지 않았는지 확인합니다.형광 변동 파일을 검토하십시오. 형광은 30초 동안 안정적이어야 하며 평탄한 선으로 나타나야 합니다. 형광 측정값에 광퇴색(photo bleaching)이 나타나는지 확인하십시오.해당 FCS 곡선은 나머지 FCS 곡선에서 인위적으로 확산 시간이 길어지는 결과를 초래할 수 있으므로 추가 분석에 사용하지 마십시오. 각 시간 지점의 자기상관 값을 평균하여 평균 FCS 곡선을 결정합니다. 마지막으로, 적절한 수학적 모델로 곡선을 피팅하기 위해 적절한 방정식이 포함된 Origin Pro의 피팅 모듈을 사용하십시오.이 피팅을 통해 분자와 용액의 확산 시간을 구할 수 있습니다. 이 경우, 확산 과정에서 자유롭게 확산되는 단일 집단만이 존재합니다. 얻어진 확산 시간이 정확하다면, 약 0.2 milliseconds입니다.장치 설정이 잘 보정되었으므로 향후 실험에 사용할 수 있습니다. 설정의 보정 상태가 확인되었으므로, 이제 시스템을 사용하여 식물상의 지질 RAFs 분배를 측정할 수 있습니다. 관심 대상인 살아있는 세포 4개를 위해 인큐베이터에서 HEC 2 93 세포를 꺼냅니다.세포가 부착될 수 있도록 전날 poly L lysine이 코팅된 eight wheel lab Tech 슬라이드에 세포를 분주해 두어야 합니다. 형광 신호의 간섭을 방지하기 위해 phenol red가 없는 배지를 사용해야 합니다. 파이펫을 사용하여 웰에서 배지의 대부분을 조심스럽게 제거하되, 세포가 건조되지 않도록 주의하십시오.그 다음, 웰에 HBSS를 조심스럽게 첨가합니다. 각 웰에 대해 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 희석된 cholera toxin, Alexa 488 500 µL를 세포에 처리하여 30분 동안 반응시킵니다.37 °C에서 콜레라 독소는 배양 후 지질 뗏목(lipid rafts)에 우선적으로 분배되는 것으로 알려진 ganglioside GM1에 결합합니다. 이전과 같이 HBSS로 세포를 두 번 세척하면 FCS 데이터 수집을 위한 세포 준비가 완료됩니다. 염색된 세포를 현미경 스테이지에 올리고 온도와 이산화탄소 설정을 확인하십시오.현미경의 내부 검출기를 사용하여 관심 세포의 공초점 이미징을 최적화합니다. 막 염색이 잘 된 세포를 찾습니다. 이전과 같이 포인트 스캐닝 모드로 전환하고, 관심 세포의 세포막 내의 한 지점을 선택합니다.이미지 획득 중에 세포가 움직이지 않는지 확인하기 위해 세포의 스냅샷을 한두 번 촬영합니다. 이전과 같이 spad 외부 검출 모드와 FCS 소프트웨어로 전환하여 신호가 10,000에서 50,000 사이로 적절하게 나오는지 확인합니다. Z축 위치 이득 또는 레이저 출력을 조절합니다.대부분의 세포는 자가형광을 띠므로, 32번째 측정값에 해당하는 샘플 10개를 획득하십시오. 자가형광의 감쇄로 인해 초기 획득 과정에서 형광이 감소할 수 있습니다. 이전과 동일하게 형광 변동을 분석하여 평균 FCS 곡선을 결정하십시오.그런 다음 적절한 수학적 모델을 사용하여 다상 평균 FCS 곡선을 피팅합니다. 적절한 방정식과 함께 Origin Pro의 피팅 모듈을 사용하십시오. 이 피팅을 통해 확산 시간과 해당 확산 시간으로 확산되는 분자의 비율을 구할 수 있습니다.이 그림은 cholera toxin Alexa 488 용액을 이용한 FCS 보정의 예시를 보여줍니다. 시간에 따른 형광의 개별 측정값에서 광퇴색(photo bleaching)이 나타나지 않음을 확인한 후, 개별 및 평균 FCS 곡선을 계산하였습니다. 평균 FCS 곡선은 다양한 확산 모델에 해당하는 방정식으로 피팅되었습니다.적합도의 품질을 결정하는 것으로 전통적으로 간주되는 파라미터는 결정계수 R squared입니다. R squared 값이 1에 가까울수록 적합도가 더 높으며, 이 경우 가장 정확하게 적합된 모델임을 의미합니다. 평균 FCS 곡선은 3차원에서 자유롭게 확산되는 형광 분자 집단을 설명하는 곡선입니다.피팅을 통해 도출된 확산 시간은 0.32 milliseconds입니다. 곡선 피팅의 잔차와 R 제곱 계수가 여기서 피팅 품질의 추정치를 제공합니다. R 제곱 값은 0.99906으로, 이는 피팅이 잘 되었음을 나타냅니다.Alexa 4 88로 염색된 콜레라 독소(cholera toxin)가 처리된 HC 2 93 세포의 FCS 분석 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 이 예시에서는 확산을 평가하기 위해 세포 내부에 작은 형광 점들이 나타나는 것을 통해 독소가 세포 내 섭취(endocytosis)되기 시작했음을 보여줍니다. 혈장막에서의 콜레라 독소 Alexa 4 88의 시간입니다.데이터는 이 영상에서 설명한 대로 수집 및 분석되었습니다. 다상 평균 FCS 곡선의 형태는 서로 다른 확산 시간을 가진 형광 분자 군집의 존재를 나타냅니다. 이 곡선에 가장 적합한 피팅은 세 개의 형광 프로브 군집 모델에 해당하며, 그중 두 군집은 확산이 저해된 상태입니다.막 평면과 같이 2차원에서 확산되는 분자와, 3차원에서 자유롭게 확산되는 분자가 존재합니다. 후자의 집단은 막 평면 외부로 이동하는 형광 분자에 해당합니다. 다시 말해, 형광 분자들은 분비 또는 재활용 경로를 통해 막에 도달하여 막 표적에 결합하거나 해리되거나, 혹은 세포내섭취(endocytosis)를 통해 막에서 벗어나게 됩니다.막에서 두 가지 확산 시간이 관찰되었습니다. 분자의 25%는 지질 래프트 외부의 확산에 해당하는 2 밀리초의 확산 속도를 보였습니다. 분자의 50%는 지질 래프트 내의 확산에 해당하는 75 밀리초의 확산 시간을 보였습니다.이 절차를 따라 대체 광학 구성을 결합하면 회절 한계 미만에서 단일 분자 검출을 수행할 수 있으며, 이를 통해 개발 후 더 넓은 범위의 확산 시간을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 지질 래프트 분야의 연구자들이 세포주 및 일차 배양에서 약물 투여 후 막 지질 조성의 변화에 따른 질병 관련 지질 래프트 분배 역학을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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