Name: 에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 학습하세요 세포 표면에 고정된 수용체-리간드 상호작용 동역학을 적혈구 센서를 이용한 접착 빈도 분석법으로 측정하는 방법을. 이 기법은 세포 접착 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 보조금 R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 및 R01GM096187 지원했다.

1. 전체 혈액에서 RBCs 절연 <ol><li> EAS - 45 솔루션을 준비합니다. 테이블 내의 모든 재료를 무게 및 DI 워터 100 - 200ml에 용해. 1000ml 솔루션을 만들고 8.0 산도를 조정하기 위해 물을 추가합니다. 50ml에 의해 필터 나누어지는. 스토리지 -20 ° C에서 고정. </li></ol> 참고 : 단계 1.0 기관 검토위원회 승인을 프로토콜과 함께 간호사로 훈련 의료 전문가 등에 의해 수행되어야합니다. <ol start="2"><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함 10ml 튜브에 평균 cubital 정맥에서 혈액 3 - 5ml를 그려 부드럽게 즉시 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 혈액을 혼합하고 철저하게 염증을 막을 수 있습니다. </li><li> 공정 혈액 샘플 가능한 한 빨리. 원심 분리를 제외한 모든 다음 단계는 준비가 멸균 유지하는 후드를 완료해야합니다. , 50ml 원심 튜브에 혈액을 전송 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 추위와 무균 1077 Histopaque 및 원심 분리기의 10ml를 추가 두 번 반복합니다. </li><li> 10 추가ML 추위와 멸균 PBS, 5 분 @ 1000rpm을위한 원심 분리기, 4 ° C. 뜨는을 제거합니다. 4 번 (5 번 총) 반복합니다. </li><li> 두번 무균 EAS​​ - 45 (5 분 @ 1000rpm, 4 ° C)로 씻으십시오. 새로운 멸균 15ml 튜브에 마지막으로 세척 이동 RBCs 동안. </li><li> Resuspend RBCs in10ml EAS - 45. </li></ol> 2. RBCs에 biotinylation <ol><li> 1 단계에서 RBCs로 튜브를 가져가라. 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 centrifuging 후 모든 뜨는을 제거 여러 개의 튜브 각 RBCs 펠렛의 10μl를 넣고 (6 다양한 RBCs의 biotinylation의 농도의 준비 예를 들어 표 II 참조) 각 유리병에 PBS의 해당 금액을 추가합니다. </li><li> 표 II에 따라 신선한 Biotin-X-NHS/DMF 1시 10분, 1:100 dilutions하십시오. </li><li> 각 유리병에 0.1M borate 버퍼 10μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 계산 각 유리병에 비오틴 솔루션의 금액 (예를 들어 표 II 참조)하고 와동을 추가합니다. </li><li> 각 RBC의 약병 장소50ml 원뿔 튜브 및 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어 내부. </li><li> 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 800μl로 각 유리병 3 번씩 씻으십시오. </li><li> 4 각 유리병 및 저장하는 EAS - 45의 100μl를 추가 ° C. 최종 솔루션의 각각 1μl에 지금 RBCs의 ~ 1mln해야합니다. </li></ol> 3. RBCs에 비오틴 - 연결된 리간드 *을 Functionalizing <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 2mg/ml streptavidin 용액을 준비합니다. Aliqouted 솔루션은 -20 ° C.에 저장될 수 있습니다 </li><li> 즉시 streptavidin 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 2.7 (10μl)에서 RBCs의 동일한 금액을 혼합하고 4 30 분에 대한 회전에 품어 ° C. </li><li> 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 500μl 3 번 씻으십시오. 15μl EAS - 45 스토리지 / 1 % BSA를 추가합니다. </li><li> 즉시 20μg/ml 리간드 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 3.3 (10μl)에서 RBCs의 같은 양을 혼합하여 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어. </li><li> 중 500μl로 두 번 씻으 EAS -2min @ 2000rpm에 대한 1분의 45 %의 BSA. 