Name: 교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 교감 신경 뉴런의 1차 배양 및 BMP-7 또는 Matrigel을 이용한 선택적 돌기 성장 유도 방법을. 이 기술은 신경 발달 및 형태형성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 보건원 (보조금 R21 NS45037와 R01 ES014901)에서 기금에 의해 지원되었다.

1. 문화 매체의 준비 (C2 매체) <ol><li> 멸균, 일회용 500 ML Erlenmeyer 플라스크에 나열된 순서대로 다음을 추가 : <table border="1"><tbody><tr><td> 양 </td><td> 구성 요소 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 190 ML </td><td> DMEM (낮은 혈당) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 지방산 무료 BSA (DMEM에 20mg/ml) </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> 2.8 ML </td><td> L-글루타민 </td><td> 1.4 MM </td></tr><tr><td> 네 ML </td><td> 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄 (100x) </td><td> 10 μg / ML 인슐린 5.5 μg / ML 트랜스페린 38.7 nm의 셀레늄 </td></tr><tr><td> 0.4 ML </td><td> NGF (125 μg / ml) 쇼핑 </td><td> 100 NG / ML </td></tr><tr><td> 200 ML </td><td> 햄 F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> 부드럽게 t 소용돌이17 X 100 멸균 스냅 캡 튜브의 튜브마다 O 믹스와 나누어지는 10 ML. </li><li> -80에서 보관 ° C </li><li> 중요 사항 : <ul type="disc"><li> 사용법은 즉시 이전 NGF를 녹여. </li><li> NGF 주식 솔루션을 aliquoting 전에 precoat는 단백질과 조직 배양 플라스틱 serological pipet의 내부 벽은 플라스틱으로 NGF의 고집 최소화합니다. 가장 쉬운 접근 방법은 BSA 여러 번 포함된 DMEM 혼합물을 피펫하는 것입니다. DMEM 혼합물로 NGF 튜브를 여러 번 씻어. </li><li> 무료 시스테인은 인슐린에 이황화 채권을 불안정하게 만들지 수 있기 때문에 F-12 마지막에 추가합니다. </li><li> 카포 네 결정이 형성 수 있기 때문에 볼륨이 큰 10 ML을 동결하지 마십시오 </li><li> 2 배 이상의 C2 미디어를 동결 - 해동하지 마십시오. </li></ul></li></ol> 2. 유리 Coverslips의 작성 <ol><li> 우리는 훌륭한 독일어 유리 coverslips가 (추천 소스 및 카탈로그 번호를 표 1 참조)이 프로토콜에서 일관되게 작동 것으로 나타났습니다. </li><li> polytetrafluoroethylene (PTFE 또는 테플론) 뚜껑 라이너 (피셔 카탈로그 # 09-911-765) 300 ML 유리 표본 병 70 % 질산의 75-100 ML을 추가합니다. </li><li> 장갑을 끼고, 드롭 질산 용액에 하나씩 coverslips. 항아리의 바닥 더이상의 2-3보다 coverslips 두꺼운 레이어를 만들기 위해 충분한 coverslips를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 더 이상 185 이상의 RPM에 궤도 흔드는 세트 상온에서 6-8시간 대한 coverslips과 용기를 흔들. </li><li> 퓸 배출 후드에 근무하는 것은 신중하게 산성을 가만히 따르다 및 지역 규정에 따라 폐기. 극도로 순수한 조직 문화 등급 물로 한번 coverslips을 씻어 다음 컨테이너에 75-100 ML 물을 추가합니다. 물이 뿌옇게되는 경우 Coverslips는 여러 번 씻어서 수 있습니다. 