에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

심장 유래 세포를 세포 배양 플레이트에 분주하여 허혈 상태를 시뮬레이션합니다. 포도당이 없는 배지에서 150분 동안 산소 농도를 0.5% 미만으로 유지하여 허혈 재관류 모델의 허혈 상태를 유도합니다. 이 허혈 기간 동안 대부분의 세포에서 수축 및 기포 형성 현상이 나타납니다. 이후 일반 배지와 산소 농도를 다시 도입하여 재관류 상태를 시뮬레이션합니다.

중간엽 줄기세포를 손상된 세포와 함께 첨가하여 함께 배양합니다. 24시간 동안 공동 배양한 후, 생존 세포와 사멸 세포를 구분하기 위해 칼슘 및 Ethereum homodimer로 세포를 염색합니다. 공초점 현미경을 통해 두 세포 집단과 그들 사이의 상호작용이 명확하게 나타나며, 유세포 분석을 통해 손상된 세포의 세 가지 클러스터를 확인하여 이를 그래프로 도식화하고 통계적으로 분석할 수 있습니다. 줄기세포 이식 프로토콜이 임상 실무에 도입되고 있으며, 최근 연구는 더 나은 결과를 도출하고 프로토콜의 견고함을 높이며 이식 가능한 세포의 새로운 공급원을 찾는 데 집중하고 있습니다.

세포 치료의 효능을 조사하는 것은 쉬운 일이 아니며, 치료 과정에 관여하는 메커니즘을 규명하기 위해 새로운 도구가 필요합니다. 본 연구진은 허혈, 재관류 손상 및 줄기세포 이식 과정 중에 세포 간 연결은 물론 하위 세포 수준의 메커니즘까지 관찰할 수 있도록 실험 프로토콜을 설계하였습니다. 저희의 설계 기준은 숙주 세포와 공여 세포만이 존재하는 완전한 인비트로(in vitro) 시스템을 구축하는 것이었습니다.

따라서 주변 조직으로부터 분리됩니다. 손상 전, 중, 후 최대 24시간까지 세포 생존력을 지속적으로 측정합니다. 또한 두 세포 집단을 명확히 식별하여 이식된 세포의 운명을 추적할 수 있습니다.

이 목표를 달성하기 위해, 우리는 흔히 OGD로 약칭하는 산소 및 포도당 결핍 프로토콜을 설정하고, 이후 재산소화 기간을 갖도록 하였습니다. 숙주 세포로는 알려진 적심근세포주인 C2 세포의 9세대 세포를 선택하였습니다. OGD 이후, 손상된 세포들은 배양액에 골수 유래 중간엽 줄기세포를 첨가하여 이식함으로써 회복을 지원하였습니다.

이 설정을 통해 공초점 망막 및 현미경을 사용하여 세포 간 연결을 조사하고, 유세포 분석법으로 손상된 세포의 생존율을 정량화할 수 있었습니다. 이제 실제로 어떻게 수행하는지 살펴보겠습니다. H9c2 세포에서 배양액을 제거하십시오.

세포를 PBS로 두 번 세척하고 0.05% trypsin EDTA로 페트리 접시에서 5분 동안 처리합니다. 37°C 인큐베이터 내에서 DMEM 배양 배지를 사용하여 trypsin의 활성을 억제합니다. 세포를 1200 RPM에서 8분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후 세포를 1 mL DMEM 배양액에 재현탁하고, 트라이판 블루(trypan blue) 염색을 이용해 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 12-웰 플레이트의 각 웰에 30,000개의 H9C2 세포를 분주합니다. 플레이트를 37°C CO₂ 배양기에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 흡입법으로 배지를 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척합니다.

글루코스가 없는 배지 3 mL를 추가합니다. 플레이트를 세포 배양 시스템에 넣습니다. 질소 가스를 주입하여 배양 시스템 내의 산소를 제거하기 시작합니다.

산소 농도가 0.5%에 도달할 때까지 기다립니다. 그 후 타이머를 시작하십시오. 산소 농도 0.5%는 수은주 부분압으로 약 3 mmHg를 의미합니다. 대상 세포를 150분 동안 모의 허혈 상태에 둡니다. 허혈 상태 동안 세포는 표면에서 떨어져 나가기 시작하며 세포막에 기포가 형성되기 시작합니다. 각 세포군마다 필요한 시간이 약간씩 다르며, 세포의 60~80%가 이러한 양상을 보일 때까지 진행하는 것이 적절함을 확인하였습니다.

