세포 Refolding 분석
January 24th, 2012
이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 열 충격 후 다시 접히는 샤페론 의존성 세포 내 단백질을 측정하는 것입니다. 먼저 luciferase reporter를 사용하여 luciferase reporter 유전자와 관심 chaperone을 코팅한 플라스미드로 세포를 transfection합니다. 그런 다음 실험 설계에서 회수 시점을 위해 형질 주입된 세포를 분할합니다.
다음 날에는 열충격을 가해 세포에 충격을 주어 단백질이 분비되도록 유도합니다. 회복이 세포 내 단백질 접힘을 회복할 수 있도록 한 다음 루시퍼라제 리포터 활성을 측정합니다. 결과는 루시페라제 분석을 기반으로 시간 의존적 단백질 재접힘을 측정합니다.
in vitro refolding assay와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 chaperone 활성에 대한 화합물 또는 단백질의 영향에 대한 생리학적 판독이 가능하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환이나 암과 같은 광범위한 질병의 치료로 확장되는데, 이는 보호자가 이러한 병리의 발달에 중요한 역할을 하기 때문입니다. 먼저 수조에서 배양 배지, PBS 및 트립신을 섭씨 37도로 예열합니다.
HEK 2 93 세포의 합류 배양액을 5ml의 PBS로 세척합니다. 그런 다음 0.025%EDTA가 함유된 트립신 1ml를 바르고 플레이트를 부드럽게 회전시켜 트립신이 고르게 분포되도록 한 다음 섭씨 37도에서 배양합니다. 주기적으로 플레이트를 흔들어 세포 분리를 확인합니다.
이제 res는 10 ml의 완전한 DMEM 배지에 세포를 현탁시키고 50 ml 팔콘 튜브로 이동합니다. 그런 다음 Beckman 카운터 플레이트를 사용하여 셀을 열거합니다. 세포는 약 60-70%의 유창성으로 6-8시간 동안 배양합니다.
극단적인 유전자, 9개의 시약을 실온에 평형화하고 혈청이 없는 배지의 분취액을 섭씨 37도까지 평형화합니다. 무혈청 배지를 두 개의 einor 튜브에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 einor tube 벽을 건드리지 않고 극한의 gene nine 시약을 첨가하여 실온에서 5분 동안 배양합니다.
그 동안 튜브 1에서 2D NA transfection mixes를 준비하고 튜브 2에 ran vanilla firefly와 빈 벡터 대조군을 추가합니다. 런 바닐라 반딧불이와 분자 샤페론을 추가합니다. DNA를 transfection 시약 믹스 와류에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
이 혼합물을 도금된 세포에 계속 첨가하고 24시간 동안 배양합니다. 6개의 well plate에서 60-70%co의 유창성으로 trypsin seed cell을 사용하여 transfection된 세포를 채취한 후 incubator에 하룻밤 동안 방치합니다. 형질주입된 세포에서 배지를 흡인합니다.
그런 다음 1ml의 열 충격 완충액을 추가하고 30분 동안 배양합니다. Denovo 단백질 합성을 중지하려면 파라폼 스트립으로 뚜껑을 밀봉하고 섭씨 45도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 이제 파라폼을 제거하고 지정된 시점에서 복구를 위해 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
세포를 수확하고 PBS에서 한 번 세척합니다.효율적인 세포 용해 스냅을 위해 세포 펠릿을 액체 질소로 동결하고 200마이크로리터의 희석된 수동 용해 완충액을 추가합니다. 이제 삼중으로 분수합니다. 96 웰 플레이트의 웰 당 30 마이크로 리터의 세포 용해물.
transfection 효율을 평가하려면 충격을 주지 않은 reference 샘플부터 시작합니다. ran 루시페라아제 활성을 측정하기 위해, 1 밀리몰 A TP 및 0.2 마이크로몰 에진 반응 완충액을 포함하는 gly Gly 완충액 반응 완충액에 새로운 0.2 밀리몰 루시퍼를 준비합니다. 광도계에 96웰 플레이트를 삽입하고 프로그램을 시작합니다.
Wallach 1420 워크스테이션. 0.2 마이크로몰 ezine 반응 완충액이 들어 있는 Falcon 튜브에 펌프 1을 삽입합니다. 메뉴에서 선택, 디스펜서 유지 관리 옵션을 선택하고 펌프 하나를 선택하십시오.
