Name: 을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13 C - 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 탄소-13 동위원소 표지를 이용한 세균 대사 경로 분석 방법입니다. GC-MS로 아미노산을 분석하여 미생물의 생화학적 네트워크를 추적하고 기능적 대사 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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이 연구는 NSF 커리어 그랜트 (MCB0954016)와 DOE Bioenergy 연구 부여 (DEFG0208ER64694)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 (그림 1) <ol><li> 미량 원소, 소금, 비타민 및 경로 조사에 가장 구체적으로 표시 탄소 기판과 최소한의 매체 세포를 성장. 세포 배양에 대한 흔들림 flasks 또는 bioreactors 중 하나를 사용하십시오. 이러한 효모 추출물로 유기 영양분은 아미노산 라벨의 측정을 방해할 수 있으며 따라서 문화 매체에있는 수 없습니다. </li><li> UV / VIS 분광 광도계와 함께 최적의 파장 (예 : 51,142 Cyanothece에 대한 OD 730)에서 문화의 광학 밀도에 의한 세포 성장을 모니터링합니다. </li><li> 세포가 처음이 아닌 표시 매체 성장하실 수 있습니다. 중간 로그 성장 위상 세포는 레이블 매체 접종 (볼륨 접종 비율을 3 % (V / V))에 사용 선호하고 있습니다. 표시된 문화는 초기 inoculum 이외의 레이블 탄소의 도입을 피하기 위해 같은 표시된 매체 (3 % V / V 접종 비율) 하위 교양하여야한다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 아미노산 추출 <ol><li> 원심 분리 (10 분, 8,000 × g)하여 중간 로그 성장 단계에서 수확 하위 교양 전지 (10mL). </li><li> 6M HCL의 1.5mL의 펠렛을 Resuspend하고 맑은 유리, 나사 맨 GC의 약병에 전송할 수 있습니다. 튜브를 모자 아미노산으로 바이오 매스 단백질 hydrolyze 24 시간 동안 100 ° C의 오븐에 넣어. 바이오 매스 펠렛의 가수 분해는 20 일반적인 아미노산 (그림 2) 5 16를 얻을 수 있습니다. 시스테인과 트립토판가 타락하고, 글루타민과 아스파라긴는 각각, 글루 탐 산염 및 aspartate로 변환됩니다. </li><li> 이 ML Eppendorf 튜브를 사용하여 5 분 20,000에서 아미노산 솔루션 × g을 원심 분리기, 새로운 GC의 튜브에 supernatants을 전송. 이 단계는 가수 분해 용액에 고체 입자를 제거합니다. </li><li> GC 유리 뚜껑을 제거하고 써모 과학 Reacti - Vap 증발기 (주를 사용하여 공기의 흐름에 따라 완전히 샘플을 건조 : 동결 건조기에도 T를 사용할 수 있습니다O 건조 샘플). 이 단계는 하룻밤 사이에 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 아미노산 derivati​​zation 및 GC - MS 조건 GC를 통해 아미노산 또는 유료 / 높은 극지 metabolites 분석이 metabolites는 아미노산이 휘발성이며, 가스 크로마 토그래피 2 분리될 수 있도록 derivatized 있어야합니다. <ol><li> tetrahydrofuran 150 μL (THF)와 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide derivati​​zation 시약 150 μL로 건조 샘플을 디졸브. </li><li> ° C 1 시간 65 80 사이의 오븐이나 열탕 목욕의 모든 샘플을 품어. 유리병에 metabolites가 해산되어 있는지 확인하기 위해 가끔 소용돌이. </li><li> 10 분 20,000 × g에서 샘플을 원심 후 새로운 GC의 튜브에 뜨는을 전송. 뜨는은 명확하고 노란 솔루션을해야합니다. 감지기의 포화로 인해, GC - MS 측정 정확도가 높은 conce에 의해 영향을받을 수주입 TBDMS derivatized 아미노산 (이 예제는 종종 어두운 갈색 색상을 보여줍니다)의 ntration 따라서, 우리는 GC - MS 측정 6 전 THF를 사용하여 이러한 샘플을 희석한다. </li><li> GC - MS (1시 5분 또는 1시 10분 분할 비율, 주입 부피 이용 = 1 μL, 캐리어 가스 헬륨 = 1.2 ML / 분).하여 샘플을 분석 다음 GC 온도 프로그램 사용 : 150에서 보류 ° 2 분 C, 3 증가 ° C 280 분 당 ° C, 20 ° C 증가 분 당 300 ° C, 그리고 5 분 만요. 솔벤트 지연이 ~ 5 분 (30m GC 열)로 설정할 수 있습니다. MS의 비율 (M / Z)를 충전하기 위해 대량의 범위는 60 500 사이에서 설정할 수 있습니다. </li></ol> 4. GC - MS 데이터 분석 <ol><li> TBDMS derivati​​zed 아미노산 측정은 또한 GC 분리의 동위 원소의 차별에 의해 영향을받을 수 있습니다. 