스토리지 EAS - 1분의 45 %의 BSA의 15μl를 추가합니다. </li></ol> * 귀하의 단백질이 더 비오틴 링크가 없다면 당신은 단백질 biotinylation에 대한 상용 키트 중 하나를 (예를 들어, 써모 과학은 # 21955 EZ - 링크 마이크로 NHS - PEG4 - Biotinylation 키트)를 사용하거나 그림과 같이 중간 단계로 biotinylated 캡처 항체를 사용하여 동영상 인치 4. 수용체와 리간드 밀도의 부량 <ol><li> 각 mAbs의 포화의 농도와 다른 유리병, 수용체 - 베어링 세포 상온에서 30 분 동안 3 단계의 리간드 - 코팅 RBCs를 품어합니다. 제어를위한없는 isotype 검색 항체와 함께 별도의 튜브 세포에 품어. 기본 항체가 찬란 표시되지 않는 경우에는 제조 업체의 지시에 따라 찬란 - 복합 차 항체와 함께 품어. </li><li> 해당 형광 칼과 흐름 cytometery에 의해 단계 4.1 준비 샘플 분석ibration 비즈. 로 그림에 표시된 밀도를 계산합니다. 1. </li></ol> 5. micropipette과 셀 챔버 준비 <ol><li> PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러 또는 셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러를 사용하여 모세관 튜브에서 micropipettes를 가져옵니다. </li><li> 원하는 크기 (보통 1 - 5μm에서 필요한 직경 범위 연구에 사용되는 세포의 크기에 따라)에 뽑아 micropipette의 팁을 조정 microforge과 micromanipulator를 사용하십시오. </li><li> 원하는 크기로 현미경 커버 유리를 절단하여 셀 챔버를 준비합니다. 실험 중에 osmolarity를​​ 변경하는 중간 증발을 방지하기 위해 양쪽에서 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 밀봉합니다. </li><li> 실로 수용체와 리간드 - 베어링 세포를 추가합니다. </li></ol> 6. Micropipette 부착 주파수 분석 <ol><li> 각 pipettes하여 상호 작용하는 세포를 기음과 컴퓨터 프로그램 piezoelectr를 사용하여 IC 번역은 제어 문의 공간 및 시간이 다른 세포와 접촉 밖의 RBC를 운전합니다. 세포 분리시 RBC의 연신율을 관찰하여 접착 이벤트를 감지. </li><li> 주어진 접촉 시간에 대한 문의 - 철회주기에게 50-100 번 반복합니다. Excel 스프레드 시트의 열에서없이 접착을위한 접착 또는 "0"에 대한 "1"을 추가하여 관찰 부착 이벤트를 기록합니다. 당신은 미세한 이미지, 예를 들어, 디지털 미디어 또는 비디오 테이프를 녹화 장치를 사용할 수 있습니다. </li><li> 부착 주파수 대 의미와 SEM을 얻기 위해 각 접촉 시간에 적어도 세 가지 다른 세포 쌍을 사용하여 문의 시간 곡선을 기록합니다. </li><li> 그들의 구체적인 기능 봉쇄의 mAbs를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단없는 리간드 (예 : BSA) 및 / 또는 코팅 RBCs를 사용하여 컨트롤에 대한 특이 현상이 바인딩 커브를 기록합니다. 각 연락처 시점에서 특정 접착 주파수는 특이 현상이 부착 주파수 1 제거하여 계산하실 수 있습니다. </li></ol>ove_title "&gt; 7. 데이터 분석 <ol><li> 특정 부착 주파수를 맞추기 P 전달 두번째 순서와 첫 순서 수용체의 단일 수종과 리간드 1 단일 종 사이의 역방향 단일 단계 상호 작용을 설명하는 확률적 모델 (수식 1)에 의해 비교 ​​문의 시간 t 데이터 : <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 1"> K는 2D 효과적인 바인딩 친화력은 K가 오프 오프 요금은, M R 및 M 난 4 단계에서 측정한 각각의 수용체와 리간드 밀도뿐입니다이며, C는 접촉 영역입니다. 곡선 맞춤가 C와 K가 효과적인 2D 친화 함께 일괄와 총칭이라고 같이 두 개의 매개 변수, C K A와 K 임무를 가지고 있습니다. 오프 속도의 제품은 효과적인 2D에서 속도입니다 C K에 = C K X K 해제. 구체적인 접착력 주파수 P는 전체 측정 부착 (P 측정) 1,21에서 특이 현상이 부착 분율 (P 특이 현상)의 뺄셈으로 계산됩니다 : <img alt="방정식 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="방정식 2"></li></ol> 8. 대표 결과 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 인테 그린 α L의 β neutrophils 2 사이트 밀도의 1 결정을 그림. Neutrophils 먼저 그림 3,4 또는 E - selectin - IG없이 사용하는 실험 조건을 일치하는 10 분에 대해 E - selectin - IG의 1μg/ml와 incubated 후 PE - 복합 백신의 포화의 농도 (10μg/ml)로되었습니다 인간 CD11a mAb (복제 HI111 특정 표를 참조시약 및 장비) 또는 컨트롤에없는 마우스 IgG1은 씻어하고, 즉시 분석했다. 