Name: 세포 Refolding 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 세포 내 단백질 리폴딩 측정 방법을 열충격 후 분자 채퍼론 활성을 루시퍼레이스 리포터로 평가합니다. 이 기법은 단백질 항상성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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다닐 Maddalo 기술의 카를 스루에 연구소에서 젊은 탐정 그룹 (YIG)와 같은 연구 활동의받는 사람입니다.

1. 세포를 심는 <ol><li> 시작하기 전에, 37에서 물을 욕조에있는 문화 매체, PBS 1X와 트립신을 따뜻하게 ˚ C </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 매체를 기음. </li><li> 부드럽게 그들을 씻어 세포에 PBS 1X의 5 ML을 적용합니다. </li><li> PBS 1X를 기음과 트립신은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0,025퍼센트를 포함하는 1 ML을 적용합니다. </li><li> 부드럽게 트립신의 균등을 접시를 회전. </li><li> 37 인큐베이터에있는 세포를 장소 ˚ C 50-10분에 대한 (세포 종류에 따라). 시간 체크인 시간부터 세포 판을 흔들어으로 분리하는 경우. </li><li> 매체의 10-20 ML에있는 세포를 Resuspend하고 50 ML 팔콘 튜브에서 그들을 수집합니다. </li><li> 베크 만 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 세포의 숫자는 약 60~70%의 합류를 위해 충분해야합니다. </li><li> 플레이트 세포를 및 6~8시간위한 씨앗에게 있습니다. </li></ol> 2. 트랜스fection <ol><li> 이전 transfection하기 ˚ C. 37 물이 욕조에서 혈청 무료 매체의 나누어지는을 따뜻하게 </li><li> 상온에 X - treme 진 9 가져와. </li><li> 이 eppendorf 튜브에서 혈청 무료 매체 (1 관 = 1 transfection) Pipet. </li><li> Pipet 끝 5 분 동안 eppendorf과 부화의 플라스틱 벽에 닿으면하지 않는 혈청 무료 매체를 지불 관심의 X - treme 진 9. 그동안 두 DNA 믹스를 준비 : 한 튜브에 다른 튜브 renilla, 반​​딧불과 분자 보호자에 renilla, 반​​딧불 그리고 빈 벡터 제어에 대한 plasmids 함께 섞는다. </li><li> 혈청 무료 매체에게 + X - treme 진 9, 20 분 상온에서 와동과 부화를 포함하는 각 eppendorf로 DNA 믹스를 추가합니다. </li><li> 37 24 시간 동안 각 판과 부화에 각각의 혼합 dropwise 추가 ° C와 5퍼센트 CO 2 </li></ol> 3. 분할 세포에게 <ol><li> 24시간 transfection, tryps 후1.4에서 설명한대로 세포 inize - 1.6과 6에서 잘 플레이트 60~70%의 최종 confluency로 희석. </li><li> 이외 충격 제어 한 접시를 준비하고 분석해야 복구 시간 포인트만큼 접시대로 그림 보여주었다. 2. </li></ol> 4. 열 충격 <ol><li> 열 충격에 대한 사전 따뜻한 혈청 37 물 목욕으로 매체를 포함 ˚ C. </li><li> 20 MM 20 μg / ML 및 맙스의 최종 농도 혈청이 포함된 매체 cycloheximide에 diluting하여 준비 '열 충격 버퍼. </li><li> 이제 인큐베이터에서 접시를 꺼내와 매체를 기음. </li><li> '열 충격 버퍼'의 각 잘 한 ML에 추가, 37 30 분 품어 ˚ C와 CO 2의 5 % (또한이 치료의 참조 플레이트 포함). 이것은 드 노보 단백질 합성 중단됩니다. </li><li> 물 목욕에있는 동안 스위치와 t를 설정45 emperature ˚ C. </li><li> 부화 후, 이전에 스트 라이프의 컷 Parafilm와 접시의 뚜껑을 밀봉. 