Name: Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 광음향 유량계를 사용하여 순환 흑색종 세포를 검출하고 격리하는 방법을. 이 기술은 전이성 암을 조기에 식별하여 환자의 생존율을 향상시킬 수 있습니다.

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우리는 생물 공학 및 미주리 대학에서 크리스토퍼 S. 본드 생명 과학 센터의학과 지원을 인정합니다. 우리는 미주리 생명 과학 연구위원회 09-1034 및 NIH R21CA139186 - 0에서 교부금 지원을 인정합니다. 또한 재정 지원 미주리 미주리 분자 세포학 코어의 대학, 공학 대학 미주리 대학의 대학에서 생명 과학 학부 연구 기회 프로그램을 감사드립니다.

1. 혈액 샘플 준비 <ol><li> 이 5 ML vacutainers로 무대 IV의 암 환자에서 전체 혈액의 약 10 ML을 그립니다. </li><li> 분당 3,000 회전 (RPM) 10 분 동안 원심 튜브. </li><li> 혈액 샘플은 세 가지 다른 레이어로 분리됩니다 아래 계층은 또한 버피 코트라는 적혈구, 중간 계층, 구성되어 leukocytes와 흑색증 세포를 포함하고, 상위 레이어는 플라즈마와 혈소판이 포함되어 있습니다. 버피 코트를 방해하지 않고 가능한 한 많은 플라즈마로 제거합니다. </li><li> 이 한 ML의 Wintrobe 튜브에 Histopaque 1077의 장소 250 μL. </li><li> 9 &quot;파스퇴르 피펫을 사용하여 &lt;500 μL를 수집해야하고, 나머지 플라즈마, 전체 버피 코트, 심지어 적혈구의 상단 레이어를 추출합니다. </li><li> Histopaque 레이어 위에 솔루션을 놓고 3,000 rpm으로 10 분 15 ML 원뿔 튜브에 Wintrobe 튜브를 원심 분리기. </li><li> 피가 다시 것입니다별도의지만이 시간은 적혈구가 버피 코트 쉽게 추출 수있게 Histopaque로 구분됩니다. 전체 버피 코트를 구하여 2 ML eppendorf 튜브에 배치 9 &quot;파스퇴르 피펫을 사용합니다. </li><li> 2퍼센트 V / V 십대 초반에 20 PBS의 1.5 ML에서 버피 코트를 일시 중지합니다. </li></ol> 2. 흐름 상공 회의소 건설 <ol><li> 아크릴 실린더, 20mm 외경, 17mm 내경 및 높이 8mm를 구합니다. 서로 90도 각도에서 실린더의 측면을 통해 세 5mm 직경의 구멍을 드릴. 폴리머 튜브의 세 가지 (1.6 mm 내경, 외경 5mm)를 잘라 및 뚫고 구멍에 그들을 놓습니다. </li><li> 물이 꽉 도장을 만들기 위해 아크릴 반지의 맨 아래에 Parafilm을 부풀. parafilm은 아크릴 반지 얕은 그릇을 형성하고 흐름 챔버를 형성됩니다 아크릴 아미드 솔루션을 개최합니다. </li><li> 맞은편에 아르 튜브의 조각을 통해 1.6 mm 직경의 와이어를 일시 중지혼자 와이어 반지의 중간으로 볼 수 있는지 서로하고. 1.6 mm 직경의 와이어와 위치 떨어져 정지 와이어에서 튜브 1mm로 튜브의 세 번째 부분을 입력합니다. 이 전선은 튜브 입력에서 아크릴 아미드되지 않습니다. 아크릴 아미드가 굳은 후 와이어가 광섬유를 위치로 원통형 흐름 경로와 장소를 떠나, 추출됩니다 유동 경로에 초점을 맞추고 있습니다. </li><li> 준비 아크릴 아미드의 5 ML 추가 [20g의 아크릴 아미드 (시그마 알드리치), 0.7 g의 bisacrylamide (시그마 알드리치), 증류수 100 ML] 작은 비커 수 있습니다. 암모늄 persulfate (시그마)의 0.02 g을 측정하여 비커에 추가합니다. 3 분 저어 막대와 함께 섞는다. 비커 20 μL tetramethylethylenediamene (피셔 과학)를 추가합니다. 빨리 가기 작성, 아크릴 반지에 혼합물을 따라줘. 몇 초 후, 솔루션 젤, 흐름 챔버 금형을 만드는 것입니다. 조심스럽게 아크릴 아미드 젤을 방해하지 않도록하고, 전선을 빼낸다. 흐름 chamBER은 이제 사용할 준비가되었습니다. </li></ol> 3. Photoacoustic flowmetry 설정 <ol><li> 아쿠 스틱으로 몇 직접 유동 경로 위에 초음파 젤을 사용하여 흐름 챔버에 polyvinylidene 불소 압전 음향 변환기 (Panametrics). </li><li> 총검 닐 - Concelman (BNC) 케이블을 사용하여 RITEC 광대역 수신기 - 640A의 입력 (아웃, highpass 필터 : 1 MHz 이상, imput 임피던스 : 50 Ohms, 증폭 : 35dB 로우 패스 필터)로 변환기를 연결합니다. 오실로 스코프 (텍트로닉스 TDS 2024B)로 필터의 출력을 연결합니다. 오실로 스코프를 트리거하려면, photodiode (Thorlabs)은 변환기 근처에 설치되고 BNC 케이블을 사용하여 오실로 스코프에 연결됩니다. </li><li> T - 커넥터 (소형 부품)은 흐름 챔버의 팔 하나에 첨부되어 있습니다. 두 개의 주사기 펌프 (Braintree 과학)은 커넥터의 다른 지점으로 연결됩니다. 다른 부분은 1에서 준비한 세포 현탁액을 포함하면서 하나의 주사기, 공기가 포함되어 있습니다. 