샘플은 표준 QuantiBRITE PE 교정 비즈와 BD LSR 흐름 cytometer에 읽어되었습니다. 패널 A는 E - selectin - IG 처리 (파란색) 또는 치료 세포 (녹색)의 사람과 함께 교정 비즈의 형광 histograms (분홍색)을 보여줍니다. 특정 CD11a mAb의 얼룩은 고체 곡선과 관련이없는 isotype 검색 컨트롤 항체 얼룩이 곳곳에 곡선에 표시됩니다에 표시됩니다. 치료 세포와 비교에서 본대로 E - selectin - IG (모든 세탁 단계와 FACS 버퍼에 존재) 대우 세포는 CD11a 밀도에 영향을주지 않았다. 패널 B는 밀도 부량 과정을 보여줍니다. Log10는 패널에서 네 개의 교정 비드 histograms의 각 피크 값의 평균 형광 강도 (FI)에 대한 계산 (핑크 원)와 구슬 당 많은 특정 PE 분자에 대한 (제조 업체). Log10 fluoresc에 대한 비드 당 Log10 PE 분자의 선형 회귀줬어도 꾸몄다되었습니다. E - selectin 취급 전지 respectivly 3.99 (파란색 고체 동그라미)와 특이적인 mAb 및 제어 항체에 대해 2.23 (파란색 오픈 동그라미), 동등한 Log10 FI (Y) 값. 우리는 X (값이 패널 B에 녹색과 파란색 동그라미로 꾸몄다 있습니다)에 대한 선형 방정식을 해결 X = Log10 PE PE로 / 세포와, :., neutrophils에서 α L의 β 2의 총 숫자는 mAb 비율이 1시 1분 있었다 9587으로 계산. 표면 밀도는 호중구 직경 22로 8.4μm를 사용하여, 43 분자 / μm의 두 것으로 계산되었다. ICAM - 1의 밀도는 마찬가지로 65 몰 / μm의 2 말았네 PE - 안티 인간 CD54 mAb를 사용하여 플로우 cytometery에 의해 측정되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2 Micropipette 시스템 설계도. 우리 micropipette 시스템은 집에서 조립 세 서브 시스템으로 구성되어 있습니다되었습니다 이미징 서브 시스템을 하나, 레크 리에이션을 관찰할 수 있도록오드 및 분석 micropipette - aspirated 세포의 움직임, 하나 셀 챔버에서 세포를 선택할 수 있도록 미세 조작 서브 시스템 및 압력 서브 시스템은 하나 micropipettes로 세포를 대기음 수 있습니다. 이미징 서브 시스템의 중앙 조각은 100x 기름 침지 1.25 NA의 목적으로 (올림푸스 IMT - 2 IMT2) 현미경을 반전합니다. 이미지는 무료 커플 장치 (CCD) 카메라를 통해 비디오 카세트 레코더로 전송됩니다. 비디오 타이머는 시간을 추적할 수있는 시스템으로 결합됩니다. 각 micropipette은 현미경에 장착된 가늘게 3 축 유압 micromanipulator와 위치 기계적 드라이브로 조작하실 수 있습니다. 뉴 포트에서 기계 manipulators 역시 사용될 수 있습니다. micropipette 홀더 중 하나가 압전 변환기에 탑재의 드라이버는 압전 액추에이터에 전압 앰프 (수제)를 통해 컴퓨터를 LabView 코드 (요청시 사용 가능)와 DAQ 보드를 통해 신호 변환에 의해 제어됩니다. 이llows 한 접착 테스트 사이클에서 정확하고 repeatably 피펫 이동합니다. 압력 조절 시스템은 실험 기간 동안 흡입을 제어하는​​ 데 사용됩니다. 유압 라인은 액체 저수지에 micropipette 홀더를 연결합니다. 좋은 기계 포지셔너는 저수지의 높이를 정확하게 조작 수 있습니다. Micropipettes는 KIMAX의 융점 borosilicate 유리 모세관 튜브 (1.0 이외의 직경 ± 0.07 mm와 0.7의 내부 직경 ± 0.07 mm를 사용하여 생성됩니다. 첫째, 모세관 튜브의 micropipettes가 PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러를 사용 행진 (셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러 다른 풀러 옵션입니다.) 둘째, Microforge 시스템 (집에서 만든) 원하는 크기 오프닝에 micropipettes를 잘라하는 데 사용됩니다. Microforge 시스템의 상용 모델뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 실험 microsc 동안 micropipettes의 진동을 방지하려면ope, micromanipulators와 함께 에어 서스펜션 테이블에 배치됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3을 위해서 접착 주파수 F를 실행하는 특정 (A) 및 특이 현상 (B) 1s (빨간색)에 구속하고 10 초 ICAM - 1 (A) 또는 hIgG와 코팅 RBCs 사이에 반복적으로 접착 테스트주기에서 측정 (파란색) 접촉 시간 (B ) 인테 그린 α L의 β 2를 표현하는 인간 neutrophils과 함께. F I = (X 1 + X 2 + ... + X 제가) / 전 (1 제가 테스트주기 색인 ≤ I ≤ N), X 난 "1"동일 (접착) 또는 "0"(노 부착). F N (N = 50)가 부착 확률위한 최상의 견적로 사용되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 4 속도론 그림호중구 인테 그린 α L의 β 2 ICAM - 1 바인딩 ( <img alt="스퀘어" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="스퀘어"> ). 