Name: 에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 심근세포의 산소-포도당 결핍 및 재관류 모델을 이용한 간세포 이식 효과 평가 방법을. 공초점 현미경과 유세포 분석기로 세포 생존율을 정량화하여 심장 재생 연구에 활용합니다.

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이 작품은 OTKA (헝가리어 과학 연구 기금) D45933, T049621, TÉT (헝가리어 과학 재단) A4/04, Arg-17/2006과 죄, Bolyai, Öveges의 장학금과 TÁMOP 지원했습니다 4.2.2-08 / 1 / KMR - 2008-0004 및 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. 우리는 오버 음성을 제공하는 윌리엄 Gesztes 감사하고 싶습니다.

1. H9c2 cardiomyoblast 전지를 준비 H9c2 쥐 cardiomyoblasts는 ATCC (Wesel, 독일)에서 얻은 높은 포도당 (4.5 g / L) DMEM 10 % 태아 소 혈청, 4 MM의 L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린과 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는으로 확장되었습니다. H9c2 myoblast 전지 라인이 배아 쥐의 심장에서 파생된 것입니다, 그것은 골격과 심장 근육 8,9 모두 체외 모델로 사용됩니다. H9c2 세포의 12 잘 접시를 준비 : <ol><li> H9c2 세포의 배양 접시에서 문화 매체를 제거합니다. </li><li> 2-3 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 ML PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 37 ° C 배양기에서 5 분 페트리 접시 놓습니다. </li><li> 10 ML DMEM 문화 매체와 트립신을 억제. </li><li> 팔분을 위해 1200 RPM에서 세포를 다운 스핀. </li><li> Trypan 블루 염색법을 사용하여 hemocytometer 1 ML DMEM 배양 매체와 카운트 세포의 표면에 뜨는, resuspend 세포를 제거 후.</li><li> 이 ML DMEM에 따라 잘 12 잘 접시에 씨앗 30,000 H9c2 세포. </li><li> 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 2. 모의 국소 빈혈 / reperfusion 국소 빈혈 / reperfusion는 H9c2 세포 배양에서 산소 포도당 박탈 (OGD)를 수행하여 체외에서 모의​​했다. 이 절차는 OGD 동안 세포의 관찰을 허용 PeCon 세포 배양 시스템 (Erbach, 독일)와 자이스 혈구 공촛점 현미경의 무대에서 수행되었다. <ol><li> H9c2 세포의 12 잘 접시에서 열망으로 매체를 제거합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 물론 당 3 ML 포도당 무료 매체를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 시스템에 접시를 놓습니다. </li><li> 배양 시스템의 밖으로 산소를 정화하기 위해 질소 가스를 시작합니다. </li><li> 다음 타이머를 시작 산소 수준이 0.5 %에 도달할 때까지 기다리십시오. 0.5 %의 산소가 약 3 mmHg 부분 긴장을 의미합니다. 1 제목 셀모의 국소 빈혈의 50 분. </li><li> 모의 국소 빈혈의 끝에 세포에서 포도당 무료 매체를 제거합니다. </li><li> 우물에 피펫이 ML 일반 문화 매체. </li><li> 37 ° C CO 2 배양기에서 30 분 12 잘 접시를 놓고, 이것은 &quot;reperfusion 기간&quot;입니다. </li></ol> 3. 준비 구조 mesenchymal 줄기 세포 인간의 근본 골수는 T75 flasks 고려하고 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 100 U / ML 페니실린과 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 문화 매체, 4 MM의 L - 글루타민과 함께 희석되었다 1g / L 포도당. flasks 3 일 동안 5 % CO 2의 완전 humidified 분위기에서 37 ° C에서 incubated했다. 잠복기 후 flasks 및 골수의 나머지 구성 요소의 표면에 붙어 BMSCs은 PBS로 세척하여 제거되었습니다. 사용 BMSCs은 실험 1 5 구절 사이에 있었다. iden세포의 tity는 유동세포계측법와 혈통 특정 세포 표면 마커의 존재에 의해 확인되었다. 조혈 행수 특정 표면 마커 (CD34, CD45)와 mesenchymal 표면 마커 (CD73, CD90, CD105과 CD166)을 조사했다. 모의 국소 빈혈 동안 이식을위한 mesenchymal 줄기 세포를 구출 준비합니다. <ol><li> Vybrant는 DMEM 문화 매체 1:200 비율에서 한 형광 염료를 희석. </li><li> 구조 세포에서 매체를 기음과 Vybrant했던 300 μl DMEM를 추가합니다. </li><li> 37 ° C CO 2 배양기에서 30 분 장소 페트리 접시. </li><li> mesenchymal 줄기 세포의 배양 접시에서 문화 매체를 제거합니다. </li><li> 2-3 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 ML PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 37 ° C 배양기에서 5 분 페트리 접시 놓습니다. </li><li> 10 ML DMEM 문화 매체와 트립신을 억제. </li><li> 팔분을 위해 1200 RPM에서 세포를 다운 스핀. </li><li> supe을 제거한 후한 ML DMEM 배양 매체와 Trypan 블루 염색법을 사용하여 hemocytometer로 카운트 세포에 rnatant, resuspend 세포. </li><li> reperfusion의 끝에 30 분 postischemic H9c2 심장 myoblasts마다 잘 20,000 mesenchymal 줄기 세포를 추가한 후. </li><li> 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에 장소 세포의 공동 문화. </li></ol> 4. 