에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석

다음 실험의 전반적인 목표는 두 분자가 모두 상호작용하는 세포 표면에 고정되었을 때의 수용체-리간드 상호작용 역학을 측정하는 것입니다. 이는 우선 접착 센서인 적혈구를 리간드로 기능화하고, 수용체를 발현하는 세포를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 마이크로 피펫 챔버를 조립하고 접착 테스트를 수행하여 접착 이벤트를 기록합니다.

다음으로, 세포 접촉 시간에 따른 부착 확률 곡선을 도식화하고 모델에 적합시킵니다. 반응 속도론적 파라미터를 추정하기 위해, 데이터로부터 추정된 2차원 유효 결합 친화도와 해리 속도를 보여주는 결과를 도출합니다. 그렇다면 이 분석법의 아이디어는 어디에서 얻었을까요?

연구자들은 수용체-리간드 상호작용을 연구합니다. 주로 파단력을 측정하며 저희 또한 동일한 작업을 수행하고 있으나, 어느 날 저희는 접착이 없는 경우 0, 접착이 있는 경우 1이라는 이진 결과만을 측정하고, 이러한 0과 1의 측정값으로부터 역학 측정치를 도출하여 마이크로 파이펫 빈도 분석법을 보여줄 수 없을까 생각하게 되었습니다. 저희 실험실의 연구 과학자인 Veronica Zana Zina 박사가 여러분께 해당 실험을 보여드릴 것입니다.

전혈에서 분리한 적혈구를 접착 빈도 분석을 위해 비오틴화합니다. 이 절차를 시작하려면, 분리된 적혈구가 담긴 튜브를 원심분리하고, 적혈구 펠렛 10 µL를 여러 개의 바이알에 각각 분주한 다음, 각 바이알에 해당 양의 PBS를 추가하여 다양한 농도의 적혈구 비오틴 희석액을 준비합니다. 그다음, 각 바이알에 0.1 M borate buffer 10 µL를 추가합니다.

그 다음, 계산된 양의 biotin 용액을 각 바이알에 넣고 즉시 볼텍싱합니다. 각 적혈구 바이알을 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고, 실온의 로테이터에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 각 바이알에 EAS 45 버퍼를 넣고 2000 rotations per minute에서 2분 동안 원심분리합니다. EAS 45 버퍼를 이용한 세척 과정을 2회 더 반복하여 총 3회 세척합니다.

마지막으로, 각 바이알에 100 µL의 EAS 45 버퍼를 추가하고 4 °C에서 보관하여 적혈구 표면의 리간드를 기능화합니다. 이전 단계에서 비오틴화된 적혈구를 4 °C에서 포화 농도의 strep TTR과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, EAS 45 버퍼로 2000 rpm에서 2분 동안 세 번 세척합니다. 그 후, 적혈구를 비오틴화된 리간드와 직접 인큐베이션하거나, 적혈구를 해당 비오틴화 포획 항체와 먼저 인큐베이션한 다음 리간드와 인큐베이션합니다. 이 비디오에서 보여주는 프로토콜에서는 비오틴화 포획 항체를 사용합니다.

마이크로피펫은 융점이 낮은 붕규산 유리 모세관을 사용하여 제작합니다. 먼저 마이크로피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 모세관을 뽑아냅니다. 그다음, 마이크로 포지(micro forge)가 장착된 마이크로 매니퓰레이터(micro manipulator)를 사용하여 마이크로피펫의 팁을 원하는 크기의 개구부로 절단합니다.

필요한 직경은 보통 연구에 사용될 세포의 크기에 따라 1~5 µm 범위입니다. 세포 챔버를 준비하려면, 원하는 크기로 자른 현미경 커버글라스 두 장을 사용하고, 에어 더스터로 커버슬립의 먼지를 제거한 후, 세포 챔버 배지를 넣고 배지의 증발을 막기 위해 양쪽을 미네랄 오일로 밀봉합니다. 배지가 증발하면 실험 중에 삼투압이 변할 수 있습니다.