측정된 접착 확률은 각 연락처 시간 세 세포 쌍을 그림 3에 나와 평균입니다 문의 시간 대 꾸몄다. 챔버 매체 α의 L의 β에게이 바인딩을 upregulate하는 1mM 칼슘 2 각 + 및 MG 2 dimeric의 + 플러스 1μg/ml E - selectin - IG와 HBSS했다. , RBCs에서 ICAM - 1 - IG를 캡처하기 위해 중간 단계는 streptavidin 보육 단계 후 10μg/ml 캡처 항체 (biotinylated 염소 - 안티 인간 FC 항체, eBioscience)와 RBCs를 부화 추가되었습니다. 특이 현상이 구속력이 두 가지 조건을 제어하는​​ 데 사용되었다 : 1)는 RBCs로 코팅된 아닌 반 인간 FC 캡처 항체로 코팅하고 그 대신 RBCs에 바인딩 ICAM - 1 - IG (O)과 2) neutrophils 인간의 IgG와 incubated (Δ) 항체를 캡처합니다. 10μg/ml 인간 IgG는 E의 바인딩 최소화하는 매체에 추가되었습니다RBC 표면에 캡처 항체에 용액에 - selectin - IG. 인간 IgG 제어 곡선로 기록 특이 현상이 바인딩은 특정 부착 확률 곡선을 (얻기 위해 사용되었다 <img alt="스퀘어" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="스퀘어"> ) EQ를 사용하여. 2. EQ와 피팅 특정 부착 확률 곡선. 1 (실선)은 효과적인 구속력 친화력 C K = 1.4 • 10 -4 μm4와 K 해제 = 0.3의 -1를 반환했습니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> MW (g / 몰) </th><th> 농도 (㎜) </th><th> 금액 (G) </th></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 135.13 </td><td> 이 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> D - 포도당 (덱스 트로 오스) </td><td> 180.16 </td><td> 110 </td><td> 19.82 </td></tr><tr><td> D - Mannitol </td><td> 182.17 </td><td> 55 </td><td> 10.02 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 58.44 </td><td>50 </td><td> 2.92 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 (나 HPO ) </td><td> 141.95 </td><td> 20 </td><td> 2.84 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 146.15 </td><td> 10 </td><td> 1.46 </td></tr></tbody></table> 표 1. EAS - 45 버퍼 준비 (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> DMF의 550 μl 25 MG 비오틴 - XHS </td><td> 0.1M 비오틴 솔루션 </td></tr><tr><td> 0.1 비오틴 W / DMF의 1시 10분 희석 </td><td> 0.01M 비오틴 솔루션 </td></tr><tr><td> 0.1 비오틴 W / DMF의 1:100 희석 </td><td> 0.001M 비오틴 솔루션 </td></tr></tbody></table> 표 2. 비오틴 솔루션의 준비. <table border="1"><tbody><tr><th> 비오틴 최종 농도 (μm의) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs 펠렛 주식 (μl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1X PBS (μl) </td><td> 179.2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176.8 </td></tr><tr><td> 0.1M borate 버퍼 (μl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.01M 비오틴 솔루션 (μl) </td><td></td><td></td><td></td><td> 일 </td><td> 이 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0.001M 비오틴 솔루션 (μl) </td><td> 0.8 </td><td> 이 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. RBCs의 Biotinylation.