가벼운 동위 원소는 GC 열의 동위 원소을 끌어들여보다 약간 이동합니다. 잠재적인 측정 바이어스를 줄이기 위해, 우리는 전체의 질량 스펙트럼을 평균 수아미노산 피크 범위 6 </li><li> TBDMS derivatized metabolites의 GC와 MS 스펙트럼 7 이전에보고되었습니다. 각각의 아미노산에 대한 GC 유지 시간과 고유한 M / Z 봉우리는 그림 3에서 그림입니다. </li><li> 아미노산이나 중앙 metabolites의 Derivatization 13 C (1.13 %)를 포함한 자연 - 분류 동위 원소의 상당 금액, 18 O (0.20 %), 29시 (4.70 %), 30시 (3.09 %)를 소개합니다. 원시 대량 isotopomer 스펙트럼 자연 동위 원소에서 측정 잡음은 출판 소프트웨어 5, 8을 사용하여 해결할 수 있습니다. 최종 isotopic 라벨 데이터는 대량 분수, 예를 들어, M 0, M 1, M 2, M 3 M 4로보고됩니다 (영 네 가지 13 C 표시된 탄소를 포함하는 조각을 대표). </li><li> 2 - 옥소 - glutar : 아미노산의 측정 여덟 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공할 수3 - P - glycerate, 아세틸 - COA, erythrose - 4 - P, oxaloacetate, phosphoenolpyruvate, pyruvate, 그리고 리보 오스 - 5 - P, 먹었다. 이러한 metabolites의 라벨 패턴은 여러 중앙 신진 대사 경로 (그림 2) 9을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨 실험의 결과는 더 이상 (예, RT - PCR) 다른 생화학 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다. </li></ol> 5. 표시 아미노산 데이터를 사용하여 경로 분석 잘 설계된 13 C 추적 실험에서 생산 단지 몇 주요 아미노산을 조사함으로써, 우리는 전체 중앙 대사 정교한 13 C - 신진 대사 흐름 분석을 수행하지 않고도 여러 가지 독특한 경로 또는 효소 활동을 보여줄 수 있습니다. <ol><li> Entner - Doudoroff 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린 라벨은 알라닌 10 라벨보다 훨씬 낮은 것입니다. </li><li> 분지 TCA 사이클 : [1-13 C]pyruvate는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. TCA 사이클이 깨진 경우 글루 탐 산염은 하나의 탄소 11, 12으로 표시되는 동안, aspartate는 두 탄소로 표시하실 수 있습니다. </li><li> mixotrophic 신진 대사에 캘빈 - 벤슨 - Bassham 사이클에 의해 CO 2 고정 : CO 2 비 - 표시 및 탄소 기판 라벨은 탄소 소스로 사용 둘. 캘빈 사이클이 작동하는 경우, 세린과 히스티딘 라벨이 크게 다른 아미노산으로 비교, 희석됩니다. 유기 탄소 소스 매체 13에있는 경우 이러한 방법은 상대적으로 CO 2 고정을 결정할 수 있습니다. </li><li> 산화 pentose 인산 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면이 아닌 레이블 알라닌은&gt; 50 % 12 수 있습니다. </li><li> Anaplerotic 경로 (예 : 응원 + CO 2의 oxaloacetate) : 13 CO 2와 비 표시된 탄소 기판 (예 : 글리세롤 또는 pyruvate)은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, aspartate 라벨 13 세린 알라닌 및 비교, 훨씬 풍부합니다. </li><li> 다시 구연산의 synthase : [1-13 C] pyruvate가 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 효소가 활성화되어 있으면, 글루 탐 산염은 β - 카르 복실 그룹 3, 4에 표시됩니다. </li><li> Citramalate 경로 : [1-13 C] pyruvate, [2-13 C] 글리세롤, 또는 [1-13 C] 아세테이트는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 류신 이소 류신과 라벨 금액 14 동일합니다. </li><li> 세린 - isocitrate의 lyase주기 : [1-13 C] pyruvate 또는 [1-13 C] 락트 산은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린에서 세 번째 위치 탄소는 15 표시됩니다. </li><li> 영양분의 활용 (즉, 외인성 아미노산) : 완전히 표시 탄소 기판이 아닌 레이블 아미노산과 문화 매체사용할 수 있습니다. 세포가 선택이 보충되지 않은 레이블 영양소를 활용하면, 우리는 바이오 매스에서 이러한 아미노산의 중요한 상표 희석을 볼 수 있습니다. 