공촛점 현미경과 분석 모의 국소 빈혈 / reperfusion 상해 후, 전지가 24 시간 동안 일반 문화 매체 incubated 수 있습니다. <ol><li> 24 시간 PBS로 두 번 세포를 씻어 후. </li><li> 30 분 (5 NM calcein 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2) 500 μl 죽은 / 라이브 염료 용액 (5x10 4 셀 / ML)에 세포를 얼룩. </li></ol> 형태학 및 형광 선정 살고 죽은 세포에 대한 공촛점 이미지의 평가는 ImageJ 소프트웨어 (보건 국립 연구소, 미국)과 함께 수행할 수 있습니다. C의 경우O - 문화, MSCS들은 Vybrant나요 셀 라벨로 인해 H9c2 세포에서 구분할 수 있습니다. 죽은 세포의 비율은 맹인 패션 10의 각 문화보기 4 독립적인 필드 (10X 목적)에서 평가할 수 있습니다. 42mm 유리 coverslips에 교양 H9c2 cardiomyoblasts도 공촛점 현미경으로 세포 배양 시스템을 사용하여 국소 빈혈 / reperfusion 상해시 후 시간 저속 비디오 현미경과 함께 조사하실 수 있습니다. 이러한 세포 융합과 세포 나노튜브의 형성과 같은 휴대 전화의 상호 작용은 시간이 지남에 따라 공부하실 수 있습니다. 5. 유동세포계측법와 분석 모의 국소 빈혈 / reperfusion 상해 후, 전지가 24 시간 동안 일반 문화 매체 incubated 수 있습니다. <ol><li> 24 시간 후에, 문화 미디어를 수확. 어떤 죽은 세포는 24 시간 incuba 동안 문화 접시 표면에서 분리 할 수​​ 있기 때문에 그것은 또한 문화 매체를 수집하는 것이 매우 중요합니다기. </li><li> 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> DMEM 문화 매체와 트립신을 억제. </li><li> 팔분위한 1,200 RPM (약 150-200그램)에서 세포와 수확 문화 매체를 돌린다. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 30 분 (5 NM calcein 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2) 500 μL 죽은 / 라이브 염료 용액 (5x10 4 셀 / ML)에 세포를 일시 중지합니다. </li><li> cytometry 튜브를 흐름 세포를 전송합니다. </li><li> CellQuest Pro 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 측정 흐름 cytometer를 설정하려면, 살고 죽은 세포의 샘플을 제어할 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 12 잘 접시에 3x10 4 밀도에 플레이트 H9c2 세포는 지점 1에 설명되어 있습니다. </li><li> 포인트 1 설명된대로 단일 trypsinisation로 셀 컨트롤을 살 준비합니다. </li><li> 1 시간 10 μm의 H 2 O 2와 치료에 의해 ​​죽은 세포 컨트롤을 준비합니다. </li><li> trypsinisation 후, resuspen500 μl 죽은 / 라이브 염료 용액 (5 NM calcein - AM 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2)에서 D 살고 죽은 세포 제어합니다. </li></ol></li><li> 죽은 세포가 homodimer 긍정적인 calcein 부정하고 ethidium하는 동안 살아있는 세포가 calcein 긍정적이고 부정적인 homodimer ethidium되도록 악기 설정을 조정해야합니다. </li><li> 그래프 및 통계 분석 바, 이러한 가치에 수행할 수 있습니다 이러한 인구의 비율은 표현할 수있다. </li><li> 다른 실험 그룹을 측정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 우리의 결과는 추가 mesenchymal 줄기 세포가 심장 세포 postischemic의 생존을 향상시킬 수 있다고했다. 공촛점 현미경 이미지 아마도 관찰된 보호 10 중요한 역할을 이러한 부분 멤브레인 연결 또는 세포 나노튜브로 직접 휴대 전화의 상호 작용을, 발표했다. 이러한 나노튜브는 여러 셀 D의 거리 스팬iameters, 그들의 직경은 200, 500 nm의 (흰색 화살표) 사이에 있었다. <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 세포 사이의 나노튜브 형성. 나노튜브 형성 (흰색 화살표)가 Vybrant DIO 표시 cardiomyoblasts 및 Vybrant나요 표시 mesenchymal 줄기 세포 사이에 관찰되었다. 유동세포계측법 분석은 생존의 인구 및 괴사성 cardiomyoblasts 및 mesenchymal 줄기 세포를 보여주었다. 흥미롭게도, 우리는 또한 calcein를 포함 세번째 &#39;부상&#39;cardiomyoblast 세포 인구를 관찰뿐만 아니라 죽은 세포, ethidium homodimer (그림 2)의 지표를 포함. <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 모의 국소 빈혈 후 다른 세포 집단의 대표 도트 플롯. 몇 가지 실험 슈의 평가postischemic H9c2의 cardiomyoblast에 mesenchymal 줄기 세포뿐만 아니라이 국소 빈혈 후 혼자 교양 심장 myoblasts (그림 3)에 비해 크게 살아있는 세포의 비율이 증가되는 결혼. <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. ., 또한 이후 증가 : 살아있는 세포의 postischemic cardiomyoblasts에 대한 줄기 세포 치료의 효과 비율이 크게 (90.36 ± 2.60 대 10.52 ± 0.48, ** P&gt; 0.001 제어 대 IR 모델) 컨트롤에 비해 모의 국소 빈혈 이후 감소되었다 mesenchymal 줄기 세포 (IR 모델 대 IR + BMSC : 10.52 ± 0.48 대 25.21 ± 2.13, ** P&gt; 0.001). 데이터 말은 ± SEM을 나타냅니다. 데이터의 통계 분석은 Tukey의 다중 비교 게시물을 임시 시험 분산의 한 방법으로 분석을 사용하여 실시되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