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<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 - 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당한 차이를 가지고 있습니다. 다른 방법은 몇 RBCs의 표면에 리간드를 사용할 수 있습니다. 그것은 방법 17 커플링 크롬 염화은 비오틴 - streptavidin 커플링보다 특이 현상이 바인딩의 높은 수준을 준 것으로 나타났습되었다. 둘째, 특정 상호 작용에 대한 부착 확률이 중간 범위에 있어야합니다. 이 요구 사항은 수용체가 constitutively 세포에 표현하는 경우 수용체와 리간드 (또는 RBCs에서만 리간드의 밀도 변화에 의해 충족 수 있습니다...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17 - 517Q </td><td> 사용하기 전에 탈이온수와 1X로 희석 </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> BD </td><td> 366,643 </td><td> RBCs 절연 </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 10,771 </td><td> RBCs 절연 </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A2786 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> D - 포도당 (덱스 트로 오스) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7528 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> D - Mannitol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 6360 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S7653 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 (나 &amp; # X2082; HPO ₄) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S374 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G5763 </td><td> EAS - 45 준비 </td></tr><tr><td> 비오틴 - X - 보건국 </td><td> Calbiochem </td><td> 203,188 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Dimethylformamide (DMF) </td><td> 써모 과학 </td><td> 20,673 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Borate 버퍼 (0.1M) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 11455-90 </td><td> RBCs에 biotinylation </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> 써모 과학 </td><td> 21,125 </td><td> functionalizing 리간드 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A0336 </td><td> functionalizing 리간드 </td></tr><tr><td> Quantibrite PE 비즈 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340,495 </td><td> 밀도 부량 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD Immunocytometry 시스템 </td><td> BD LSR II </td><td> 밀도 콴tification </td></tr><tr><td> 모세관 0.7 - 1.0mm X 30 &quot; </td><td> 킴블의 유리 주식 회사 </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipette 당겨 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP2629 - 1 </td><td> 상공 회의소 조립 </td></tr><tr><td> 현미경 커버 유리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-544 - G </td><td> 상공 회의소 조립 </td></tr><tr><td> PE α - 인간 CD11a 클론 HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> PE 