부드럽게 이하 185 RPM에 궤도 흔드는 세트에서 하룻밤 실온에서 흔들어. </li><li> 삼일 중 총 질산 / 일상 조직 문화-등급 물 위의 순서를 반복합니다. </li><li> 마지막을 가만히 따르다조직 배양-등급 물 간신히 coverslips을 가릴 정도로 아세톤을 추가합니다. </li><li> 이 아세톤을 가만히 따르다하고 적절하게 처리해라. </li><li> 150mm 유리 페트리 접시에 coverslips를 전송합니다. 간신히 coverslips을 가릴 정도로 아세톤을 추가합니다. coverslips가 접시에 하나의 레이어에 있는지 확인하십시오. </li><li> 아세톤은 퓸 후드에서 하룻밤 증발하도록 허용합니다. </li><li> 멸균을 위해 1.5 시간 180 ° C에서 건조 오븐에 베이킹 coverslips. </li></ol> 3. 문화 Coverslips의 작성 <ol><li> 해부하기 전에 하루, 무균 기술을 사용하여 24도 조직 배양 플레이트의 각도 1 유리 coverslip을 (위에서 설명한대로 준비) 추가합니다. 각도에 멸균 폴리-D-라이신 용액 (0.5 M 트리스 버퍼, 산도 8의 100 밀리그램 / ML) 200 μl를 추가, 4 ° C에서 하룻밤 사이에 접시를 저장합니다. </li><li> 해부의 날, 그리고 이상적으로 절개를 시작하기 전에, 각 우물에서 폴리-D-라이신 솔루션을 대기음하고 각도 5 회 씻어멸균 조직 문화의 등급 물. </li><li> ° C 배양기 37의 각 플레이트 및 매장 200 μl 낮은 포도당 DMEM을 추가합니다. 도금 전지 이전 약 1 시간은 낮은 포도당 DMEM를 제거하고 250 μl C2 미디어를 당 잘 추가하십시오. 37 스토어 번호판 ° C % CO 2 5하에 세포는 도금이 될 준비가 될 때까지. </li></ol> 4. 해부와 뛰어난 자궁암 신경절의 분리 <ol><li> 적은 glial 세포가 있기 때문에 교감 신경의 Dissociated 문화는 일반적으로 태아에서 수확한 우수한 경추 신경의 분열 (SCG) (배아 일 19-21) 쥐의 새끼들이 준비가되어 있습니다. 그러나이 같은 프로토콜은 초기 출생 후의 (1-3일 오래된) 쥐 새끼 또는 perinatal 마우스 새끼와 함께 성공적으로 사용될 수 있습니다. </li><li> CO 2 흡입을 통해 임신 쥐를 안락사. 복부를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 씻는다. 무균 조건 하에서 자궁 뿔을를 제거하고 살균 150mm 배양 접시에있는 자궁 뿔을를 놓습니다. 피하해부 동안 내장이나 댐의 다른 내부 장기의 손상. </li><li> 배아 새끼를 마취하기 위해 얼음 냄비 진입 새끼와 페트리 접시를 놓습니다. 자궁 나팔과 amniotic 세포막 무료 배아 해부. 새끼를 안락사시키려는 어깨 아래 중간선에 따라 각 강아지의 척수를 자르고. 이것은 또한 SCG의 해부 동안 경동맥에서 출혈을 감소 대정 맥을, severs. 일단 페니실린과 스트렙토 마이신과 보완 멸균 Leibovitz의 L-15 배지 (또는 공기 버퍼 매체)의 장소 배아는 자궁 경적 무료 해부 했어요. </li><li> 150mm 배양 접시 Sylgard로 절반 채워진 그들의 실려 배아를 놓습니다. 멸균 20 게이지 바늘을 사용하여 부드럽게 SCG의 절개를 용이 목, hyperextending, 흉부와 머리 핀. </li><li> 턱밑 땀샘을 표시하는 방법으로 쇄골 수준에서 목을 따라 중간선 절개를합니다. 좋은 포셉을 (를 사용하여 땀샘을 제거 NO. 네, 말. 5 뒤몽)는 근육 레이어를 노출합니다. </li><li> 쇄골 근처 sternocleidomastoid 근육을 잘라 미세 집게를 사용하십시오. 그런 다음 부드럽게 리프트와 호흡 관 옆에 omohyoid 근육을 절개. 이 근육은 매우 얇은이므로 기본 경동맥을 찢어하고 SCG 피하기 위해 너무 깊게 절단하지 마십시오. 이러한 근육의 레이어가 제거되면, 경동맥과 미주 신경 명확하게 표시합니다. </li><li> SCG는 경동맥의 분기점 아래 자리잡고 있습니다. 미세 포셉 (제 4 아냐. 5) 사용 신경절을 노출 경동맥 양쪽에서 떨어져 조직을 해부 무딘. 