시연 프로토콜은 같은 모델의 모든 장점과 단점과 심근 경색에 줄기 세포 치료의 훨씬 더 복잡한 문제 체외 접근 방식에있다. 분명히 그것은 심근 경색 동안 후 일어나는 복잡한 (예 : 면역) 이벤트를 반영하지 수 있지만 postischemic 세포에 대한 추가 세포의 직접적인 효과에 초점을 맞출 수 있습니다. H9c2 cardiomyoblasts에 대한 시뮬레이션 국소 빈혈의 효과는 매우 사용되는 세포의 통과 번호와 O 2 농도에 OGD의 시간에 따라 달라집니다. 하나는 정확하게 이러한 매개 변수를 조정하고 표준 프로토콜을 위해 특정 세포 유형에 대한 최적 조건을 찾아야한다. 그 후, 프로토콜은 이러한 배아 줄기 세포, 유도 pluripotent 줄기 세포 또는 성인 줄기 세포 등 다양한 세포 유형 추가의 효과를 조사하기 위해 (신장, 간장 또는 국소 빈혈 / reperfusion 11,12,13,14 뇌성) 여러 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 15 전자에어컨 중간 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> calcein - AM </td><td> 분자 프로브 </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ethidium homodimer - 2 </td><td> 분자 프로브 </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant가나요 </td><td> 분자 프로브 </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> 표 1. 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 현미경에 대한 PeCon 세포 배양 시스템 </td><td> PeCon GmbH의 </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / reperfusion 모델