안티 인간 CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> 마우스 IgG1 Isotype 제어 PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Fig.1을위한 시약 </td></tr><tr><td> 유압 micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MO - 303 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 기계 조작하는 사람 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 461 - XYZ - M, SM - 13, DM - 13 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 압전 번역 </td><td> Physik Instrumente </td><td> P - 840 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> 내쇼날 인 스트 루먼트 </td><td> 버전 8.6 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> DAQ 보드 </td><td> 내쇼날 인 스트 루먼트 </td><td> USB - 6008 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr><tr><td> 광학 테이블 </td><td> 동력학 시스템 </td><td> 5200 시리즈 </td><td> Micropipette 시스템 </td></tr></tbody></table>

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 - 리간드 바인딩 속도론 1 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 - 리간드 반응 속도론 1 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다. 분석은 IgG FC 1-6 glycoconjugate 리간드 6-9, 리간드 10-13, homotypical cadherin 구속력이 14 펩타이드 - 주요 histocompatibility의 단지 15 T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 - 19. 방법은, 같은 멤브레인 microtopology 5, 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9, 곡률 20과 충돌 힘 20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등. 방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 21를 사용하여 이중 수용체 - 리간드 종 3,4의 동시 구속, 19 trimolecular 상호 작용을 공부합니다. 방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 - 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다. micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α L의 β 2 활성화 솔루션에 dimeric E - selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α L의 β 2 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM - 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

마이크로피펫 접착 분석법(micropipette adhesion assay)은 2차원(2D) 수용체-리간드 결합 역학을 측정하기 위해 1998년에 개발되었습니다1. 이 분석법은 인간 적혈구를 사용합니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 두 분자가 모두 상호작용하는 세포 표면에 고정되었을 때의 수용체-리간드 상호작용 역학을 측정하는 것입니다. 이는 우선 접착 센서인 적혈구를 리간드로 기능화하고, 수용체를 발현하는 세포를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 마이크로 피펫 챔버를 조립하고 접착 테스트를 수행하여 접착 이벤트를 기록합니다.다음으로, 세포 접촉 시간에 따른 부착 확률 곡선을 도식화하고 모델에 적합시킵니다. 반응 속도론적 파라미터를 추정하기 위해, 데이터로부터 추정된 2차원 유효 결합 친화도와 해리 속도를 보여주는 결과를 도출합니다. 그렇다면 이 분석법의 아이디어는 어디에서 얻었을까요?연구자들은 수용체-리간드 상호작용을 연구합니다. 