에 흐름 속도를 설정100 μL / 분. </li><li> 공기 형태의 작은 포켓까지 흐름 챔버의 작은 튜브를 추출, 그 슬롯에 0.37 수치 조리개와 1mm 직경 코어 광섬유를 삽입합니다. 인터페이스 신호를 줄이고 유동 경로에 적용되는 레이저 빛의 양을 증가 물로 주머니를 채우십시오. 광섬유와 흐름 경로로 짧은 거리의 수치 조리개로 인해, 레이저는 직접 레이저의 앞에 샘플 photoacoustic 신호를 만드는 동일한 예제입니다 있도록, 주어진 시간에 샘플 중 하나 탄환을 비추다 것입니다. 레이저 에너지는 7mm 2 스폿 크기가 약 28 MJ / cm 2되어야합니다. </li><li> 양쪽 주사기 펌프를 켜십시오. 두 혼합할 유체의 T - 접합에 도달했을 때 그들은 균질 슬러그와 변환기 과거 흐름으로 분할됩니다. </li><li> nanosecond가 흑색증 세포에서 photoacoustic 파도를 생성하는 레이저를 펄스로 흐르는 샘플을 비추다. 멜라닌은 broadb이므로그리고 흡수 광, 가시적인 레이저 파장을 사용하실 수 있습니다. </li><li> 탄환이 변환기 위에 때 신호가 오실로 스코프에 나타나는 경우, 총알은 흑색증가 포함되어 있으며, 수집 약병에 낙하 때까지 시스템을 통해 추적한다. </li></ol> 4. Immunocytochemistry <ol><li> 유리 슬라이드에 문제를 해결하기 위해 Cytospin 4 원심 분리기 (써모 과학)로 캡처한 총이 가져가라. 장소 유리 Cytofunnels로 슬라이드 (브라운 필터 카드 써모 과학로 Shandon EZ 싱글 Cytofunnel)하고 Cytospin 4 원심 분리기로 그들을로드합니다. 각 깔때기에 PBS에 (시그마) 1퍼센트 소 혈청 알부민의 100 μL를 넣고 다음 캡처한 세포가 유리 슬라이드에 충실 도와 삼분 600 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, Cytofunnels에 세포 샘플을 추가하고 다음 3 분 600 rpm으로 원심 분리기. 그렇다면 에탄올 기반 정착액으로 슬라이드를 스프레이. </li><li> 두 번 10 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li&gt;을, 특이 현상이 바인딩을 차단 염소 혈청 10 μL (시그마)과 실온에서 1 시간 동안 PBS의 90 μL의 혼합물로 각 슬라이드를 부화. </li><li> 부화 후, 실온에서 humidified 챔버 1 시간 동안 기본 항체 솔루션 슬라이드와 부화를 가만히 따르다. 각 슬라이드는 1 %의 토끼에서 제기된 마트 - 1 항체, 1 % 마우스에서 제기된 CD - 45 항체, 10 % 염소 혈청과 89% PBS를 포함해야합니다. </li><li> 부화 후 10 분 세 번이나 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드는 다음 형광단 항체에 바인딩된있는 차 항체 용액에 incubated 수 있습니다. 혼합물은 안티 - 토끼 항체 0.05 % 염소, 0.05 %의 염소 안티 - 마우스 항체, 0.1 %의 염소 혈청과 99% PBS가 포함되어 있습니다. 슬라이드는 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 incubated 수 있습니다. </li><li> 부화 후, 슬라이드 5 분 세 번위한 PBS로 세척 가만히 따르다. </li><li> 핵에 대한 얼룩, DAPI의 0.1 μg / ML (Invitrogen)에있는 세포를 품어일분. 다음 슬라이드를 가만히 따르다하고 PBS로 세척. </li><li> 슬라이드 당 수지 기반 설치 미디어를 20 μL를 사용하여 세포 샘플을 통해 coverslip를 탑재합니다. 슬라이드를 보존하기 위해 투명 매니큐어로 coverslip을 봉쇄해. 이제 슬라이드는 형광 현미경으로 몇 군데 준비하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 백혈구 및 흑색증 세포에서 photoacoustic 파형이 여기에 표시됩니다. 백혈구는 아무 고유의 착색 필요 없다, 전자 노이즈의 평평한 라인 (왼쪽)와 같은 더 photoacoustic 파도와 매니 페스트를 생성하지 않습니다. 색소 흑색증 세포는 강력한 photoacoustic 웨이브 (오른쪽) 생산하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. immunocytochemical 얼룩 후, 교양 흑색증 전지는 BL에 DAPI 신호를 표시UE 동안 MART1는 녹색으로 강조 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. leukocytes의 지표로서 CD45와 그림 2에서, DAPI와 MART1에 대한 이미지를 오버레이,이 수치는 여러 가지 백혈구 사이 흑색증 세포를 보여줍니다.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
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</ol>