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

줄기 세포 이식 프로토콜은 임상 연습 1,2,3에 그들의 방법을 찾는 수 있습니다. 더 나은 결과를 얻기 프로토콜보다 강력한 만들기, implantable 세포에 대한 새로운 소스를 찾는 것이 4,5 최근 연구의 초점입니다. 세포 요법의 효과를 조사하는 것은 쉬운 일이 아니므로 새로운 도구는 치료 과정 6 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 필요합니다. 우리는 국소 빈혈 / reperfusion 상해시와 줄기 세포 이식 후 휴대폰 연결 심지어 subcellular 구조의 관찰을 허용하고 세포 요법의 효능을 평가하기 위해 국소 빈혈 / reperfusion의 실험 프로토콜을 설계했습니다. H9c2 cardiomyoblast 세포는 세포 배양 접시 7,8에 배치했다. 국소 빈혈은 0.5 % 이하의 산소 수준 포도당 무료 매체 150 분 모의했다. 그렇다면 정상적인 미디어와 산소 수준은 reperfusion을 시뮬레이트하기 위해 reintroduced되었습니다. 산소 포도당 박탈 후,손상된 세포는 문화에 그들을 추가하여 mesenchymal 줄기 세포를 파생 표시된 인간 골수의 이식과 함께 치료를했다. 그들이 최소한의 침략 수술 쉽게 쉽게 확장하고 autologous되기 때문에 Mesenchymal 줄기 세포는 임상 실험에서 원하는 있습니다. 공동 배양 24 시간 후 세포가 살고 죽은 세포를 구분하는 calcein하고 ethidium - homodimer로 얼룩진했다. 이 설정은 우리가 공촛점 형광 현미경을 사용하여 세포 연결을 조사하고 유동세포계측법에 의해 postischemic 세포의 생존 비율을 정할 수있었습니다. 공촛점 현미경은 세포 융합과 세포 나노튜브의 형성과 같은 두 가지 세포 집단의 상호 작용을 보여주었다. 유동세포계측법 분석 그래프를 꾸몄다 그리고 통계적으로 분석할 수 손상된 세포의 3 클러스터를 공개했다. 이러한 집단은 별도로 조사하고 결론은 시뮬레이션의 효과에 이러한 데이터를 발행한 수치료 접근.

우리는을 설정하는 방법을 보여줍니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 국소 빈혈 / reperfusion 모델과 방법을 postischemic 심장 세포에서 줄기 세포 치료의 효과를 평가할 수 있습니다.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

줄기세포 이식 프로토콜이 임상 현장에 도입되고 있습니다1,2,3. 더 나은 결과를 얻고, 프로토콜의 견고함을 높이며, ...