참조 플레이트 (refolfed 반딧불의 100 %)은 보육에 남아있다. </li><li> ˚ C 30 분 45 접시를 품어. </li><li> 물 목욕에서 접시를 제거 parafilm을 제거하고 복구를 허용하도록 인큐베이터에 다시 번호판을 넣어. </li><li> 각 시점의 수확 세포에서 4에서 1 분간 2000Xg에서 ˚ C를 centrifuging하여 PBS 1X에서 그들을 씻어 </li></ol> 5. 세포 용해와 루시페라제 분석 <ol><li> 효율적인 세포 용해 들면, 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결 스냅. </li><li> 유리관을 두 번 증류수로 1:5 희석 수동 용해 완충액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 96 잘 접시에있는 세포 lysate 30 μl를 추가합니다. 각 예제는 세중의에 pipetted 있습니다. </li><li> 오직 '비 충격'참조 샘플이 사용됩니다이 단계는 동일 transfection 효율을 확인하는 데 사용됩니다 이후 renilla 루시페라제 활동을 참조하십시오. </li><li> 분석을위한 솔루션을 준비합니다. Gly - Gly 버퍼에 0.2 mm의 최종 농도를 희석 luciferin luciferin 솔루션하십시오. 반응 버퍼에 대한 Gly - Gly 버퍼 1mM DTT 최종 농도와 ATP를 희석. coelenterazine 반응 버퍼, coelenterazine 버퍼에서 0.2 μm의의 최종 농도를 희석 coelenterazine. luciferin 솔루션과 coelenterazine 반응 버퍼 빛을 보호 유지. </li><li> 이제 luminometer에서 96 - 웰 플레이트를 배치하고 프로그램 'Wallac 1420 워크 스테이션'을 시작합니다. </li><li> coelenterazine 솔루션을 포함하고있는 팔콘 튜브에 Pump1을 소개합니다. 더 빛이 튜브와 접촉하지 수 있도록 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 옵션 '디스펜서 관리'메뉴에서 선택하고 Pump1을 체크. </li><li> 옵션 '채우기'를 선택하십시오. </li><li> 플레이트 레이아웃 옵션을 선택 편집하려면 메뉴에서 '프로토콜과 결과를 탐험해보세요. 그것의 프로토콜과 더블 클릭을 선택합니다. 이제 우물을 읽을 수 선택합니다. </li><li> 'Wallac 관리자'로 가서 '시작'을 클릭하십시오. renilla 루시페라제과 기판 coelenterazine 사이의 반응은 482 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께. </li><li> 읽고 나면, '디스펜서 유지 보수'에 가서 튜브로 모두 잔류 솔루션을 공개하는 '비우기'를 Pump1를 선택합니다. </li><li> 지금 물을 포함하는 팔콘 튜브에 튜브를 이동하고 '플러쉬'를 체크. </li><li> 세정 단계 후, '비우기'를 선택하여 튜브를 비웁니다. </li><li> 반응 버퍼 팔콘 튜브에 Pump1 및 luciferin 팔콘 튜브 Pump2에서 하나의 튜브를 놓습니다. </li><li> 플레이트 레이아웃을 변경합니다. </li><li> '디에서 Pump1 및 Pump2에 대해'채우기 '를 선택하십시오스펜서 관리 '메뉴. </li><li> 프로토콜을 선택하고 읽기를 시작합니다. 반딧불의 루시페라제과 기판 luciferin 사이의 반응은 560 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께. </li><li> 독서의 끝에 Pump1 및 Pump2에 대한 빈 플러쉬 비어 절차를 반복합니다. </li><li> 결과는 'Wallac 1,420 탐색기'에서 지금 사용할 수 있습니다. </li><li> 각 실험 분석 번호로 연결되어 있습니다, 시작 날짜와 종료 사용자 이름입니다. </li><li> 결과는 이제 엑셀 파일로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 1 : 계산 들면, 세포는 세 그룹으로 나뉘어져 있습니다. 