주로 파단력을 측정하며 저희 또한 동일한 작업을 수행하고 있으나, 어느 날 저희는 접착이 없는 경우 0, 접착이 있는 경우 1이라는 이진 결과만을 측정하고, 이러한 0과 1의 측정값으로부터 역학 측정치를 도출하여 마이크로 파이펫 빈도 분석법을 보여줄 수 없을까 생각하게 되었습니다. 저희 실험실의 연구 과학자인 Veronica Zana Zina 박사가 여러분께 해당 실험을 보여드릴 것입니다.전혈에서 분리한 적혈구를 접착 빈도 분석을 위해 비오틴화합니다. 이 절차를 시작하려면, 분리된 적혈구가 담긴 튜브를 원심분리하고, 적혈구 펠렛 10 µL를 여러 개의 바이알에 각각 분주한 다음, 각 바이알에 해당 양의 PBS를 추가하여 다양한 농도의 적혈구 비오틴 희석액을 준비합니다. 그다음, 각 바이알에 0.1 M borate buffer 10 µL를 추가합니다.그 다음, 계산된 양의 biotin 용액을 각 바이알에 넣고 즉시 볼텍싱합니다. 각 적혈구 바이알을 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고, 실온의 로테이터에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 각 바이알에 EAS 45 버퍼를 넣고 2000 rotations per minute에서 2분 동안 원심분리합니다. EAS 45 버퍼를 이용한 세척 과정을 2회 더 반복하여 총 3회 세척합니다.마지막으로, 각 바이알에 100 µL의 EAS 45 버퍼를 추가하고 4 °C에서 보관하여 적혈구 표면의 리간드를 기능화합니다. 이전 단계에서 비오틴화된 적혈구를 4 °C에서 포화 농도의 strep TTR과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, EAS 45 버퍼로 2000 rpm에서 2분 동안 세 번 세척합니다. 그 후, 적혈구를 비오틴화된 리간드와 직접 인큐베이션하거나, 적혈구를 해당 비오틴화 포획 항체와 먼저 인큐베이션한 다음 리간드와 인큐베이션합니다. 이 비디오에서 보여주는 프로토콜에서는 비오틴화 포획 항체를 사용합니다.마이크로피펫은 융점이 낮은 붕규산 유리 모세관을 사용하여 제작합니다. 먼저 마이크로피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 모세관을 뽑아냅니다. 그다음, 마이크로 포지(micro forge)가 장착된 마이크로 매니퓰레이터(micro manipulator)를 사용하여 마이크로피펫의 팁을 원하는 크기의 개구부로 절단합니다.필요한 직경은 보통 연구에 사용될 세포의 크기에 따라 1~5 µm 범위입니다. 세포 챔버를 준비하려면, 원하는 크기로 자른 현미경 커버글라스 두 장을 사용하고, 에어 더스터로 커버슬립의 먼지를 제거한 후, 세포 챔버 배지를 넣고 배지의 증발을 막기 위해 양쪽을 미네랄 오일로 밀봉합니다. 배지가 증발하면 실험 중에 삼투압이 변할 수 있습니다.본 분석에 사용된 마이크로 피펫 시스템은 세 가지 하위 시스템으로 구성됩니다. 즉, 마이크로 피펫으로 흡입된 세포의 움직임을 관찰, 기록 및 분석하기 위한 이미징 하위 시스템, 세포 챔버에서 세포를 선택할 수 있게 하는 마이크로 조작 하위 시스템, 그리고 세포를 마이크로 피펫으로 흡입하기 위한 압력 하위 시스템입니다. 이미징 하위 시스템의 핵심 장비는 100배 오일 침강 렌즈가 장착된 도립 현미경입니다. 대물렌즈의 이미지는 전하결합소자(CCD) 카메라에 의해 감지되어 비디오 카세트 녹화기로 전송됩니다.시간을 기록하기 위해 비디오 타이머를 시스템에 연결합니다. 마이크로 파이펫에 탈이온수를 채운 후, 현미경에 장착된 기계적 드라이브의 홀더에 파이펫을 배치합니다. 마이크로 파이펫은 3축 유압식 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 정밀하게 위치를 조정할 수 있습니다.마이크로 피펫 홀더 중 하나는 컴퓨터로 프로그래밍된 압전 변환기에 장착되어 있습니다. 이를 통해 접착 테스트 사이클 동안 피펫을 정밀하게 이동시킬 수 있습니다. 압력 조절 서브시스템은 흡입력을 제어하는 데 사용됩니다.실험 과정 동안, 유압 라인이 마이크로피펫 홀더와 유체 저장조를 연결합니다. 정밀 기계식 포지셔너를 통해 저장조의 높이를 정밀하게 조절할 수 있습니다. 챔버 조립 후 마이크로피펫을 설정하고, 챔버 내에 세포를 주입하여 분석을 시작합니다. 상호작용하는 세포들을 각각의 피펫으로 흡입하고, PSO 전기 트랜슬레이터를 사용하여 제어된 접촉 면적과 시간 동안 적혈구를 호중구에 접촉시키거나 떼어냅니다.적혈구가 세포 분리 시 신장되면 접착 이벤트로 관찰하며, 적혈구가 신장되지 않으면 비접착 이벤트에 해당합니다. 엑셀 스프레드시트의 열에 접착 시 1, 비접착 시 0을 입력하여 관찰된 접착 이벤트를 기록하십시오.각 접촉 시간당 최소 세 쌍의 서로 다른 세포 쌍을 사용하여 접촉 시간에 따른 접착 빈도 곡선을 기록하십시오. 대조군으로서 평균과 SEM을 얻기 위해, 관련 리간드로 코팅된 적혈구를 사용하거나 특정 기능적 차단제를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단함으로써 비특이적 결합 곡선을 기록하십시오. 