심장 유래 세포를 세포 배양 플레이트에 분주하여 허혈 상태를 시뮬레이션합니다. 포도당이 없는 배지에서 150분 동안 산소 농도를 0.5% 미만으로 유지하여 허혈 재관류 모델의 허혈 상태를 유도합니다. 이 허혈 기간 동안 대부분의 세포에서 수축 및 기포 형성 현상이 나타납니다. 이후 일반 배지와 산소 농도를 다시 도입하여 재관류 상태를 시뮬레이션합니다.중간엽 줄기세포를 손상된 세포와 함께 첨가하여 함께 배양합니다. 24시간 동안 공동 배양한 후, 생존 세포와 사멸 세포를 구분하기 위해 칼슘 및 Ethereum homodimer로 세포를 염색합니다. 공초점 현미경을 통해 두 세포 집단과 그들 사이의 상호작용이 명확하게 나타나며, 유세포 분석을 통해 손상된 세포의 세 가지 클러스터를 확인하여 이를 그래프로 도식화하고 통계적으로 분석할 수 있습니다. 줄기세포 이식 프로토콜이 임상 실무에 도입되고 있으며, 최근 연구는 더 나은 결과를 도출하고 프로토콜의 견고함을 높이며 이식 가능한 세포의 새로운 공급원을 찾는 데 집중하고 있습니다.세포 치료의 효능을 조사하는 것은 쉬운 일이 아니며, 치료 과정에 관여하는 메커니즘을 규명하기 위해 새로운 도구가 필요합니다. 본 연구진은 허혈, 재관류 손상 및 줄기세포 이식 과정 중에 세포 간 연결은 물론 하위 세포 수준의 메커니즘까지 관찰할 수 있도록 실험 프로토콜을 설계하였습니다. 저희의 설계 기준은 숙주 세포와 공여 세포만이 존재하는 완전한 인비트로(in vitro) 시스템을 구축하는 것이었습니다.따라서 주변 조직으로부터 분리됩니다. 손상 전, 중, 후 최대 24시간까지 세포 생존력을 지속적으로 측정합니다. 또한 두 세포 집단을 명확히 식별하여 이식된 세포의 운명을 추적할 수 있습니다.이 목표를 달성하기 위해, 우리는 흔히 OGD로 약칭하는 산소 및 포도당 결핍 프로토콜을 설정하고, 이후 재산소화 기간을 갖도록 하였습니다. 숙주 세포로는 알려진 적심근세포주인 C2 세포의 9세대 세포를 선택하였습니다. OGD 이후, 손상된 세포들은 배양액에 골수 유래 중간엽 줄기세포를 첨가하여 이식함으로써 회복을 지원하였습니다.이 설정을 통해 공초점 망막 및 현미경을 사용하여 세포 간 연결을 조사하고, 유세포 분석법으로 손상된 세포의 생존율을 정량화할 수 있었습니다. 이제 실제로 어떻게 수행하는지 살펴보겠습니다. H9c2 세포에서 배양액을 제거하십시오.세포를 PBS로 두 번 세척하고 0.05% trypsin EDTA로 페트리 접시에서 5분 동안 처리합니다. 37°C 인큐베이터 내에서 DMEM 배양 배지를 사용하여 trypsin의 활성을 억제합니다. 세포를 1200 RPM에서 8분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후 세포를 1 mL DMEM 배양액에 재현탁하고, 트라이판 블루(trypan blue) 염색을 이용해 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 12-웰 플레이트의 각 웰에 30,000개의 H9C2 세포를 분주합니다. 플레이트를 37°C CO₂ 배양기에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 흡입법으로 배지를 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척합니다.글루코스가 없는 배지 3 mL를 추가합니다. 플레이트를 세포 배양 시스템에 넣습니다. 질소 가스를 주입하여 배양 시스템 내의 산소를 제거하기 시작합니다.산소 농도가 0.5%에 도달할 때까지 기다립니다. 그 후 타이머를 시작하십시오. 산소 농도 0.5%는 수은주 부분압으로 약 3 mmHg를 의미합니다. 대상 세포를 150분 동안 모의 허혈 상태에 둡니다. 허혈 상태 동안 세포는 표면에서 떨어져 나가기 시작하며 세포막에 기포가 형성되기 시작합니다. 각 세포군마다 필요한 시간이 약간씩 다르며, 세포의 60~80%가 이러한 양상을 보일 때까지 진행하는 것이 적절함을 확인하였습니다.그렇기 때문에 먼저 2시간의 R 배양부터 시작할 것을 권장합니다. 그리고 이것으로 충분하지 않다면, OGD 시간을 늘리십시오. 본 실험의 경우, 9세대 C2 세포는 모사 허혈 종료 시점에 일반적으로 150분에서 170분의 OGD가 필요합니다.세포에서 포도당이 없는 배지를 제거하고, 각 웰에 일반 배양 배지를 피펫으로 분주합니다. 12-웰 플레이트를 37°C 이산화탄소 배양기에 30분 동안 둡니다. 이 과정이 재관류 기간입니다.모의 허혈 상태 동안, 이식을 위한 구조 세포를 준비합니다. 형광 식단인 vibrant DID를 DMEM 배양액에 1:200 비율로 희석합니다. 구조 세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고, vibrant Brent Place 페트리 접시에서 300 µL의 DMEM을 추가한 후 37 °C 이산화탄소 배양기에서 30분 동안 배양합니다.재관류 종료 후 30분이 지난 시점에, 허혈 후 상태의 H9C2 심근모세포가 담긴 웰당 1,000개의 중간엽 줄기세포를 첨가합니다. 초기 단계는 H9C2 세포 파종 시와 동일하게 PBS로 2회 세척한 후 트립신 처리 및 세포 수를 측정하는 과정으로 진행합니다. 세포 공배양 접시를 37°C, CO₂ 배양기에 넣고 24시간 동안 배양합니다.24시간 후, 웰에서 배양액과 부착 세포를 수확합니다. 24시간 배양하는 동안 일부 사멸한 세포가 배양 접시 표면에서 떨어져 나왔을 수 있으므로 배양액을 함께 수집하는 것이 매우 중요합니다.세포를 500 µL의 live, dead, die 용액, 5 nM Ca²⁺ 및 400 nM Ethidium homodimer가 포함된 PBS에 현탁하여 5 × 10⁴ cells/mL 농도로 조절합니다. 공동 배양의 경우, 각각의 형광 세포 표지를 통해 중간엽 줄기세포와 H9C2 세포를 구분합니다. 이를 통해 세포 융합 및 세포 간 접촉 부위를 검출할 수 있습니다.각 배양액에 대해 10배 대물렌즈를 사용하여 4개의 독립된 시야에서 사멸 세포의 비율을 맹검법으로 평가하면 재현 가능한 세포 수 측정 결과를 얻을 수 있습니다. 세포를 유세포 분석용 튜브로 옮깁니다. cell Quest Pro 소프트웨어를 실행하여 유세포 분석기를 측정 설정합니다.생존 세포와 사멸 세포의 대조군 샘플을 준비합니다. 생존 세포는 정상 조건에서 동일한 밀도로 배양하고 칼슘으로 염색합니다. 사멸 세포는 10 µM 과산화수소로 1시간 동안 처리한 후 Ethereum homodimer로 염색하며, 동일한 방식으로 수확합니다. 기기 설정은 생존 세포가 칼슘 양성 및 Ethereum homodimer 음성으로 나타나도록 조정해야 합니다.사멸된 세포는 calcium 음성이며 Ethereum homodimer 양성을 띠는 반면, 이러한 세포 집단의 비율은 그래프의 막대로 표시할 수 있으며 해당 값들에 대해 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 연구 결과, 건강한 줄기세포를 추가하면 집단 내 생존 세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였습니다. 흥미롭게도, 손상 후 살아남은 세포들은 사멸된 세포들뿐만 아니라 계속 살아있던 세포들과도 구분하여 게이팅(gating)할 수 있음을 관찰하였습니다.우리는 이 세포 집단이 추가적인 연구 가치가 있다고 믿습니다. 이 영상을 시청하신 후, 여러분은 표준화된 방식으로 체외 줄기세포 이식을 통한 모의 허혈 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 기술적인 문의 사항이 있으시면 언제든지 저희에게 연락해 주십시오. 성심껏 도와드리겠습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인도에 대한 수술 배아 줄기 세포 - 파생 허혈성 hindlimb에 내피 세포가 bioluminescence 이미징에 의해 비침습 추적, 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 치료를위한 배아 줄기 세포 유래 내피 세포