존 A. Viator는 설립자이자 Viator 기술 Inc의 인간의 건강의 개선을위한 photoacoustic 기술을 상용화하기 위해 형성된 회사의 사장입니다.

CTCs을 감지하면 드문 종양 세포를 분리의 어려운 문제로 인해 거의 임상 응용 프로그램과 함께 여전히 연구 집약적인 분야입니다. 많은 다른 기술은 RT - PCR, microfluidic 세포 캡처, immunomagnetic 캡처 및 기타 방법 8-12 포함하여 CTC 탐지에 대한 평가되고있다. 그것은 무료 레이블이고 작은 빛을 흡수 입자를 포착하는 신속하고 정확한 방법을 제공하는 그러나, CMCs 쇼 photoacoustic 감지 약속 해요. 프로토콜 백혈구를 분리하기 위해 설명하는 것은 매우 효율적이며, 아직 적혈구의 낮은 숫자가 샘플에 존재한다. 이 루즈 오염 세포는 레이저 빛을 흡수하지만 크게 감소 수준. 적혈구 우리 흑색증 탐지 시스템을 방해하지 않도록하기 위해 다섯 건강한 환자 샘플은 시스템을 통해 소개되었으며 아무도 적혈구가 낮은 정도의 농도에서 존재하는 나타내는 신호를 준 없습니다무시됩니다. 집중 연구의 일련 교양 흑색증 세포를 사용하고 photoacoustic 흐름 시스템이 민감한 아래 1 셀 / μL (게시되지 않은 데이터)에 입증되었습니다 실시되었습니다. 이러한 연구는 가고있다 곧 암 환자 샘플을 사용하여 시험이 포함됩니다. 이 photoacoustic 기술은 또한 외인성 chromophores을 첨부하여 유방암과 전립선 암 등 비 색소 CTCs에 사용하기 위해 평가되고 있습니다. 우리는 암 cells13에 금 nanoparticles를 사용하여 예비 작업을 수행했습니다. 이 테스트는 nanoparticles가 photoacoustic 파도를 생성하는 데 필요한 광학 흡수를 제공할 수 것으로 나타났습니다. 나머지 기술 과제는 선택적으로 암세포에 이러한 입자를 첨부하는 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

