을 통해 대사 경로 확인 및 검색 ^{13 C - 라벨링}

본 프로토콜의 목적은 탄소 13 보조 대사 분석을 통해 박테리아의 대사를 연구하는 것입니다. 우선, 표지된 탄소 기질이 존재하는 환경에서 미생물을 배양하여 해당 기질이 미생물 단백질에 통합되도록 합니다. 그 다음 미생물을 수확하고 아미노산을 추출, 가수분해 및 유도체화합니다.

샘플을 가스크로마토그래피-질량분석기(GCMS)에 적용합니다. 생화학 네트워크 내 대사산물 간의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 미생물이 이용하는 기능적 대사 경로를 결정할 수 있습니다. 저는 Bert Burla입니다.

여기에서 제시하는 방법은 미생물의 대사 경로를 결정하기 위해 전사체학 및 단백질체학의 보완책으로 사용될 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 시아노박테리아와 같은 광합성 미생물의 마이오트로픽(myotrophic) 또는 종속영양 탄소 이용 능력을 조사했습니다. 본 영상에서는 표지된 탄소 기질을 사용하여 새로운 효소 기능을 발견하는 방법을 시연하기 위해 ANOTHE 5 1 1 42를 모델 균주로 사용할 것입니다.

이 실험 절차는 저와 li Yu, 그리고 Chu Yang Fang이 시연하겠습니다. 먼저 표시되지 않은 배지에서 cyana thesei 박테리아를 배양하여 절차를 시작합니다. 박테리아가 대수 성장기 중간 단계에 도달하면, 부피 대비 3%를 탄소 13 표시 배지에 접종합니다.

그 후, 초기 접종 배양액으로부터 라벨링되지 않은 탄소가 대수 성장기 중간 단계의 동일한 라벨링 배지로 유입되는 것을 방지해야 합니다. 13C 라벨링된 Cy Thesei 박테리아가 대수 성장기 중간 단계에 도달하면, 원심분리를 통해 10 milliliters를 수확하십시오. 펠렛을 6 molar 염산 1.5 milliliters에 재현탁한 후, 투명한 유리 스크류 캡 가스 크로마토그래피 또는 GC 바이알로 옮기십시오.

바이알의 캡을 닫고 100 °C 오븐에 24시간 동안 두어 바이오매스 단백질을 아미노산으로 가수분해합니다. 바이오매스 펠렛을 가수분해하면 20가지의 일반적인 아미노산 중 16가지가 생성됩니다. 가수분해 후, 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 20,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 가수분해 후, 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 20,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 고체 입자를 침전시킵니다.

원심 분리 후, 가수분해 용액 내의 고체 입자가 GC 컬럼에 유입되지 않도록 상층액을 새로운 GC 바이알로 옮깁니다. 다음으로, 가스 크로마토그래피 분리를 위해 아미노산을 휘발성으로 만들기 위해 유도체화합니다. 건조된 시료를 150 µL의 테트라하이드로퓨란(THF)과 150 µL의 N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA)로 용해합니다.

Acetamide, T-B-D-M-S 유도체화 시약을 첨가한 모든 샘플을 65~80 °C의 오븐에서 1시간 동안 배양하십시오. 바이알 내의 대사물이 완전히 용해되도록 가끔씩 볼텍싱하십시오. 샘플을 20,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 GC 바이알로 옮기십시오.

상층액은 맑은 노란색 용액이어야 합니다. GC 온도는 다음과 같이 설정하며, 150 °C에서 2분 동안 유지합니다. 이후 분당 3 °C씩 온도를 높여 280 °C까지 올립니다.

분당 20 °C씩 300 °C까지 온도를 올린 후, 5분 동안 유지합니다. 그 후 30 m GC 컬럼의 경우, 용매 지연 시간을 약 5분으로 설정하고 질량 대 전하비(mass to charge ratio) 범위를 60에서 500 사이로 설정합니다. 1~5 또는 1~10의 분할 비율(split ratio)로 1 µL의 시료를 주입하고, 운반 가스로 1.2 mL/min의 헬륨을 사용하여 GCMS로 시료를 분석합니다.

Microsoft Excel을 사용하여 GCMS 데이터를 분석하십시오. 각 아미노산의 GC 머무름 시간과 고유한 질량 대 전하비 피크가 이 그림에 나타나 있습니다. T-B-D-M-S 유도체화된 아미노산은 일반적으로 MS에 의해 두 개의 전하 파편으로 명확하게 분리되는데, 류신과 이소류신의 경우 아미노산 전체를 포함하는 M-57 파편과 아미노산의 알파 카복실기가 결여된 M-159 파편으로 나뉩니다.

M minus 57 피크는 다른 질량 피크 파편들에 의해 중첩되었습니다. N minus 15는 전체 아미노산 라벨링을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 또한, F 3 0 2 그룹은 대부분의 아미노산에서 빈번하게 검출되며, 이는 아미노산 주쇄의 첫 번째 알파 카복실 그룹과 두 번째 탄소만을 포함합니다.

하지만 이 Ms.Peak는 종종 신호 대비 잡음비가 높기 때문에, 대사 플럭스를 정량적으로 분석하는 데 F 3 0 2를 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 아미노산이나 중심 대사물질의 유도체화는 carbon 13, oxygen 18, silicon 29 및 silicon 30을 포함하여 상당량의 자연 표지 동위원소를 유입시킵니다. 가공되지 않은 질량 동위원소 또는 스펙트럼에서 자연 동위원소로 인해 발생하는 측정 잡음은 기출판된 소프트웨어를 사용하여 보정할 수 있습니다.

최종 동위원소 표지 데이터는 질량 분율로 보고됩니다. 예를 들어, 0개에서 4개의 탄소-13 표지 탄소를 포함하는 단편을 나타내는 M0, M1, M2, M3 및 M4가 있습니다. 이 5 1 1 2에는 일반적인 이소류신 합성 경로에서 트레오닌을 2-케토부티레이트로 전환하는 효소인 트레오닌 암모니아 리아제(threonine ammonia lyase)가 포함되어 있지 않습니다.

따라서 이 유기체에서 isle 경로를 규명하기 위해, cyana THESEI 5 1 1 42를 54 millimolar glycerol이 포함된 ASP two 배지에서 배양하고 여기에서 보여주는 것과 같이 이 비디오에 설명된 대로 GCMS로 분석하였습니다. Cyana Thesei 5 1 1 4 2는 2번 위치가 표지된 glycerol을 주요 탄소원으로 이용하며, pyruvate가 전구체인 thianine과 alanine은 하나의 표지된 탄소를 갖는 반면 ISO leucine은 세 개의 탄소가 표지되었음을 관찰하였습니다. 따라서 cyana these 5 1 1 4 2의 합성은 대부분의 유기체가 사용하는 thianine 경로에서 유래될 수 없습니다. 반면, leucine과 ISO leucine은 fragment M minus 15 및 fragment M minus 1 59를 기준으로 동일한 표지 패턴을 보입니다.

예를 들어, 분절되지 않은 아미노산을 포함하는 N minus 15 동위원소 또는 데이터에서는 leucine과 ISO leucine의 표지가 동일하게 나타났습니다. 따라서 leucine과 ISO leucine은 동일한 전구체인 pyruvate와 acetyl-CoA로부터 합성되어야 합니다. 이러한 관찰 결과는 isle 합성을 위한 Citra malate 경로의 표지된 탄소 전이와 일치합니다.

이 방법은 매우 다양한 미생물의 대사를 조사하는 데 사용할 수 있으며, 숙달되면 시작부터 끝까지 약 일주일 만에 수행할 수 있습니다.