이 미세 집게를 사용하여 SCG 위에 누워있는 경동맥의 섹션뿐만 아니라 자체 SCG를 제거하려면, 각각 위의 경동맥을 파악하고 아래 SCG의 주동이의와 꼬리 끝을. 그것은 개발이 단계에서 SCG와 함께 놓여 nodose 신경절은, 또한이 단계에서 제거됩니다 가능성이 높습니다. nodose 신경이 identifie 수그 둥근 모양과 그것으로부터 돌출 큰 vagal 신경에 의해 개발. 이것은 경동맥의 지점 중 하나를 택해 자리잡고 있습니다. 반대로, SCG는 모양의 아몬드되고 경동맥의 분기점 아래에 직접적으로 자리잡고 있습니다. L-15 배지와 항생제를 포함하는 무균 35mm 배양 접시에 해부하는 조직을 놓습니다. 다음 단계로 진행하기 전에 모든 새끼에서 SCG를 제거합니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여, 부드럽게 해부 (특히 미주 신경 및 nodose의 신경절) 동안 경동맥과 제거된 다른 조직에서 SCG를 구분합니다. 신경 구에서 캡슐을 제거하는 미세 집게를 사용하십시오. 이것은 크게 문화에 nonneuronal 세포의 숫자를 줄일 수 있습니다. L-15 배지를 포함하는 다른 멸균 35mm 요리에 신경을 전송합니다. </li><li> SCG을 떼어 놓다하려면 L-15 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이없는 행크의 균형 식염수 2 ML의 Collagenase (최종 농도 1 밀리그램 / ML) / Dispase (최종 농도 5 밀리그램 / ML)로 바꿉니다. Incuba40 분 동안 37 ° C에서 테. </li><li> 멸균 15 ML 원추형 원심 관에 SCG를 전송하고 BSA (최종 농도 1-2 밀리그램 / ML)로 보완 L-15을 갖춘 10 ML에 볼륨을 제기하셨습니다. 5 분 상온에서 200 X g에서 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 BSA와 보충 L-15로 한 번 더 씻는다. </li><li> 두 번째 세척 후, 모든 L-15을 제거하고 C2 매체 ~ 2 ML에서 가장 신경을 resuspend. 불타는 광택 구부러진-팁 피펫을 사용하여 세포를 씹다, 가루약은 유리 세포 고집 최소화하기 전에 피펫은 BSA/L15로 코팅되어 있는지 확인하십시오. 부드럽게 3-4 회를 씹다. 대형 대단히 짧은 시간은 약 1 분 동안 정착 및 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송하자. 나머지 SCG에 더 많은 C2 미디어를 넣고 씹다. 대단히 짧은 정착시키는 후에 두 번째 가루약에서 최초로 분쇄 후 채취한에 세포 현탁액을 전송. 신경이 대부분 dissociated 때까지이 과정을 여러 번 반복합니다. 디네번째 분쇄 후 남아있는 대단히 짧은 시간을 iscard. </li><li> 쥐 새끼 (일반적으로 12-16 새끼) 중 하나에 쓰레기에서 dissociated 세포의 경우, 추가 C2 매체를 추가하여 8-10 ML에 세포 현탁액에서 매체의 전체 볼륨을 가지고. 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 resuspend와 세포 밀도를 결정하는 작은 나누어지는를 제거합니다. 서스펜션에 세포 현탁액의 나누어지는 250 ML은 당 잘 세포를 유지해야되고, 그때 문화에 원하는 셀 밀도를 2X를 달성하고있는 세포 현탁액의 볼륨을 조정합니다. 돌기 성장 morphometric 연구를 위해, 24도 접시에 저밀도에서 우리가 일반적으로 플레이트 세포 (사람마다 잘 ~ 5 X 10 4 세포). </li><li> 저희 실험실은 유리 desiccators에서보다는 직접 CO 2 배양기에서 SCG 문화 incubates. 혈청이없는 배지에서 자란 교감 신경이 약간 높은 CO 2 농도 (약 6.5 %)로 더 잘 수행하기 때문에 우리는 이것을 수행합니다. 또한 우리는 O의 항생제를 사용하지 마십시오UR 미디어 그것이 neurite 가지와 desiccators에서 유지하는 문화를 억제 때문에 그것이 문화의 일부로 개발하는 경우에는 오염의 확산 최소화하는 것 같습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 정기적으로 최대 8 주 동안 SCG 문화를 유지합니다. 