세포 Refolding 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 열 충격 후 샤페론 의존적인 세포 내 단백질 재접힘을 측정하는 것입니다. 루시퍼레이스 리포터를 사용하여 먼저 루시퍼레이스 리포터 유전자와 관심 샤페론을 포함하는 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 그 후, 실험 설계에 명시된 회복 시간대에 맞춰 형질전환된 세포를 분할합니다.

다음 날, 세포에 열 충격(heat shock)을 가하여 단백질의 변성을 유도합니다. 세포 내 단백질 접힘이 회복되도록 대기한 후, 루시페라아제 리포터 활성을 측정합니다. 결과는 루시페라아제 분석법을 기반으로 시간에 따른, 그리고 샤페론(chaperone) 의존적인 단백질 재접힘 정도를 측정합니다.

in vitro 리폴딩 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 화합물이나 단백질이 샤페론 활성에 미치는 영향에 대해 생리학적 판독값을 얻을 수 있다는 점입니다. 샤페론은 이러한 병리적 현상의 발달에 중요한 역할을 하기 때문에, 이 기술의 활용 범위는 신경퇴행성 질환이나 암과 같은 광범위한 질병의 치료까지 확대됩니다. 먼저, 배양액, PBS 및 트립신을 항온수조에서 37 °C로 예열하십시오.

합류(confluent) 상태의 HEK 2 93 세포 배양물을 5 mL의 PBS로 세척합니다. 그다음 0.025% EDTA가 포함된 트립신 1 mL를 처리하고, 트립신이 고르게 분산되도록 플레이트를 부드럽게 회전시킨 후 37 °C에서 배양합니다. 주기적으로 플레이트를 흔들어 세포의 탈락 여부를 확인합니다.

이제 세포를 10 milliliters의 완전 DMEM 배지에 다시 부유시킨 후 50 milliliter 팰콘 튜브로 옮깁니다. 그다음 Beckman 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포를 약 60-70% 합류도(confluency)로 분주하고 6-8시간 동안 배양합니다.

extreme gene, nine 시약은 실온에서, 무혈청 배지 분주는 37°C에서 평형화합니다. 무혈청 배지를 두 개의 einor 튜브에 피펫팅합니다. 그다음 einor 튜브 벽면에 닿지 않게 extreme gene nine 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그동안 1번 튜브에 2D NA transfection 혼합물을 준비하고, 2번 튜브에는 ran vanilla firefly와 공벡터 대조군(empty vector control)을 추가합니다. ran vanilla firefly와 분자 샤페론(molecular chaperone)을 추가합니다. transfection 시약 혼합물에 DNA를 넣고 볼텍싱(vortex)한 후 실온에서 20분 동안 배양합니다.

이 혼합물을 플레이팅된 세포에 계속 추가하고 24시간 동안 배양합니다. trypsin을 사용하여 형질전환된 세포를 수확하며, 6-웰 플레이트에서 60~70% 합류도로 세포를 파종하고 하룻밤 동안 인큐베이터에 둡니다. 형질전환된 세포에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

그 다음 heat shock buffer 1 mL를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 신규 단백질 합성을 중단시키기 위해 파라필름 스트립으로 뚜껑을 밀봉하고 45 °C 항온수조에서 30분 동안 배양합니다. 이제 파라필름을 제거하고 세포를 다시 인큐베이터에 넣어 지정된 시간 동안 회복시킵니다.

세포를 수확하고 PBS로 한 번 세척합니다. 효율적인 세포 용해를 위해 세포 펠렛을 액체 질소로 급속 냉동시킨 후, 희석된 passive lysis buffer 200 µL를 첨가합니다. 이제 이를 3회 반복 분주합니다. 96 웰 플레이트의 각 웰당 30 µL의 세포 용해물을 넣습니다.

형질전환 효율을 평가하기 위해, 전기충격을 가하지 않은 대조군 샘플부터 시작하십시오. ran 루시페라아제 활성을 측정하려면, 1 millimolar ATP와 0.2 micromolar ezine 반응 버퍼가 포함된 0.2 millimolar Lucifer in gly Gly 버퍼 반응 버퍼를 새로 준비하십시오. 96-웰 플레이트를 루미노미터에 넣고 프로그램을 시작하십시오.

Wallach 1420 워크스테이션입니다. 0.2 µM ezine 반응 버퍼가 들어 있는 Falcon 튜브에 펌프 1을 넣습니다. 메뉴에서 디스펜서 유지관리(dispenser maintenance) 옵션을 선택하고 펌프 1을 체크하십시오.

플레이트 레이아웃을 편집하려면 채우기(fill) 옵션을 선택하십시오. 옵션을 선택하고 메뉴에서 프로토콜 및 결과를 살펴보십시오. 프로토콜을 선택하십시오.

이제 읽어낼 웰을 선택하십시오. Wallach manager로 돌아가 시작을 클릭하여 시료의 방출량을 측정합니다. 482 nanometers에서 디스펜서 유지 관리로 이동하여 empty and pump one을 선택해 잔여 용액을 모두 튜브로 다시 배출하십시오.

이제 튜브를 물이 담긴 팰콘 튜브로 옮기고 틱(tick)하여 플러싱합니다. 이어서 'empty'를 선택하십시오. 그런 다음 펌프 1의 튜브는 반응 버퍼에, 펌프 2의 튜브는 LUCIFERIAN 용액에 넣으십시오.

플레이트 레이아웃을 변경하십시오. 펌프 1과 펌프 2에 대해 fill(채우기)을 선택하십시오. 디스펜서 유지보수 메뉴에서 프로토콜을 선택하고, 560 nanometers의 파장에서 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase) 반응 측정을 시작하십시오.

반복 과정이 끝나면 비우기, 세척, 비우기 절차를 다시 반복하십시오. 펌프 1과 펌프 2의 결과는 Wallach 1420 Explorer에서 확인하십시오. 각 실험은 하나의 분석법과 연계됩니다.

사용자 이름을 입력하고 시작 및 종료 날짜를 설정한 후 결과를 Excel 파일로 내보내십시오. 분석을 위해 단백질 재접힘은 회복 시간과 직접적인 관련이 있습니다. 본 실험에서는 열 충격 후 서로 다른 시점에서 세포를 평가합니다.

분자 샤페론의 부재 및 존재 하에서의 결과입니다. 예상대로, 대조군과 분자 샤페론이 형질전환된 세포 모두에서 회복 시간이 길어짐에 따라 루시페라제의 재접힘 비율이 증가합니다. 반면, 유효하지 않은 데이터 세트에서는 시간과 재접힘 사이의 상관관계에 대한 R squared 값이 낮게 나타납니다.

이 기법 이후, 샤페론의 효소 활성 억제와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 in vitro TPA 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 열 충격 이후의 세포 내 단백질 측정 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.