본 분석에 사용된 마이크로 피펫 시스템은 세 가지 하위 시스템으로 구성됩니다. 즉, 마이크로 피펫으로 흡입된 세포의 움직임을 관찰, 기록 및 분석하기 위한 이미징 하위 시스템, 세포 챔버에서 세포를 선택할 수 있게 하는 마이크로 조작 하위 시스템, 그리고 세포를 마이크로 피펫으로 흡입하기 위한 압력 하위 시스템입니다. 이미징 하위 시스템의 핵심 장비는 100배 오일 침강 렌즈가 장착된 도립 현미경입니다. 대물렌즈의 이미지는 전하결합소자(CCD) 카메라에 의해 감지되어 비디오 카세트 녹화기로 전송됩니다.

시간을 기록하기 위해 비디오 타이머를 시스템에 연결합니다. 마이크로 파이펫에 탈이온수를 채운 후, 현미경에 장착된 기계적 드라이브의 홀더에 파이펫을 배치합니다. 마이크로 파이펫은 3축 유압식 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 정밀하게 위치를 조정할 수 있습니다.

마이크로 피펫 홀더 중 하나는 컴퓨터로 프로그래밍된 압전 변환기에 장착되어 있습니다. 이를 통해 접착 테스트 사이클 동안 피펫을 정밀하게 이동시킬 수 있습니다. 압력 조절 서브시스템은 흡입력을 제어하는 데 사용됩니다.

실험 과정 동안, 유압 라인이 마이크로피펫 홀더와 유체 저장조를 연결합니다. 정밀 기계식 포지셔너를 통해 저장조의 높이를 정밀하게 조절할 수 있습니다. 챔버 조립 후 마이크로피펫을 설정하고, 챔버 내에 세포를 주입하여 분석을 시작합니다. 상호작용하는 세포들을 각각의 피펫으로 흡입하고, PSO 전기 트랜슬레이터를 사용하여 제어된 접촉 면적과 시간 동안 적혈구를 호중구에 접촉시키거나 떼어냅니다.

적혈구가 세포 분리 시 신장되면 접착 이벤트로 관찰하며, 적혈구가 신장되지 않으면 비접착 이벤트에 해당합니다. 엑셀 스프레드시트의 열에 접착 시 1, 비접착 시 0을 입력하여 관찰된 접착 이벤트를 기록하십시오.

각 접촉 시간당 최소 세 쌍의 서로 다른 세포 쌍을 사용하여 접촉 시간에 따른 접착 빈도 곡선을 기록하십시오. 대조군으로서 평균과 SEM을 얻기 위해, 관련 리간드로 코팅된 적혈구를 사용하거나 특정 기능적 차단제를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단함으로써 비특이적 결합 곡선을 기록하십시오. 단클론 항체의 경우, 비특이적 접착 빈도를 제거함으로써 각 접촉 시간 지점에서의 특이적 접착 빈도를 계산할 수 있습니다.

특이적 부착 빈도 대 접촉 시간 데이터는 한 종류의 수용체와 한 종류의 리간드 사이의 2차 정반응 및 1차 역반응 단일 단계 상호작용을 설명하는 확률 모델에 의해 피팅됩니다. 이 방정식에서 KA는 2D 친화도이며, KA는 2D 해리 속도입니다.

MR과 ML은 각각 수용체 및 리간드의 밀도이며, AC는 접촉 면적입니다. 곡선 피팅에는 ac, k, a, 그리고 K off라는 두 가지 파라미터가 있는데, 이는 AC와 KA가 하나로 묶여 총체적으로 유효 2D 친화력이라 불리기 때문이며, 이 값과 해리 속도(off rate)의 곱이 유효 2D 결합 속도(on rate)가 됩니다(AC K on = AC KA × K off). 여기에는 integrin alpha L beta two의 결정 예시가 나타나 있습니다.

