Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

다음 실험의 목적은 이차 종양이 형성되기 전에 암의 존재를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 4기 흑색종 환자로부터 혈액 샘플을 채취하고 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 혈액을 광음향 유동 챔버에 주입하여 흑색종 세포를 검출하고 분리합니다.

다음으로, 포획된 세포를 이미징하여 검출된 흑색종의 존재를 확인합니다. 결과는 광음향 파형 및 세포 이미징 기술을 기반으로 흑색종 세포를 정확하고 신속하게 검출하고 분리하는 시스템의 능력을 보여줍니다. R-T-P-C-R, 생체 자기 세포 분류(Magnetic Cell Sorting) 및 기타 방법과 같이 순환 흑색종 세포를 검출하는 기존 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 표지자가 필요 없는(label-free) 방식이며, 세포 표면을 변형하거나 기질에 고정하지 않고도 순환 흑색종 세포를 포획할 수 있다는 점입니다.

전이성 암 검출을 위한 시료를 준비하려면, 먼저 4기 암 환자로부터 전혈 약 10 milliliters를 채혈합니다. 두 개의 5 milliliter vacutainer 원심분리관에 나누어 담은 후, 3000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 그러면 혈액 시료가 세 개의 서로 다른 층으로 분리됩니다. 바닥 층은 적혈구로 구성됩니다.

버피 코트(buffy coat)라고도 불리는 중간층에는 백혈구와 멜라노마 세포가 포함되어 있으며, 상층에는 혈장과 혈소판이 포함되어 있습니다. 버피 코트가 섞이지 않도록 주의하며 혈장을 최대한 제거하십시오. 2 mL 튜브에 250 µL의 his opaque 10 77을 추가합니다.

9인치 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 혈장, 버피 코트(Buffy coat) 전체, 그리고 적혈구의 최상층을 추출합니다. 이때 수집량이 500 µL 미만이 되도록 주의하십시오. 추출한 용액을 미리 준비한 윈트로브(wind Trobe) 튜브로 옮깁니다.

혈액이 다시 분리되지만, 이번에는 적혈구가 hispa에 의해 분리되어 Buffy coat를 쉽게 추출할 수 있습니다. 9인치 Pesa 피펫을 사용하여 Buffy coat 전체를 분리해 2mL eend orph 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 2% v/v의 20이 포함된 1.5mL PBS에 현탁시키십시오.

유동 챔버를 제작하려면, 외경 20 mm, 내경 17 mm, 길이 8 mm의 아크릴 실린더를 준비합니다. 다음으로, 실린더 측면에 서로 90도 각도가 되도록 지름 5 mm의 구멍 3개를 뚫습니다. 그런 다음 폴리머 튜빙 3개를 절단하여 뚫린 구멍에 각각 끼웁니다.

아크릴 링 바닥에 파라필름을 팽팽하게 늘려 붙여 수밀 씰을 만듭니다. 파라필름은 아크릴 링과 함께 얕은 그릇 형태를 이루며, 유동 챔버를 형성할 아크릴아마이드 용액을 담게 됩니다. 서로 마주 보는 튜브 조각들을 통해 직경 1.6 millimeter 와이어를 현수시키며, 링 중앙을 통해 세 번째 튜브로 이어지는 와이어만 보이도록 조정합니다.

지름 1.6 millimeter 와이어를 삽입하고 튜브를 매달린 와이어로부터 1 millimeter 떨어진 곳에 배치합니다. 이 와이어들은 아크릴아마이드가 튜빙 내부로 들어가는 것을 방지합니다. 5 milliliters의 아크릴아마이드를 준비합니다.

그 다음 혼합물을 아크릴 링에 빠르게 부어 상단까지 채웁니다. 몇 초 후 용액이 겔화됩니다. 유체 챔버 몰드를 만들기 위해 아크릴아마이드 겔이 흐트러지지 않도록 주의하며 와이어를 조심스럽게 뽑아내면, 원통형의 유로와 유로에 초점을 맞출 광섬유를 배치할 공간이 형성됩니다.

이제 초음파 젤을 사용하여 음향적으로 유동 챔버를 사용할 준비가 되었습니다. 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride) 압전 음향 트랜스듀서를 유동 경로 바로 위의 유동 챔버에 결합하십시오. 바요넷 커넥터 또는 BNC 케이블을 사용하여 트랜스듀서를 광대역 수신기의 입력단에 연결하십시오.