이 방법은 영양 보충은 세포 16 선호하는 조사하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 최근 bioenergy 연구 bioenergy 생산을위한 소설 phototrophic의 미생물을 사용하여 이익을 부흥 2 캡처를 CO있다. 중앙 신진 대사 경로의 생화 학적 지식을 잘 설립되지 않기 때문에 과거 몇 년 동안, 첨단 13C - 신진 대사 플럭스 분석 (13C - MFA)를 포함한 몇몇 13C - 대사 분석은,,, phototrophic 박테리아 중앙에 신진 대사를 조사하기 위해 적용되었습니다 이 이외의 모델 생물 10, 11, 17-20인치 여기, 우리는 Cyanothece에서 대체 이소 류신 경로의 발견 51,142 21 예제를 제시한다. 청록색이othece 51142은 전형적인 이소 류신 합성 경로에서 2 ketobutyrate로 트레오닌의 전환 catalyzes 효소 (EC 4.3.1.19, 트레오닌 암모니아 - lyase)를 포함하지 않습니다. 이소 류신 경로를 해결하기 위해, 우리는 54 MM의 글리세롤 (2 - 13C&gt; 98%)와 ASP2 중간 22 Cyanothece 51,142 (20 ML)를 성장. Cyanothece 51142은 주요 탄소 소스로 분류 글리세롤 2 차 위치를 사용합니다. 우리는 이소 류신 세 탄소와 함께 표시되는 동안 트레오닌과 알라닌 하나가 탄소 라벨이 있는지 관찰합니다. 따라서, Cyanothece 51142의 합성은 대부분의 생물 (그림 4)에 의해 고용 트레오닌 경로에서 파생 수 없습니다. 한편, 류신과 이소 류신이 단편을 기반으로 동일한 상표 패턴을 가지고 (M - 15) +와 조각 (M - 159) +. 예를 들어,에서 isotopomer 데이터 [이 M - 15] +이 (조각 화되지 않은 아미노산을 포함하는) 류신에 대해 동일한 상표 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.21, M3 = 0을 표시0.69) 및 이소 류신 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.24, M3 = 0.67). 따라서 류신과 이소 류신은 같은 엽 성의 전구 물질 (즉, pyruvate 및 아세틸 - COA)에서 합성되어야합니다. 이 관찰 이소 류신 합성에 대한 citramalate 경로에 표시된 탄소 전환과 일치합니다. 이 경로를 확인하려면, 우리는 공동 게놈 연구소의 데이터베이스를 검색하고 Cyanothece에 citramalate synthase CIMA (cce_0248)의 존재를 찾으십시오. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 13 C를 이용한 경로 분석 단계를 반복합니다. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 자신의 신진 대사 엽 성의 전구 물질의 라벨 패턴을 습득에 사용되는 아미노산. ACoA, 아세틸 - COA, AKG, α - Ketoglutarate, C5P, 리보 오스 5 - 인산, CIT, 구연산, E4P, erythrose 4 인, G6P, 포도당 6 인산, OAA,<html> oxaloacetate, 격려, phosphoenolpyruvate, PGA, 3 phosphoglycerate, PYR, pyruvate. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 16 아미노산에 대한 GC의 봉우리. TBDMS derivatized 아미노산은 두 조각으로 MS에 의해 금이 다음과 같습니다 (M - 57) +, 전체 아미노산을 포함하고, (M - 159) +, 어떤 아미노산의 α 카르 복실 그룹을 부족합니다. 류신과 이소 류신에 대한 (M - 57) +은 다른 대량 봉우리에 의해 overlapped했다. 우리는 전체 아미노산 라벨을 분석 조각 (M - 15) + 사용하는 것이 좋습니다. (f302) + 그룹은 아미노산 백본에서 첫 번째 (α - 카르 복실 그룹)와 두 번째 탄소를 포함하는 대부분의 아미노산에 감지됩니다. 이 MS 피크가 자주 높은 잡음 대 신호 비율을 가지고 있기 때문에 (f302) + 것은 양적 신진 대사 fluxes 7 ​​분석하지 않는 것이 좋습니다. igure 4 &quot;/&gt; 그림 4. Cyanothece 51,142 (우리의 이전 논문에서 수정) 21 이소 류신 경로로 전환 레이블.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 표시 기판으로 세포를 먹이 및 GC - MS를 통해 아미노산의 결과 isotopic 라벨 패턴을 측정 구성되어 있습니다. MS 데이터 (M / Z 비율)는 MS 이온의 라벨의 단지 전체 금액을주고 있기 때문에, 우리는 M / Z 두 조각 화되지 않은 (M - 57) +의 비율과 조각 아미노산을 조사하여 아미노산의 isotopomer의 배포판을 평가해야 (즉, (M - 159) +과 (f302) +). 또한, 우리는 화학적으로 동일한 매체하지만 다른 라벨 패턴 (분류 1 일 위치, 라벨 2 차 위치 등)이 기판 여러 셀 문화를 수행할 수 있습니다. 