비 충격을 기준 시료 (100 %가 반딧불 루시페라제을 refolded로 설정) 2. 충격 분자 보호자와 열없이 세포 3. 분자 보호자와 더위와 함께 세포는 충격. </li></ol> 6. 대표 결과 시스템이 프로를 작동하면 단백질 refolding 직접 테스트하는 것이 회복의 시간과 관련이 perly, 분석은 다른 시간 지점에서 세포를 수집 수행되어야한다. 직접 상관 시간 / refolding의 비율이 실험이 제대로 수행하고 따라서 제한 요소를 나타냅니다되었음을 나타냅니다. 그러나 그것은 항상 열 충격 후 refolding 것은 포화 이벤트이며, 따라서 적절한 시간 코스 분석이 어떤 실험을 시작하기 전에 수행되어야한다는 것을 고려하여야한다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 실험의 개요. 생체내의 refolding 분석에 완료해야 3-4일이 필요합니다. 일 1 세포는 씨앗과 transfected 있습니다. 그 다음날 세포가 작은 형식으로 splitted하고 3 일, 그들이 열 충격입니다. 이 시점에서 바로 세포를 수확 후 루시페라제 분석을 수행하거나 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장하고 다른 순간에 분석을 수행할 수 있습니다 _content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 셀 분할. 일 2 세포는 6 자 판으로 분할됩니다. 각 transfection은 같은 접시에 모든 transfection을 위해 잘으로 희석한다. 각 플레이트는 특정 복구 시간 플러스 아닌 충격 참조 플레이트에 해당됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 대표 좋은 결과. refolding의 A. 비율 직접 반딧불 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재 (검은 선)과 보호자의 존재 (빨간색 선)에 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계. R 제곱 값은 좋은 상관 관계를 나타냅니다. Fi 인터넷에g.3A는 세포가 15, 30, 45, 60 120분 부재의 열 충격 (검은 막대) 후 분자 보호자의 존재 (빨간색 막대)에 수집된 담당자 결과를 볼 수 있습니다. 비율은 장기 복구 시간과 분자 보호자의 transfection과 루시페라제 증가 refolded. refolding와 시간 제어 (그림 3B, 블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (그림 3B, 레드 라인) 사이의 상관 관계가 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 대표 나쁜 결과. refolding의 A. 비율 직접 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재와 존재의 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계 (빨간색 리터보호자의 오프라인). R 제곱 값은 나쁜 상관 관계를 나타냅니다. 그림 4A가. 제대로 수행되지 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다. 제어 (검은 막대)와 분자 보호자 - transfected 세포 (적색 바) 모두 시간과 refolding 단백질의 증가를 표시하지 않았다. 또한, 분자 보호자의 transfection은 refolding의 증가의 결과 않았어요. 이 불쌍한 상관 관계는 그림에 확인됩니다. 컨트롤 (블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (빨간색 선)에 대한 각각 0.6619과 0.1882의 R 제곱 값을 보여주는 4B.