일단 도금, SCG 문화는 바닥에 멸균 물을 포함한 유리 desiccators의 도자기 건조기 플레이트에 표시됩니다. CO 2의 약 120 ML는 35.5 ° C. 위해 감고 씰링 및 보육 세트로 전체 건조기를 삽입하기 전에 건조기로 주입된다 </li></ol> 5. 수유와 문화의 유지 보수 <ol><li> 문화는 일반적으로 첫 번째 미디어 교환 도금 후 24 시간 발생으로 3 회 주 먹이로하고 있습니다. 멸균 구부린-팁 피펫 사용하여 부드럽게 잘 당 미디어의 절반에 대해 철회. 깨끗한 무균 구부러진-팁 피펫을 사용하여 신선한 C2로 제거 매체의 볼륨을 교체하십시오. </li><li> 문화 이외의 연결을 세포를 제거하려면 백신 mitotic 요원 cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, 최종 농도 1-2 μm의)는 일반적으로 48 시간 동안 첫 번째 미디어 교류의 문화 매체 (예, 24 시간 도금 이후)에 추가됩니다. ARA-C의 농도는 일반적으로 모든 비의 연결 세포를 제거하는 데 충분합니다. 추가 ARA-C 치료가 필요한 경우, 그것은 이들이 신경 세포에 독성 효과를 최소화하기 위해 다른 모든 수유를 할 것을 권장합니다. </li></ol> 6. Matrigel 또는 BMP-7과 돌기 성장을 유도 <ol><li> 돌기 성장을 유도하기 위해 비의 연결 세포가 제거되고 난 후에 Matrigel 또는 BMP-7은 문화에 추가되고 문화의 ARA-C 수준이 크게 감소된다. 일반적으로, 우리는 체외에서 5 일째 매체 Matrigel 또는 BMP-7을 추가하지만, 돌기 성장은 체외의 어떤 시점에 추가 Matrigel 또는 BMP-7에 의해 유도된 수 있습니다. Matrigel 또는 BMP-7은 C2 매체에 추가되고 위에서 설명한 문화가 싫증이됩니다. </li><li> Matrigel 및 BMP 유발 돌기 성장은 시간이다및 농도 의존. 최대한의 효과를 보려면 Matrigel은 50-75 μg / ML의 최종 농도에서 C2에 추가됩니다, BMP-7은 50 NG / ML의 최종 농도에서 C2 매체에 추가됩니다. 큰 약 100 μg / ML 또는 100 이상의 BMP-7 농도의 Matrigel 농도는 NG / ML의 연결 독성을 일으키는 것으로 알려져있다. 돌기 프로세스는 (같은 형태학의 기준에 의해 결정) 약 48 시간 maximally 효과적인 농도에서 Matrigel 또는 BMP-7에 초기 노출 후 겉보기된다. 강력한 돌기의 성장을 유도하기 위해, 문화는 BMP-7은 모든 먹이에 매체를 포함하는으로 먹이 있습니다. 상응하는 결과를 비교 농도 20,21에 BMPs 2, 4, 5와 6을 사용하여 얻은되었습니다. </li></ol> 7. BMP-7-유도 돌기 성장의 Immunocytochemical 분석 <ol><li> 돌기 arborization의 원하는 정도가 달성되면, 문화는 0.1 M 인산 완충액에 4 % paraformaldehyde를 사용하여 해결됩니다. 최고의 고정은4 % paraformaldehyde로 잘 절반 매체를 교체하고 10~15분 동안이 단계에게 3-5 회 반복하여 chieved. </li><li> 십오분 - 인산 버퍼 식염수 (PBS)으로 절반이 4 % paraformaldehyde를 대체 10 이상이 단계를 세 번 반복하여 문화를 씻어. </li><li> 모든 PBS를 제거하고 세포를 permeabilize 위해 상온에서 5 분마다 잘 200 μl 0.1 % Triton은 PBS의 X-100를 추가합니다. </li><li> 흡인에 의해 트리톤 솔루션을 제거하고 200 μl 당 우물 차단 완충 용액을 (PBS가 3~5%의 BSA와 1 % 염소 혈청과 보충) 추가합니다. 상온에서 20-30분 동안 품어. </li><li> 차단 버퍼를 제거하고 1:2000으로 희석 일차 항체, 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2) 추가 - 버퍼를 차단에 1:5000합니다. 4에 실온 또는 특급 ° C.