photoacoustic flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

순환 종양 세포 (CTCs)는 매크로 종양에서 분리하고 종자 보조 종양 1,2,3로 혈액과 림프 시스템을 통해 확산이있는 세포입니다. CTCs는 전이성 질환과 혈액 샘플에서 검출의 지표가 암을 진단하고 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하는 데 사용할 수 있습니다되었습니다. CTCs가 희귀하기 때문에, 하나 종양의 첨단 암 환자에서 정상 혈액 세포 수십억 사이 세포들이 감지 및 열거에 대해 구성된 것은 어려운 작업입니다. 우리는 photoacoustic 생성하는 대부분의 흑색증 세포에서 색소의 존재를 이용하거나, 레이저 순환 흑색증 세포 (CMCs) 4,5의 검출에 대한 사용자 지정 흐름 cytometer에 초음파를 유도. 이 과정은 원심 분리를 사용하여 백혈구 층을 얻기 전체 혈액 샘플을 분리 알아볼 수 있습니다. 전체 혈액에 존재하는 경우 CMCs 비슷한 밀도로 인해 백혈구로 구분됩니다. 이러한 세포에 resuspended 아르인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼와 유량계에 도입했다. 오히려 혈액 세포 현탁액의 지속적인 흐름보다, 우리는 더 나은 연구를 위해서 이러한 세포를 캡처하기 위해서는 두 단계 흐름을 유도. 2 상류에서 microfluidic 시스템에서 두 혼합할 액체는 액체 6,7의 총이 번갈아 가며 교차점과 양식에서 만나십시오. PBS는 순차적으로 레이저 빛이 조사 아르 백혈구 및 공기 양식 microliter의 총이 정지. 액상에 대한 계면 활성제의 또한 균일한 슬러그 형성이 가능하고 사용자는 두 단계의 흐름 속도를 변경하여 다른 크기의 굼벵이를 만들 수 있습니다. 백혈구와 공기와 PBS의 굼벵이의 총이 더 밝은 absorbers을 포함하지 않으며 따라서, photoacoustic 파도를 생성하지 않습니다. 그러나, 심지어 하나의 CMCs를 포함하는 백혈구의 슬러그 레이저 빛을 흡수하고 고주파 음향 파를 생성합니다. photoacoustic 파도를 생성하는이 굼벵이는 verific에 대한 압수 및 cytochemical 얼룩을 위해 수집됩니다CMCs의 ation.

우리는 전이성 질환의 조기 지표로 흑색증 세포 순환 감지하는 레이저 유도 초음파를 사용하여 플로우 cytometer을 개발했습니다.

Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

순환 종양 세포(CTCs)는 거시적 종양에서 분리되어 혈액 및 림프계를 통해 퍼져 나가 전이 부위를 형성하는 세포입니다...