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 작품에서는 분자 보호자의 세포내 refolding 활동을 측정하는 프로토콜이 제공됩니다. 그림의 개요에 의해 그림과 같이 전체 분석은 3-4일에서 수행할 수 있습니다. 1. 반딧불과 renilla 루시페라제에 의해 만들어진 빛의 신호의 견고하고 선형이 프로토콜의 재현성위한 견고한 기반을 나타냅니다. 분석의 중요한 단계는 분자 보호자와 반딧불의 루시페라제의 overexpression을 보장하기 위해 효율적인 transfection 시약의 선택입니다. 리포터 유전자는 adenoviral 감염 12 electroporation과 같은 다른 방법 또한 제공 수 있습니다. 반딧불의 루시페라제의 유전자가 안정 transfected있는 동안 또 다른 가능성은, 보호자의 표현 (테트라 사이클린 - 응답 발기인 예를 들어) 13 화학적 i...

본 실험에서는 Luminometer 양식 Perkin 엘머 &#39;1420 발광 카운터 &#39;벡터 라이트&#39;가 사용되었다 Luminometer를위한 프로그램 : Renilla : 펌프 1, 100 μl 주입 반응 버퍼 : Pump1, 70 μl 주입 Luciferin : Pump2, 30μl 주입 버퍼는 두 번 증류수에서 이러한 재고 솔루션을 준비 경우 : <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4 : 일리터에서 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA : 일리터에서 190,18 g EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4 : 일리터에서 136,09 g KH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4 : 228,23 g K 2 HPO 일리터 4 * 3H 2 O </li><li> - 5M NaCl : 일리터에서 292,2 g NaCl </li><li> - 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 일리터에서 186,12 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) * 2 시간 2 O &nbsp;</li></ul> GLY - GLY 버퍼 : <ul style="list-style:none"><li> - 25mM Glycylglycin </li><li> - 15mM MgSO 4 </li><li> - 4mm짜리 EGTA </li></ul> 에 대한 Glycylglycin의 1리터 사용 3,3 g, MgSO4 1M 솔루션과 0,5 M EGTA 솔루션의 8ml의 15ml. 물에 해결, 7,8로 산도를 조정 1 리터의 총 볼륨에 가져와. Renilla / Coelenterazine 버퍼에 대한 반응 완충액 : <ul style="list-style:none"><li> - &amp; NBSP, 13,4 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li></ul> 1M KH 2 PO 4 용액의 1리터 사용 13,4 ML 들어, 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 5M NaCl 솔루션과 2ml의 100ml 1M K 2 HPO 4 용액의 86,6 ML. <table border="1"><tr><td></td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 제품 수량 : </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco의 수정된 이글 중간 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 골드 </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> X - treme 진 구 DNA의 Transfection 시약 </td><td> 호슈 </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco의 인산은 식염수 1X를 버퍼 </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> 맙스 3 - (N - Morpholino) Propanesulfonic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> 수동적 용해 완충액 5 배 </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> 시그마 - 올드 리치 로스 로스 </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 로스 로스 로스 로스 </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin 반딧불 </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> 로스 </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (아데노신 Triphosphate) </td><td> 호슈 </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

세포 refolding 분석

Intracellular Refolding Assay

이 프로토콜은 셀 기반 시스템 및 억제 / 자극 활동 화합물의 가능한 영향의 분자 보호자의 효소 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 분자 보호자는 1 접는 단백질의 조절에 관여 단백질이며 열충격 2, 영양 기아와 화학 물질 / 독극물 3 노출과 같은 스트레스를 모욕시 세포 생존을 증진에 중요한 역할을했습니다. 이러한 이유로 보호자는 종양이 개발, 암 세포 4 chemioresistance뿐만 아니라 neurodegeneration 5와 같은 행사에 참여하기 위해 볼 수 있습니다. 이러한 효소의 활동을 억제하거나 자극하는 작은 분자 수있는 디자인 따라서 암 치료 7 neurodegenerative 장애 9 가장 공부 전략 중 하나입니다. 여기에서 설명한 분석은 특정 분자 보호자의 refolding 활동을 측정하고 광고의 효과를 연구하기위한 가능성을 제공합니다그 활동 ounds. 이 방법에서는 조사 분자 보호자의 유전자는 반딧불 루시페라제 유전자에 대한 발현 벡터 인코딩과 함께 transfected이다. 그것은 이미 denaturated 반딧불 루시페라제이 분자 보호자 10,11으로 refolded 수 있습니다 설명했습니다. transfection 제어를 정규화로 renilla 루시페라제 유전자에 대한 벡터 인코딩 transfected이다. 이 프로토콜에 설명된 모든 transfections는 HEK - 293 세포에서 X - treme 진 11 (Roche는)로 수행됩니다. 첫 번째 단계에서 단백질 합성은 cycloheximide와 세포를 치료에 의해 저해됩니다. 이후 전개 단백질은 30 분 동안 45 ° C에서 열 충격에 의해 유발됩니다. 37 복구시 ° C는 단백질이 다시 접혀들의 적극적인 형태로와 반딧불의 루시페라제의 활동이 읽기 - 아웃로 사용됩니다 더욱 빛이 생산되고, 더 많은 단백질이 원래의 형태를 다시 놓이게됩니다. 비 열 충격 전지 참조 (refolded 100 %로 설정됩니다루시페라제).