에서 1 시간 동안 문화를 품다 </li><li> 일차 항체 용액을 제거, 실온에 15 분 정도 PBS 세번과 문화를 씻는다. </li><li>PBS에 희석 이차 항체와 문화를 품어은 어둠 속에서 실온에서 1~2시간에 대한 1 % BSA와 함께 보충. </li><li> 이차 항체 용액을 제거하고 어둠 속에서 실온에서 10-15분여 PBS 세번과 문화를 씻는다. </li><li> 유리에 마운트 coverslips는 이차 항체에 태그를 fluorochrome에 적절한 산도에서 수성 장착 매체의 방울에 셀 측면 아래로 내려간다. 장착 매체가 건조하도록 하룻밤 실온에서 슬라이드를 유지. 4에 저장 슬라이드 영상까지 ° C에서. </li><li> 슬라이드 이미징하기 전에 적당한 온도로 평형하도록 허용합니다. epifluorescence 위해 장착된 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 형광 이미지를 습득. 일반적으로 단일 신경 세포의 전체 돌기의 아버는 20X 객관적이고 적절한 필터를 사용하여 캡처 할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 perinatal RA의 SCG에서 dissociated 교감 신경TS와 혈청 및 ganglionic glial 세포의 부재로 성장이 MAP2 immunopositive 프로세스 (그림 1)을 연장하지 않는 것이 아니라, 일반적으로 단 하나의 axonal 프로세스 14,15을 확장. BMP-7 (그림 1) 또는 Matrigel에 노출 dendrites 17,18의, 형태학의 생화 학적 및 기능적 기준에 부합하는 수많은 프로세스의 형성을 유도합니다. Matrigel 또는 BMP-7 중의 dendrite-촉진 활동은 농도와 시간 의존 17,18,20입니다. 최대한의 돌기의 성장은 50 및 75 μg / ML 또는 BMP-7 30 100 사이 NG / ML 및 반 최대한의 효과는 일반적으로 ~ 2 NG / ML의 BMP-7 농도에서 관찰되는 사이 Matrigel의 농도를 사용하여 관찰한다. 그러나 돌기의 성장에 큰 변화 300 PG / ML과 같은 낮은 BMP-7의 농도로 검출 할 수 있습니다. Matrigel 또는 BMP-7 중으로 돌기 응답은 &lt;뉴런의 50 %가 dendrite-P 중 하나에 노출된 후 24 시간 이내에 두 번째 프로세스를 형성과 함께, 상대적으로 느린<html> 에이전트를 romoting. 그러나, 초기 BMP-7 노출 후 3 일 이내에, 거의 모든 뉴런은 maximally 효과 Matrigel 또는 BMP-7의 농도에 대응. 뉴런 당 dendrites의 수는 치료 최초 10 일 동안 발생하는 변화의 대부분과 함께, BMP-7에 대한 지속적인 노출과 함께 증가하고 있습니다. 4 주밖에, BMP-7-대우 뉴런은 일반적으로 17 이차, 삼차, 심지어 제사기 돌기 가지를 전시 6-8 주 dendrites 있습니다. 모수 석의 아버에있는이 증가는 axonal 성장에 중요한 변화의 부재에서 발생하고, 비교 돌기 응답 BMPs 2, 4, 5 또는 6 20,21 비슷한 농도를 사용 elicited 수 있습니다. 돌기 성장도 내생 ganglionic glial 세포 15,22과 공동 culturing 교감 신경에 의해 elicited 수 있으나, 모수 석의 반응은 이러한 조건 하에서 상당히 느립니다. . JPG &quot;/&gt; 그림 1. BMP-7은 교양 공감 뉴런에서 돌기의 성장을 촉진합니다. 이외의 연결을 세포가 체외에서 제 2 일 48 시간의 시작을위한 안티 mitotic과 치료에 의한 문화 SCG에서 탈락했다. 체외에서 5 일째부터, 문화 50 NG / ML (B)에서 BMP-7으로 보충하거나 조절 매체 () 또는 매체로 치료되었다. 체외 (BMP 처리로부터 5 일 이후)에서 일 11에, 문화는 MAP2 대한 mAb와 immunostained 있었는데, 단백질은 주로 dendrites과의 연결을 somata에서 발견. 마찬가지로 대표적인 형광 photomicrographs 같이 제어 조건 하에서 재배 뉴런은 MAP-2 immunopositive 처리 dendrites의 부족 ()에 의해 입증으로 dendrites 부족, 대조적으로, 뉴런은 (B) 일반적으로 여러 개의 테이퍼 MAP-2 immunopositive가 BMP-7에 노출 dendrites.