다음 실험의 목적은 이차 종양이 형성되기 전에 암의 존재를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 4기 흑색종 환자로부터 혈액 샘플을 채취하고 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 혈액을 광음향 유동 챔버에 주입하여 흑색종 세포를 검출하고 분리합니다.다음으로, 포획된 세포를 이미징하여 검출된 흑색종의 존재를 확인합니다. 결과는 광음향 파형 및 세포 이미징 기술을 기반으로 흑색종 세포를 정확하고 신속하게 검출하고 분리하는 시스템의 능력을 보여줍니다. R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting 및 기타 방법과 같은 기존의 순환 흑색종 세포 검출 방법과 비교하여 본 기술의 주요 장점은 라벨 프리 방식이라는 점이며, 이를 통해 세포 표면을 변경하거나 기판에 고정하지 않고도 순환 흑색종 세포를 포획할 수 있다는 것입니다.전이성 암 검출을 위한 시료를 준비하려면 먼저 4기 암 환자로부터 전혈 약 10 milliliters를 채취하십시오. 5 milliliter vacutainer 튜브 두 개에 나누어 담은 후, 3000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 그러면 혈액 시료가 세 개의 서로 다른 층으로 분리됩니다. 가장 아래층은 적혈구로 구성됩니다.버피 코트(buffy coat)라고도 불리는 중간층에는 백혈구와 흑색종 세포가 포함되어 있으며, 상층에는 혈장과 혈소판이 포함되어 있습니다. 버피 코트를 건드리지 않고 가능한 한 많은 양의 혈장을 제거하십시오. 2 mL 마이크로 튜브에 250 µL의 his opaque 10 77을 추가하십시오.9인치 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 혈장, 버피 코트(Buffy coat) 전체, 그리고 적혈구의 최상층을 추출합니다. 이때 500 µL 미만으로 수집되도록 주의하십시오. 추출한 용액을 이전에 준비한 윈트로브(wind Trobe) 튜브로 옮깁니다.혈액이 다시 분리되지만, 이번에는 히스파(hispa)에 의해 적혈구가 분리되어 버피코트(Buffy coat)를 쉽게 추출할 수 있습니다. 9인치 페사(Pesa) 피펫을 사용하여 버피코트 전체를 분리하고 2 mL 엔드 오프(eend orph) 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 2% v/v 베타20(between 20)이 포함된 1.5 mL PBS에 현탁하십시오.플로우 챔버를 제작하려면, 길이 8 mm, 외경 20 mm, 내경 17 mm의 아크릴 실린더를 준비합니다. 다음으로 실린더 측면에 서로 90도 각도가 되도록 직경 5 mm의 구멍 세 개를 뚫습니다. 그런 다음 폴리머 튜브 세 조각을 잘라 뚫린 구멍에 삽입합니다.아크릴 링 바닥에 파라필름을 팽팽하게 늘려 붙여 수밀 씰을 만듭니다. 파라필름은 아크릴 링과 함께 얕은 그릇 형태를 이루며, 유동 챔버를 형성할 아크릴아마이드 용액을 담게 됩니다. 서로 마주 보는 튜브 조각들을 통해 직경 1.6 millimeter 와이어를 걸치는데, 이때 링 중앙을 통해 세 번째 튜브 속으로 와이어만 보이도록 배치하십시오.직경 1.6 millimeter 와이어를 삽입하고, 튜브를 매달린 와이어로부터 1 millimeter 떨어진 곳에 위치시킵니다. 이 와이어들은 acrylamide가 튜빙 내부로 들어가는 것을 방지합니다. 5 milliliters의 acrylamide를 준비합니다.그런 다음 혼합물을 아크릴 링에 빠르게 부어 상단까지 채웁니다. 몇 초 후면 용액이 겔화됩니다. 유동 챔버 몰드를 만들기 위해 아크릴아마이드 겔을 건드리지 않도록 주의하며 와이어를 조심스럽게 뽑아내면, 원통형 유로와 유로에 초점을 맞춘 광섬유를 배치할 공간이 형성됩니다.이제 유동 챔버를 초음파 젤을 사용하여 음향적으로 사용할 준비가 되었습니다. 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride) 압전 음향 트랜스듀서를 유동 경로 바로 위의 유동 챔버에 결합하십시오. 바요넷 커넥터 또는 BNC 케이블을 사용하여 트랜스듀서를 광대역 수신기의 입력단에 연결하십시오.필터의 출력을 오실로스코프에 연결하여 오실로스코프를 트리거합니다. 트랜스듀서 근처에 포토다이오드를 설치하고 B NNC 케이블을 사용하여 오실로스코프에 연결합니다. 