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

다음 실험의 전반적인 목표는 열 충격 후 샤페론 의존적인 세포 내 단백질 재접힘을 측정하는 것입니다. 루시퍼레이스 리포터를 사용하여 먼저 루시퍼레이스 리포터 유전자와 관심 샤페론을 포함하는 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 그 후, 실험 설계에 명시된 회복 시간대에 맞춰 형질전환된 세포를 분할합니다.다음 날, 세포에 열 충격(heat shock)을 가하여 단백질의 변성을 유도합니다. 세포 내 단백질 접힘이 회복되도록 대기한 후, 루시페라아제 리포터 활성을 측정합니다. 결과는 루시페라아제 분석법을 기반으로 시간에 따른, 그리고 샤페론(chaperone) 의존적인 단백질 재접힘 정도를 측정합니다.in vitro 리폴딩 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 화합물이나 단백질이 샤페론 활성에 미치는 영향에 대해 생리학적 판독값을 얻을 수 있다는 점입니다. 샤페론은 이러한 병리적 현상의 발달에 중요한 역할을 하기 때문에, 이 기술의 활용 범위는 신경퇴행성 질환이나 암과 같은 광범위한 질병의 치료까지 확대됩니다. 먼저, 배양액, PBS 및 트립신을 항온수조에서 37 °C로 예열하십시오.합류(confluent) 상태의 HEK 2 93 세포 배양물을 5 mL의 PBS로 세척합니다. 그다음 0.025% EDTA가 포함된 트립신 1 mL를 처리하고, 트립신이 고르게 분산되도록 플레이트를 부드럽게 회전시킨 후 37 °C에서 배양합니다. 주기적으로 플레이트를 흔들어 세포의 탈락 여부를 확인합니다.이제 세포를 10 milliliters의 완전 DMEM 배지에 다시 부유시킨 후 50 milliliter 팰콘 튜브로 옮깁니다. 그다음 Beckman 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포를 약 60-70% 합류도(confluency)로 분주하고 6-8시간 동안 배양합니다.extreme gene, nine 시약은 실온에서, 무혈청 배지 분주는 37°C에서 평형화합니다. 무혈청 배지를 두 개의 einor 튜브에 피펫팅합니다. 그다음 einor 튜브 벽면에 닿지 않게 extreme gene nine 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.그동안 1번 튜브에 2D NA transfection 혼합물을 준비하고, 2번 튜브에는 ran vanilla firefly와 공벡터 대조군(empty vector control)을 추가합니다. ran vanilla firefly와 분자 샤페론(molecular cha

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 산성 및 열 스트레스 하에서 기질 단백질에 대한 샤페론 활성을 평가하기 위한 형광 분광광도계 기반 분석법을 시연합니다. 이 문서는 빛 산란을 통한 기질 전개 및 집적 모니터링 단계, 인솔이 있는 상태와 없는 상태 비교를 설명합니다.

모델 단백질의 열 전개를 통한 박테리아 샤페론 활성 평가

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

이 동영상은 형질주입된 포유류 세포의 핵에서 발현되는 형광 표지된 잘못 접힌 루시페라제 돌연변이 단백질의 분해 역학을 연구하기 위한 체외 형광 기반 마이크로플레이트 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 돌연변이 단백질을 발현하는 세포를 번역 억제제와 프로테아좀 억제제로 처리하여 잘못 접힌 단백질의 프로테아좀 매개 분해를 평가하는 것을 포함합니다.

형광 마이크로플레이트 기반 시클로헥시미드 추적 분석: 형광 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 역학을 모니터링하는 기술

세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을...

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

여기 고품질의 비타민 A / RBP의 복잡하고 STRA6, RBP 수용체가 비타민에게 교통편을 공부하는 두 실시간 모니터링 기술을 생산하는 최적의 기술을 설명합니다.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을...

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

학습하세요 세포 내 단백질 리폴딩 측정 방법을 열충격 후 분자 채퍼론 활성을 루시퍼레이스 리포터로 평가합니다. 이 기법은 단백질 항상성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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