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<li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 모델의 장점은 다음과 같습니다 () 문화가 다른 세포 유형 17,23의 찾아볼 수없는 교감 신경의 동질적인 인구로 구성되며, (b)는 교감 신경의 성장 인자 요구 사항의 사용을 허용하는, 잘 설립 있습니다 정의 매체 및 정의된 다양한 미디어와 기판이 23 증가하고 교감 신경을 유지하기 위해 잘 작동, (다) 이러한 문화의 뉴런은 Matrigel, BMP-7 dpp의 다른 BMPs의 dendrite-증진 활동에 균일하게 응답하고 60A는 17,18,20,21을 subfamilies하며, (d)에 Matrigel 또는 BMP 유발 dendrite 형성은 세포 생존 또는 axonal 성장 17,18의 변화의 부재에서 발생합니다. 이 모델은 바로 기본 dendr 동안 dendrites의 형성 이전, 돌기 성장, 예,의 독특한 단계에서 뉴런의 동조 인구를 얻는 것이 가능하게 돌기의 성장을 촉발하는 경우의 실험적인 제어를 수itogenesis (주 dend...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12mm의 라운드 Coverslip # 1 두께, 독일어 유리 </td></tr><tr><td> 벤트 팁 pipets </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P0899-100MG </td><td> 주식 해결 방법 1 MG / ML </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> Gibco </td><td> 15,230 </td><td></td></tr><tr><td> 더 좋은 포셉 뒤몽 없습니다. 4와 5 </td><td> 파인 과학 도구 (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 게이지 바늘 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 305,176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 배지 </td><td> Invitrogen </tD&gt; <td> 11,415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 워딩턴 </td><td> 4176 </td><td> 1 MG / ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 04942078001 </td><td> 5 MG / ML </td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 용액 (-CA,-MG) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 낮은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,030 </td><td> 20 MM </td></tr><tr><td> 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄 </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 지방산 - 초산 무료 BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126,609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> 할란의 Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> 햄 F-12 영양소 매체 (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,765 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> 사이 토신 arabinoside </td><td> 시그마 </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356,234 </td><td> 반복 냉동 해동 사이클을 피하십시오 </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D 시스템 Curis 주식 회사 </td><td> 345-BP BMP7-07H </td><td> BMPs 4, 5와 6은 동일뿐만 아니라 B​​MP-7과 같은 일을하고 상업적으로 얻기 위해 때로는 쉽게 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 어부 </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 쥐 MAP2 항체 </td><td> Sternberg Monoclonals 주식 회사 </td><td> SMI52 </td><td> 5천분의 1 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 546 염소 - 안티 마우스 </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1만분의 1 </td></tr><tr><td> 마운트 미디어 </td><td> Antifade 키트 분자 프로브을 연장 </td> &lt;TD&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

모수 석의 아버의 형태는 신경 세포가 1-3받을 수 총 시냅스 입력을 결정하고, 종류와 이들 입력 4-6의 분포에 영향을 미칩니다. 돌기 성장과 소성의 변경된 패턴은 실험적인 모델 7의 장애 neurobehavioral 기능과 관련되며, neurodevelopmental 장애의 8-10과 neurodegenerative 질병 11-13 모두에서 관찰 임상 증상에 기여할 것으로 생각됩니다. 이러한 관찰은 정확하게 돌기 형태와 규제의 기능적 중요성을 강조하고, 돌기 성장을 제어하는​​ 메커니즘을 파악하는 것은 오직 정상적인 발달 기간 동안 규제하는 방법의 연결을 연결의 이해를 향상하지 않을뿐만 아니라, 다양한 신경 질환에 대한 새로운 치료 전략에 대한 통찰력을 제공할 수도 것이 좋습니다. 돌기 성장 기계론의 연구는 크게 가용성 O에 의해 용이하게됩니다뉴런은 실험적으로 그들이 그들의 생체내의 대응에의 비교 돌기 아버을 자세히 설명하는 하나 dendrites을 연장되지 않는 상태에서 전환 수 있습니다 FA 모델 시스템입니다. perinatal 설치류의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 dissociated 교감 신경의 차 문화는 이러한 모델을 제공합니다. 혈청 및 ganglionic glial 세포의 부재에서 정의된 중간에 배양해 때 교감 신경은 axonal은 단일 프로세스를 확장,이 unipolar 국가는 문화 14,15의 개월 주 동안 지속. 그러나 문화 매체 중 뼈 morphogenetic 단백질 7 (BMP-7) 16,17 혹은 Matrigel 18 또한이 dendrites 위해 morphologic, 생화 학적 및 기능적 기준에 부합하는 여러 프로세스를 확장하려면 다음 뉴런을 트리거합니다. 공감 perinatal 설치류의 SCG에서 dissociated 뉴런과 정의된 조건 하에서 재배는 뉴런 19 동질적인 인구이다Matrigel, BMP-7 decapentaplegic (dpp)과 60A subfamilies 17,18,20,21의 다른 BMPs의 dendrite-증진 활동에 균일하게 반응니다. 중요한 것은, Matrigel 및 BMP 유발 dendrite 형성은 세포 생존 또는 axonal 성장 17,18의 변화의 부재에서 발생합니다. 여기, 우리는 그들이 Matrigel 또는 BMPs의 선택적 dendrite-촉진 활동으로 반응하도록 perinatal 쥐의 SCG에서 파생된 동정 뉴런의 dissociated 문화를 설정하는 방법에 대해 설명합니다.