작은 공기 주머니가 형성될 때까지 유동 챔버의 작은 튜브를 뽑아낸 후 트랜스듀서와 결합합니다.그 다음 광섬유를 삽입하고 포켓을 물로 채워 인터페이스 신호를 줄이고 유로에 조사되는 레이저 광량을 늘립니다. 광섬유의 수치 구경과 유로까지의 짧은 거리 덕분에, 레이저는 어느 시점에서나 한 번에 하나의 샘플 슬러그만을 조사하게 되며, 이를 통해 레이저 바로 앞에 있는 샘플이 광음향 신호를 생성하는 샘플과 동일함을 보장합니다.다음으로, T 커넥터를 유동 챔버의 한쪽 암에 연결하고, 커넥터의 다른 가지들에 두 개의 시린지 펌프를 연결합니다. 하나의 시린지에는 공기를, 다른 시린지에는 앞서 준비한 세포 현탁액을 넣습니다. 그런 다음 두 시린지 펌프를 모두 작동시킵니다.두 가지 허용 가능한 유체가 T-접합부에 도달하면, 이들은 균질한 슬러그 형태로 분할되어 트랜스듀서를 지나 흐르게 됩니다. 흐르는 시료에 나노초 펄스 레이저를 조사하여 흑색종 세포 내에서 광음향파를 생성하십시오. 멜라닌은 광대역 광흡수체이므로, 가시광선 영역의 모든 레이저 파장을 사용할 수 있습니다.슬러그가 트랜스듀서 위에 있을 때 오실로스코프에 신호가 나타나면 해당 슬러그에 흑색종이 포함되어 있음을 나타냅니다. 슬러그를 수집 바이알에 떨어뜨리기 전에 시스템을 통해 추적하십시오. 면역세포화학 분석을 위한 시료를 준비하려면, 글라스 슬라이드를 사이토 퍼널에 넣고 사이토스핀에 장착하여 원심분리함으로써 포집된 세포가 글라스 슬라이드에 잘 부착되도록 하십시오.각 깔때기에 1% BSA/PBS 용액 100 µL를 넣습니다. 그런 다음 600 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 CyTOF 깔때기에 세포 시료를 첨가한 후, 600 RPM에서 3분 동안 다시 원심분리합니다.에탄올 기반 고정액을 슬라이드에 분사합니다. 그런 다음 비특이적 결합을 차단하기 위해 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 각 슬라이드를 goat serum 10 µL와 PBS 90 µL의 혼합액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 슬라이드의 액체를 따라내고 1차 항체 용액을 첨가합니다. 각 슬라이드에는 PBS에 희석한 1% rabbit mark, 1% mouse CD 45 및 10% goat serum이 포함되어야 하며, 습윤 챔버 내의 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 슬라이드를 10분 동안 세 번 세척합니다.그런 다음 슬라이드를 적절한 형광 2차 항체에 넣고 상온의 암소에서 1시간 동안 배양한 후, 슬라이드의 용액을 따라냅니다. 이어서 PBS로 5분씩 세 번 세척하고, 핵을 염색하기 위해 세포를 0.1 µg/mL의 DPI와 함께 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드의 용액을 따라내고 PBS로 세척합니다.마지막으로, 수지 기반의 봉입제를 사용하여 세포 샘플 위에 커버 슬립을 덮고 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉한 후 형광 현미경으로 촬영합니다. 백혈구와 흑색종 세포에서 생성된 광음향 파형이 여기 왼쪽에 표시되어 있습니다. 고유한 색소가 없는 백혈구는 광음향 파형을 생성하지 않으며, 오른쪽과 같이 전자 노이즈의 평탄한 선으로 나타납니다.하지만, 색소가 있는 멜라노마 세포는 강력한 광음향파를 생성합니다. 면역세포화학 염색 및 화학 염색 후, 배양된 멜라노마 세포는 청색의 점상 신호를 나타내며, 그중 하나는 DPI 이미지 위에 녹색으로 강조 표시되었고, 다른 하나는 백혈구 지표인 CD 45로 표시되었습니다. 이 그림은 발달 후 여러 백혈구 사이에 있는 멜라노마 세포를 보여줍니다.본 기술은 암 진단 분야의 연구자들이 전이 현상을 탐구하여 암 진단 능력을 향상시키고, 궁극적으로 암의 치명적인 확산을 치료할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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흑색종 줄기세포 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 얻는 방법

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