필터의 출력을 오실로스코프에 연결하여 오실로스코프를 트리거합니다. 트랜스듀서 근처에 포토다이오드를 설치하고 BNC 케이블을 사용하여 이를 오실로스코프에 연결합니다. 유동 챔버의 작은 튜브를 작은 공기 주머니가 형성될 때까지 뽑아낸 후 트랜스듀서와 결합합니다.

그런 다음 광섬유를 삽입하고 포켓을 물로 채워 인터페이스 신호를 줄이고 유로에 조사되는 레이저 광의 양을 늘립니다. 광섬유의 수치 구경과 유로까지의 짧은 거리 덕분에, 레이저가 한 번에 하나의 샘플 슬러그만을 조사하게 되며, 이를 통해 레이저 바로 앞에 있는 샘플이 광음향 신호를 생성하는 샘플과 동일함을 보장합니다.

다음으로, 유동 챔버의 한쪽 팔에 T 커넥터를 연결하고, 커넥터의 다른 분지들에 두 개의 시린지 펌프를 연결합니다. 하나의 시린지에는 공기를, 다른 시린지에는 앞서 준비한 세포 현탁액을 넣습니다. 그런 다음 두 시린지 펌프를 모두 작동시킵니다.

두 개의 허용 가능한 유체가 T-접합부에 도달하면, 이들은 균질한 슬러그 형태로 분할되어 트랜스듀서를 지나 흐르게 됩니다. 흐르는 시료에 나노초 펄스 레이저를 조사하여 흑색종 세포 내에서 광음향 파동을 생성합니다. 멜라닌은 광범위한 광학 흡수체이므로, 가시광선 영역의 모든 레이저 파장을 사용할 수 있습니다.

슬러그가 트랜스듀서 위에 있을 때 오실로스코프에 신호가 나타나면 해당 슬러그에 흑색종이 포함되어 있음을 나타냅니다. 이를 수집 바이알에 넣기 전까지 시스템 전체에서 추적하십시오. 면역 세포 화학 분석을 위한 샘플을 준비하려면, 유리 슬라이드를 사이토 퍼널에 넣고 사이토 스핀에 장착하여 원심 분리함으로써 포집된 세포가 유리 슬라이드에 잘 부착되도록 합니다.

각 깔때기에 1% BSA in PBS 100 µL를 넣습니다. 그런 다음 600 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 CyTOF 깔때기에 세포 샘플을 추가한 후, 600 RPM에서 3분 동안 다시 원심분리합니다.

슬라이드에 에탄올 기반 고정액을 분무합니다. 그런 다음 비특이적 결합을 차단하기 위해 PBS로 10분 동안 두 번 세척합니다. 각 슬라이드를 염소 혈청 10 µL와 PBS 90 µL의 혼합액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 슬라이드의 액체를 따라내고 1차 항체 용액을 추가합니다. 각 슬라이드에는 PBS에 희석된 1% rabbit mark, 1% mouse CD 45 및 10% goat serum을 넣고 습윤 챔버 내의 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, PBS로 슬라이드를 10분씩 3회 세척합니다.

그 다음 슬라이드를 적절한 형광 2차 항체에 넣고 실온의 암소에서 1시간 동안 배양한 후, 슬라이드의 용액을 따라냅니다. 이어서 PBS로 5분씩 3회 세척하여 핵을 염색하고, 0.1 µg/mL의 DPI로 세포를 1분 동안 배양합니다. 그 후 슬라이드의 용액을 따라내고 PBS로 세척합니다.

마지막으로, 수지 기반의 봉입제를 사용하여 세포 샘플 위에 커버 슬립을 덮고, 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉한 후 형광 현미경으로 촬영합니다. 백혈구와 흑색종 세포에서 생성된 광음향 파형이 여기 왼쪽에 표시되어 있습니다. 고유의 색소가 없는 백혈구는 광음향 파형을 생성하지 않으며, 오른쪽과 같이 전자 노이즈 형태의 평탄한 선으로 나타납니다.

하지만, 색소가 있는 흑색종 세포는 강력한 광음향 파형을 생성합니다. 면역 세포 화학 염색 후, 배양된 흑색종 세포는 파란색으로 얼룩진 신호를 보이며, DPI 이미지 위에 녹색으로 표시된 하나가 강조되어 있고 CD 45가 백혈구 지표로 표시된 부분도 있습니다. 이 그림은 발달 후 여러 백혈구 사이에 있는 흑색종 세포를 보여줍니다.

본 기술은 암 검출 분야의 연구자들이 전이 현상을 탐구하여 암 검출 능력을 향상시키고, 궁극적으로는 암의 치명적인 확산을 치료할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.