우리는 선택적으로 perinatal 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 dissociated 주요 동정 뉴런의 돌기 성장을 유도하는 뼈 morphogenetic 단백질 7 (BMP-7) 또는 Matrigel을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

수지상 돌기 분지(dendritic arbor)의 형태는 뉴런이 받을 수 있는 총 시냅스 입력값을 결정하며 1-3, 이러한 입력의 유형과 분포에 영향을 미칩니다...

본 절차의 목적은 교감 신경세포를 배양하여 그 수지상 돌기 성장을 조절할 수 있도록 하는 것입니다. 이를 위해 먼저 멸균 상태에서 생후 초기 설치류 새끼로부터 상경신경절을 분리합니다. 두 번째 단계로는 신경절을 해리하여 단일 세포 현탁액을 형성한 뒤, 이를 준비된 기질 위에 도말합니다.정의 배지를 사용합니다. 그 후, 비신경세포를 제거하기 위해 항분열제(anti-mitotic)로 배양물을 처리하고, 수지상 돌기 성장을 유도하기 위해 BMPs 또는 매트리젤(matrigel)로 배양물을 처리합니다. 최종적으로, 배양된 교감신경 뉴런의 확장된 수지상 돌기를 보여주기 위해 map two 면역반응성을 사용합니다.해마 뉴런의 일차 배양과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 배양된 뉴런의 5% 미만이 수지상 돌기를 갖거나 또는 95% 이상의 뉴런이 강력한 신경 돌기 성장을 보이도록 DYS 뉴런의 형태학적 상태를 조절할 수 있다는 점입니다. 배아 19~21일령의 태아 쥐로부터 SCG 배양물을 준비하려면, 먼저 안락사시킨 임신 쥐의 복부를 제모하고 피부가 없는 부위를 70% ethanol로 세척한 다음, 멸균 상태에서 장이나 다른 내부 장기가 손상되지 않도록 주의하며 자궁각을 적출하십시오. 자궁각을 멸균된 150 millimeter 페트리 접시에 담으십시오. 그 다음, 페트리 접시를 얼음판 위로 옮기십시오.배아 새끼를 안락사시키기 위해 마취하는 방법은 어깨 아래 정중선을 따라 척수를 절단하는 것입니다. 이렇게 하면 대정맥도 함께 절단되어 경동맥에서의 출혈을 줄일 수 있습니다. 상경절(SCG) 해부 과정 동안 배아를 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 멸균 Leibovitz's L 15 배지에 넣으십시오. 그 후, Silgard가 절반 정도 채워진 150 mm 페트리 접시에 배아를 옮겨 등을 바닥에 대고 눕힙니다.멸균된 20 gauge 바늘을 사용하여 흉부와 머리를 고정하고, 목을 가볍게 과신전시켜 현미경 하에서 SCG 해부를 용이하게 합니다. 쇄골 높이에서 목을 따라 정중선 절개를 실시하여 하악선을 노출시킵니다. 미세 핀셋을 사용하여 하악선을 제거함으로써 근육층이 드러나게 합니다.그런 다음 쇄골 근처의 흉쇄유돌근을 절개하고, 기관 옆의 견갑설골근을 조심스럽게 들어 올립니다. 이 근육은 매우 얇으므로 너무 깊게 절개하지 않도록 주의하십시오. 너무 깊게 절개하면 하부의 경동맥과 SCG가 손상될 수 있습니다. 이러한 근육층을 제거하면 경동맥과 미주신경이 명확하게 보일 것입니다.상경신경절(SCG)은 경동맥 분지점 바로 아래에 위치합니다. 미세 핀셋을 사용하여 경동맥 양측의 조직을 박리하여 신경절을 노출시킵니다. 그런 다음 두 개의 미세 핀셋을 사용하여 SCG의 주두측(rostral) 및 척수측(cordal) 렌즈 바로 위와 아래의 경동맥을 각각 잡습니다.SCG 상단에 위치한 경동맥 부위와 SCG 자체를 제거할 때, 이 발달 단계에서 SCG 옆에 위치하는 noose ganglion 또한 이 단계에서 함께 제거될 가능성이 높습니다. 분리한 조직을 L 15 배지와 항생제가 포함된 멸균된 35 millimeter 배양 접시에 넣으십시오. 그 후, 다음 단계로 진행하기 전에 모든 새끼 쥐로부터 SCG를 제거하십시오.다음으로, 경동맥 및 기타 조직으로부터 SCG를 조심스럽게 분리합니다. 해부 과정 중에 이를 제거하십시오. 신경절에서 캡슐을 제거합니다.그런 다음 신경절을 L 15 배지가 담긴 다른 멸균된 35 millimeter 디쉬로 옮깁니다. SCG를 해리시키기 위해 L 15 배지를 제거합니다. 이를 칼슘 및 마그네슘이 없는 hanks balance sort solution으로 희석한 collagenase로 교체합니다.