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 마우스 모델 선의 이상 조사를 설립 하다. 우리는 distally 오른쪽 중간 대뇌 동맥과 바로 일반적인 경 동맥 선 하 고 국 소 빈 혈의 10 또는 40 분 후 혈액 흐름을 복원.

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델

여기에서, 우리는 재건 미세 수술에서 허혈 재관류 상해의 병리생리학을 공부하기 위한 전임상 동물 모델을 기술한다. 이 자유 피부 플랩 모델은 쥐에 있는 표면 의 코달 상복부 혈관에 기초하 고 또한 허혈 재관류 상해 관련 손상을 중화하기 위하여 다른 치료 및 화합물의 평가를 허용할 수 있습니다.

재건 미세 수술에서 허혈 재관류 손상의 연구를위한 전 임상 쥐 모델

우리는 좌측 경부 동맥 막힘과 세포 기반 치료를 위한 줄기 세포의 심혈 투여의 효과 및 안전성 을 테스트하기 위해 신속한 속도에 의해 유도된 심부전의 돼지 모델을 확립하고자 했습니다.

줄기 세포 치료를위한 심근 경색 심부전의 돼지 모델 설립

줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.

체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발

이 논문은 I/R 개발 및 치료를 더 잘 이해하기 위해 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 3 일 간의 병아리 배아에서 허혈 재관류 (I/R) 모델링을 설명합니다. 이 모델은 간단하고 빠르며 저렴합니다.

3일간의 병아리 배아를 이용한 후크 허혈-재관류 모델의 생성

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

상기 프로토콜은 뇌척수증-허혈성 뇌 조직의 피알 표면에 혈관 측두근 피판의 이식-모야모야 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 혈관신생 증가에 대한 접근법의 효능은 마우스에서 일시적인 중뇌 동맥 폐색 모델을 사용하여 평가됩니다.

마우스에서 중뇌동맥 폐색 유발 뇌졸중 후 뇌근육활막증 치료 모델

여기서는 고대사성 근위 소관 상피 세포에서 저산소증/산소 재산화 손상을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 대사 스트레스 유발 손상을 유도하도록 설계되었으며, 근위 세뇨관 손상 지표의 발현과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 측정할 수 있습니다.

근위 관 상피 세포에서 저산소증/재산소화 손상 모델링

배우세요 심근세포의 산소-포도당 결핍 및 재관류 모델을 이용한 간세포 이식 효과 평가 방법을. 공초점 현미경과 유세포 분석기로 세포 생존율을 정량화하여 심장 재생 연구에 활용합니다.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

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