단클론 항체의 경우, 비특이적 접착 빈도를 제거함으로써 각 접촉 시간 지점에서의 특이적 접착 빈도를 계산할 수 있습니다.특이적 부착 빈도 대 접촉 시간 데이터는 한 종류의 수용체와 한 종류의 리간드 사이의 2차 정반응 및 1차 역반응 단일 단계 상호작용을 설명하는 확률 모델에 의해 피팅됩니다. 이 방정식에서 KA는 2D 친화도이며, KA는 2D 해리 속도입니다.MR과 ML은 각각 수용체 및 리간드의 밀도이며, AC는 접촉 면적입니다. 곡선 피팅에는 ac, k, a, 그리고 K off라는 두 가지 파라미터가 있는데, 이는 AC와 KA가 하나로 묶여 총체적으로 유효 2D 친화력이라 불리기 때문이며, 이 값과 해리 속도(off rate)의 곱이 유효 2D 결합 속도(on rate)가 됩니다(AC K on = AC KA × K off). 여기에는 integrin alpha L beta two의 결정 예시가 나타나 있습니다.중성구의 사이트 밀도. 중성구를 먼저 1 µg/mL의 E selectin IG로 배양한 후, PE가 접합된 anti-human CD 11 단클론 항체 또는 대조군으로 관련 mouse IgG1을 포화 농도로 첨가하였다. 30분간 배양 후 샘플을 세척하고 표준 설정의 유세포 분석기로 측정하였다.밝은 PE 보정 비드. 패널 A는 보정 비드와 E selectin IG 처리 또는 미처리 세포의 형광 히스토그램을 보여준다. 특정 CD 11 A 단일클론 항체 염색은 실선으로, 관련 이소타입 일치 대조 항체 염색은 점선으로 표시되어 있다.패널 B는 밀도 정량화 과정을 보여줍니다. 4개의 비드 각각의 평균 형광 강도에 대해 Log 10을 계산했습니다. 패널 A의 캘리브레이션 피크 값과 로트별 비드당 PE 분자 수를 사용하였습니다.침입한 세포를 재선별하기 위해 비드당 PE 분자의 log 10 값과 형광의 log 10 값에 대한 선형 회귀 분석을 수행하였습니다. 특정 단클론 항체의 경우 log 10 fi 값은 파란색 채워진 원으로 표시된 3.99였으며, 대조 항체의 경우 파란색 빈 원으로 표시된 2.23이었습니다. X에 대한 선형 방정식을 풀었을 때, alpha L beta two 또는 호중구의 총 수는 9, 587개로 계산되었습니다.중성구의 직경을 8.4 microns로 설정하여 표면 밀도를 계산한 결과, micron squared당 43개 사이트로 나타났습니다. 다음 그래프는 1초와 10초에서의 특이적 결합에 대한 접착 빈도 fi의 추이를 보여줍니다. 접촉 시간은 ICAM one이 코팅된 적혈구와 인테그린 alpha L beta two를 발현하는 인간 중성구 사이의 반복적인 접착 테스트 사이클을 통해 측정되었습니다.이와 대조적으로, 여기에는 human IgG가 코팅된 적혈구와 integrin alpha L beta two를 발현하는 인간 호중구 사이의 반복적인 부착 테스트 사이클을 통해 측정된, 접촉 시간 1초 및 10초에서의 비특이적 결합에 대한 실행 부착 빈도 fi가 나타나 있습니다. 이 마지막 그래프는 I A one의 호중구 integrin alpha L beta two 결합 역학을 보여줍니다. 각 접촉 시간에서 세 쌍의 세포에 대해 측정된 부착 확률을 평균내어 접촉 시간에 따라 도식화함으로써 비특이적 결합을 제어하였습니다. 두 가지 서로 다른 조건이 사용되었습니다.anti-TFC 포획 항체로 코팅된 적혈구를 ICAM-1 IgG 대신 human IgG와 함께 배양한 결과(1) 및 포획 항체로 코팅되지 않은 적혈구에 결합하는 중성구의 결과(2). human IgG 대조군 곡선으로 기록된 비특이적 결합을 이용하여 특이적 부착 확률 곡선을 얻었습니다. 비특이적 결합 보정을 위해 앞서 제시된 방정식을 사용하였습니다.보정된 특이적 부착 확률 곡선은 모델 피팅을 통해 적합화되었습니다. 특이적 부착 확률 곡선을 통해 유효 결합 친화도를 도출하였습니다. CKA는 1.4 × 10⁻⁴ µm⁴이며, koff는 0.3 s⁻¹입니다.이 영상을 시청한 후, 두 분자가 상호작용하는 세포 표면에 각각 고정되었을 때 수용체-리간드 상호작용 역학을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 접착 빈도가 중간 범위에 있도록 리간드 측 밀도 범위를 설정했던 초기 실험 내용을 기억하는 것이 중요하며, 혈액 및 특정 처리용 시약(예: sodium azide 및 DMSO)을 다루는 것은 매우 위험할 수 있음을 유의하십시오. 따라서 시약의 MSDS를 주의 깊게 읽고 절차 수행 중 장갑을 착용하는 등의 예방 조치가 필요합니다.

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연구

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생명공학

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