그런 다음 37 °C에서 40분 동안 배양합니다. 그 후, SCG를 멸균된 15 mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. BSA가 최종 농도 1-2 mg/mL가 되도록 보충된 L 15를 사용하여 전체 부피를 10 mL로 맞춥니다.실온에서 200 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후, 상층액을 제거하고 BSA가 보충된 L 15로 한 번 더 세척합니다. 두 번째 세척 후 L 15 배지를 제거하고 2 mL의 배양액에 신경절을 다시 넣습니다.화염 연마된 굽은 팁 피펫을 사용하여 세포를 약 3~4회 트리트(trite)합니다. 유리 벽면에 세포가 달라붙는 것을 최소화하기 위해 트리트 전 피펫이 BSAL 15로 코팅되었는지 확인하십시오. 큰 덩어리들이 약 1분 동안 가라앉도록 둔 다음, 세포 현탁액을 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다.이후 남은 SCG에 배지를 더 추가하고 다시 trituration(분쇄)합니다. 덩어리들이 가라앉으면, 두 번째 trituration에서 얻은 세포 현탁액을 첫 번째 trituration 이후 수집한 용액으로 옮깁니다. 신경절이 대부분 해리될 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다.쥐 새끼 1리터에서 분리된 세포의 경우, 네 번째 시도 후 남아 있는 덩어리는 모두 제거하고, 세포 현탁액의 총 배지 부피를 8~10 milliliters로 맞춥니다. 배양 배지를 추가로 넣은 후, 피펫을 사용하여 세포를 조심스럽게 재현탁합니다. 그런 다음 세포 밀도 측정을 위해 소량의 aliquot를 수집합니다.배양 시 원하는 세포 밀도의 2배가 되도록 세포 현탁액의 부피를 조절하십시오. 그다음, 웰당 250 µL의 세포 현탁액을 분주합니다. 수지상 성장의 형태 측정 연구를 위해, 일반적으로 24-웰 플레이트에 웰당 약 5 × 10⁴ cells의 낮은 밀도로 세포를 플레이팅합니다.그 다음, 멸균수가 들어 있는 유리 데시케이터 내의 자기제 데시케이터 플레이트에 SCG 배양물을 놓습니다. 데시케이터를 밀폐하기 전에 약 120 milliliters의 이산화탄소를 주입합니다. 그 후, 데시케이터 전체를 인큐베이터에 넣고 35.5 degrees Celsius로 설정합니다.본 절차에서는, 세포 도말 24시간 후에 배지의 절반을 교체하여 배양액을 공급하고, 이를 일주일에 세 번 반복하여 배양액에서 비신경세포를 제거합니다. 이때 일반적으로 1~2 µM 농도의 항분열제인 RRC를 배양 배지에 첨가합니다.그 다음, 비신경 세포가 제거되고 RSC 수준이 현저히 감소한 후 수지상 돌기 성장을 유도하기 위해 RSC가 포함된 신선한 배양액을 각 웰에 첨가하고 48시간 동안 배양합니다. 5일 차에 배양액에 matrigel 또는 BMP seven을 첨가합니다. In vitro 상태에서 앞서 설명한 대로 배양액을 공급하며, 여기서는 MAP two 면역 양성 돌기가 나타나지 않아 수지상 돌기가 부족한 것으로 확인된 대조군 조건 하에서 성장한 뉴런을 보여줍니다.반면, BMP 7에 노출된 이 뉴런은 여기에 표시된 것과 같이 가늘어지는 형태의 MAP2 면역 양성 수상돌기를 여러 개 가지고 있습니다. 배양된 교감 신경 뉴런은 BMP 7 처리 전 5~7일 동안 배양되었으며, BMP 7을 30~50 ng/mL 농도로 2일 동안 처리하였습니다. 수상돌기 성장이 시작되는 지점에 주목하십시오.BMP.Seven이 없는 상태에서 배양물을 7~14일 동안 배양합니다. 배양물은 축삭 성장만을 계속해서 나타내는 반면, BMP.Seven을 30~50 ng/mL 농도로 7~14일 동안 처리한 배양물은 다릅니다.강력한 수상돌기 성장을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 SCG를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 신경세포 형태 발생 연구를 위해 교감신경 뉴런의 해리 배양액을 준비하고, 수상돌기 성장을 실험적으로 조절해 보십시오.

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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