그렇기 때문에 먼저 2시간의 R 배양부터 시작할 것을 권장합니다. 그리고 이것으로 충분하지 않다면, OGD 시간을 늘리십시오. 본 실험의 경우, 9세대 C2 세포는 모사 허혈 종료 시점에 일반적으로 150분에서 170분의 OGD가 필요합니다.

세포에서 포도당이 없는 배지를 제거하고, 각 웰에 일반 배양 배지를 피펫으로 분주합니다. 12-웰 플레이트를 37°C 이산화탄소 배양기에 30분 동안 둡니다. 이 과정이 재관류 기간입니다.

모의 허혈 상태 동안, 이식을 위한 구조 세포를 준비합니다. 형광 식단인 vibrant DID를 DMEM 배양액에 1:200 비율로 희석합니다. 구조 세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고, vibrant Brent Place 페트리 접시에서 300 µL의 DMEM을 추가한 후 37 °C 이산화탄소 배양기에서 30분 동안 배양합니다.

재관류 종료 후 30분이 지난 시점에, 허혈 후 상태의 H9C2 심근모세포가 담긴 웰당 1,000개의 중간엽 줄기세포를 첨가합니다. 초기 단계는 H9C2 세포 파종 시와 동일하게 PBS로 2회 세척한 후 트립신 처리 및 세포 수를 측정하는 과정으로 진행합니다. 세포 공배양 접시를 37°C, CO₂ 배양기에 넣고 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후, 웰에서 배양액과 부착 세포를 수확합니다. 24시간 배양하는 동안 일부 사멸한 세포가 배양 접시 표면에서 떨어져 나왔을 수 있으므로 배양액을 함께 수집하는 것이 매우 중요합니다.

세포를 500 µL의 live, dead, die 용액, 5 nM Ca²⁺ 및 400 nM Ethidium homodimer가 포함된 PBS에 현탁하여 5 × 10⁴ cells/mL 농도로 조절합니다. 공동 배양의 경우, 각각의 형광 세포 표지를 통해 중간엽 줄기세포와 H9C2 세포를 구분합니다. 이를 통해 세포 융합 및 세포 간 접촉 부위를 검출할 수 있습니다.

각 배양액에 대해 10배 대물렌즈를 사용하여 4개의 독립된 시야에서 사멸 세포의 비율을 맹검법으로 평가하면 재현 가능한 세포 수 측정 결과를 얻을 수 있습니다. 세포를 유세포 분석용 튜브로 옮깁니다. cell Quest Pro 소프트웨어를 실행하여 유세포 분석기를 측정 설정합니다.

생존 세포와 사멸 세포의 대조군 샘플을 준비합니다. 생존 세포는 정상 조건에서 동일한 밀도로 배양하고 칼슘으로 염색합니다. 사멸 세포는 10 µM 과산화수소로 1시간 동안 처리한 후 Ethereum homodimer로 염색하며, 동일한 방식으로 수확합니다. 기기 설정은 생존 세포가 칼슘 양성 및 Ethereum homodimer 음성으로 나타나도록 조정해야 합니다.

사멸된 세포는 calcium 음성이며 Ethereum homodimer 양성을 띠는 반면, 이러한 세포 집단의 비율은 그래프의 막대로 표시할 수 있으며 해당 값들에 대해 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 연구 결과, 건강한 줄기세포를 추가하면 집단 내 생존 세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였습니다. 흥미롭게도, 손상 후 살아남은 세포들은 사멸된 세포들뿐만 아니라 계속 살아있던 세포들과도 구분하여 게이팅(gating)할 수 있음을 관찰하였습니다.

우리는 이 세포 집단이 추가적인 연구 가치가 있다고 믿습니다. 이 영상을 시청하신 후, 여러분은 표준화된 방식으로 체외 줄기세포 이식을 통한 모의 허혈 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 기술적인 문의 사항이 있으시면 언제든지 저희에게 연락해 주십시오. 성심껏 도와드리겠습니다.