중성구의 사이트 밀도. 중성구를 먼저 1 µg/mL의 E selectin IG로 배양한 후, PE가 접합된 anti-human CD 11 단클론 항체 또는 대조군으로 관련 mouse IgG1을 포화 농도로 첨가하였다. 30분간 배양 후 샘플을 세척하고 표준 설정의 유세포 분석기로 측정하였다.

밝은 PE 보정 비드. 패널 A는 보정 비드와 E selectin IG 처리 또는 미처리 세포의 형광 히스토그램을 보여준다. 특정 CD 11 A 단일클론 항체 염색은 실선으로, 관련 이소타입 일치 대조 항체 염색은 점선으로 표시되어 있다.

패널 B는 밀도 정량화 과정을 보여줍니다. 4개의 비드 각각의 평균 형광 강도에 대해 Log 10을 계산했습니다. 패널 A의 캘리브레이션 피크 값과 로트별 비드당 PE 분자 수를 사용하였습니다.

침입한 세포를 재선별하기 위해 비드당 PE 분자의 log 10 값과 형광의 log 10 값에 대한 선형 회귀 분석을 수행하였습니다. 특정 단클론 항체의 경우 log 10 fi 값은 파란색 채워진 원으로 표시된 3.99였으며, 대조 항체의 경우 파란색 빈 원으로 표시된 2.23이었습니다. X에 대한 선형 방정식을 풀었을 때, alpha L beta two 또는 호중구의 총 수는 9, 587개로 계산되었습니다.

중성구의 직경을 8.4 microns로 설정하여 표면 밀도를 계산한 결과, micron squared당 43개 사이트로 나타났습니다. 다음 그래프는 1초와 10초에서의 특이적 결합에 대한 접착 빈도 fi의 추이를 보여줍니다. 접촉 시간은 ICAM one이 코팅된 적혈구와 인테그린 alpha L beta two를 발현하는 인간 중성구 사이의 반복적인 접착 테스트 사이클을 통해 측정되었습니다.

이와 대조적으로, 여기에는 human IgG가 코팅된 적혈구와 integrin alpha L beta two를 발현하는 인간 호중구 사이의 반복적인 부착 테스트 사이클을 통해 측정된, 접촉 시간 1초 및 10초에서의 비특이적 결합에 대한 실행 부착 빈도 fi가 나타나 있습니다. 이 마지막 그래프는 I A one의 호중구 integrin alpha L beta two 결합 역학을 보여줍니다. 각 접촉 시간에서 세 쌍의 세포에 대해 측정된 부착 확률을 평균내어 접촉 시간에 따라 도식화함으로써 비특이적 결합을 제어하였습니다. 두 가지 서로 다른 조건이 사용되었습니다.

anti-TFC 포획 항체로 코팅된 적혈구를 ICAM-1 IgG 대신 human IgG와 함께 배양한 결과(1) 및 포획 항체로 코팅되지 않은 적혈구에 결합하는 중성구의 결과(2). human IgG 대조군 곡선으로 기록된 비특이적 결합을 이용하여 특이적 부착 확률 곡선을 얻었습니다. 비특이적 결합 보정을 위해 앞서 제시된 방정식을 사용하였습니다.

보정된 특이적 부착 확률 곡선은 모델 피팅을 통해 적합화되었습니다. 특이적 부착 확률 곡선을 통해 유효 결합 친화도를 도출하였습니다. CKA는 1.4 × 10⁻⁴ µm⁴이며, koff는 0.3 s⁻¹입니다.

이 영상을 시청한 후, 두 분자가 상호작용하는 세포 표면에 각각 고정되었을 때 수용체-리간드 상호작용 역학을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 접착 빈도가 중간 범위에 있도록 리간드 측 밀도 범위를 설정했던 초기 실험 내용을 기억하는 것이 중요하며, 혈액 및 특정 처리용 시약(예: sodium azide 및 DMSO)을 다루는 것은 매우 위험할 수 있음을 유의하십시오. 따라서 시약의 MSDS를 주의 깊게 읽고 절차 수행 중 장갑을 착용하는 등의 예방 조치가 필요합니다.