채우기 옵션을 선택하여 플레이트 레이아웃을 편집합니다. 옵션을 선택하고 메뉴에서 프로토콜 및 결과를 탐색합니다. 프로토콜을 선택합니다.
이제 읽을 우물을 선택합니다. Wallach 관리자로 돌아가서 시작을 클릭하여 샘플 배출량을 측정합니다. 482나노미터에서 디스펜서 유지보수를 진행하고 빈 용액을 선택하고 하나를 펌핑하여 모든 잔류 용액을 튜브로 다시 방출합니다.
이제 튜브를 물이 들어있는 매로 옮기고 진드기, 플러시합니다. 비어 있음을 선택하여 계속합니다. 그런 다음 펌프 1의 튜브를 반응 버퍼에 넣고 펌프 2의 튜브를 루시퍼 용액에 넣습니다.
플레이트 레이아웃을 변경합니다. 펌프 1과 펌프 2에 대한 충전을 선택합니다. 디스펜서 유지 관리 메뉴에서 프로토콜을 선택하고 560나노미터의 반딧불이 루시퍼라제 반응 파장 측정을 시작합니다.
반복이 끝나면 비우고, 플러시하고, 비우는 절차를 반복하십시오. 펌프 1 및 펌프 2의 경우 Wallach 1420 Explorer에서 결과를 확인합니다. 각 실험은 분석과 관련이 있습니다.
숫자 사용자 이름 시작 및 종료 날짜는 결과를 Excel 파일로 내보냅니다. 분석을 위해 단백질 재접힘은 회복 시간과 직접적인 관련이 있습니다. 이 실험에서는 열 충격 후 다른 시점에서 세포를 평가합니다.
분자 샤페론의 부재 및 존재 하에서. 예상한 대로, 다시 접힌 루시페라아제의 비율은 대조군과 분자 샤페론으로 형질 주입된 세포 모두에서 회복 시간이 길어질수록 증가합니다. 대조적으로, 유효하지 않은 데이터 세트는 시간과 재폴딩 간의 상관 관계에 대해 좋지 않은 R 제곱 값을 표시합니다.
이 기술에 따라 샤페론의 효소 활성 억제와 같은 추가 질문에 답하기 위해 체외 TPA 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 내 단백질을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 히치 쇼크 후 따라갑니다.
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개요
이 프로토콜은 열 충격 후 세포내 단백질 리폴딩을 측정하는 방법을 설명하며, 분자 샤페론의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 반짝이벌�레 발광효소 활성은 샤페론 리폴딩 활동을 평가하는 보고자로 사용됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 단백질 폴딩
- 분자 샤페론
배경
- 단백질 리폴딩 이해는 세포 기능에 매우 중요합니다.
- 열 충격은 단백질 풀림을 유도하여 리폴딩 메커니즘을 필요로 합니다.
- 분자 샤페론은 리폴딩 과정을 도와줍니다.
- 발광효소 분석은 리폴딩 활동의 정량적 측정을 제공합니다.
연구 목적
- 샤페론 의존적 세포내 단백질 리폴딩을 측정합니다.
- 열 충격이 단백질 구조에 미치는 영향을 조사합니다.
- 발광효소를 샤페론 활동 평가를 위한 보고자로 활용합니다.
사용된 방법
- 발광효소 및 샤페론 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 도입합니다.
- 도입 후 복구 시간 지점을 설정합니다.
- 단백질 풀림을 촉진하기 위해 열 충격을 유도합니다.
- 리폴딩 효율을 평가하기 위해 발광효소 활동을 측정합니다.
주요 결과
- 단백질의 시간 의존적 리폴딩이 관찰되었습니다.
- 발광효소 분석을 통해 샤페론 활동이 확인되었습니다.
- 결과는 단백질 복구에 있어 샤페론의 효과성을 지지합니다.
- 데이터는 세포 스트레스 반응에 있어 분자 샤페론의 역할을 지지합니다.
결론
- 이 방법은 열 충격 후 단백질 리폴딩을 효과적으로 측정합니다.
- 발광효소 분석은 샤페론 활동 연구를 위한 신뢰할 수 있는 도구입니다.
- 연구 결과는 세포 내 단백질 홈스태시스 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