이 실험에서 metabolites에 대한 레이블 정보는 중앙 신진 대사 경로를 통해 실제 탄소 전이 경로를 디코딩 통합될 수 있습니다. 경로 분석을 위해, 레이블 기판의 선택이 중요합니다. 일반적으로 단독으로 표시된 탄소 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 19,915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 34,865 </td><td> - </td></tr><tr><td> 표시된 탄소 기판 </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구소 </td><td> 실험 요구 사항에 따라 달라집니다 </td><td> 웹사이트 : <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> 기체 크로마토 그래프 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 휴렛 팩커드, 모델 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC 열 </td><td> J &amp; W 과학, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> 질량 분석계 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti - Vap Evaporator </td><td> 써모 과학 </td><td> TS - 18825 </td><td> 아미노산 샘플을 건조 </td></tr></tbody></table>

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supproteinogenic 아미노산> c - 라벨링

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

미생물이 생화학 및 기능 유전체학 방법을 사용하여 조사 수있는 복잡한 신진 대사 경로를했습니다. 셀 중앙 신진 대사를 검토하고 새로운 효소를 발견하는 한 가지 중요한 기술은 13 C를 이용한 대사 분석 1입니다. 이 기술은 미생물이 13 C 라벨 기판과 먹이 아르 의하여 isotopic 라벨에 따라 달라집니다. 생화학 네트워크의 metabolites 사이의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 우리는 기능 경로를 결정하고 새로운 효소를 발견하실 수 있습니다. transcriptomics 및 proteomics에 대한 보완 방법, 대사 경로의 isotopomer를 이용한 분석을위한 접근 방식은 세 가지 주요 단계 2를 포함하는으로. 첫째, 13 C 표시된 기판과 세포를 성장. 이 단계에서 매체와 라벨 기판의 선택의 구성은 두 가지 핵심 요소가됩니다. 영양 보충제가 아닌 레이블 탄소의 측정 잡음을 방지하려면, 단독 탄소 소스와 최소한의 매체가 필요합니다. 또한, 레이블 기판의 선택은 그것이 분석되는 경로를 명료하게하다하는 방법을 효과적으로 기반으로합니다. 소설 효소는 종종 일반적인 다른 반응 입체 또는 중간 제품을 포함하기 때문에 단독으로 표시된 탄소 기판이 소설 경로 3, 4의 검출에 대한 균일하게 표시된 것보다 소설 경로의 탐지에 대한 더 정보를 제공하고 있습니다. 둘째, 우리는 GC를 사용하여 아미노산 라벨 패턴을 분석 - MS. 아미노산은 단백질이 풍부하고 따라서 바이오 매스 가수 분해로부터 얻을 수 있습니다. 아미노산은 GC 분리하기 전에 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS)에 의해 derivati​​zed 수 있습니다. TBDMS derivati​​zed 아미노산은 MS와 조각의 다양한 배열의 결과에 의해 조각난 수 있습니다. 조각과 조각 화되지 않은 아미노산의 요금 (M / Z) 비율 질량에 따라, 우리가 중앙 metabolites의 가능한 표시 패턴을 추론할 수아미노산의 엽 성의 전구 물질. 셋째, 우리는이 경로가 활성 2아르 여부를 확인 isotopomer 데이터를 기반으로 제안된 경로의 13C 탄소 전환을 추적합니다. 아미노산의 측정은 중앙 신진 대사에 8 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공합니다. 이러한 대사 주요 노드는 관련 중앙 통로의 기능을 반영하실 수 있습니다. proteinogenic 아미노산을 통해 13 C를 이용한 대사 분석 널리 저조한 특징 미생물 대사 1 특성화 기능에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 새로운 효소 기능을 발견하기위한 표시된 탄소 기판의 사용을 설명하기 위해 모델 변형으로 Cyanothece 51142을 사용합니다.

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

미생물은 생화학 및 기능 유전체학 방법을 통해 조사할 수 있는 복잡한 대사 경로를 가지고 있습니다. ...을 검토하기 위한 한 가지 중요한 기술은...

본 프로토콜의 목적은 탄소 13 보조 대사 분석을 통해 박테리아의 대사를 연구하는 것입니다. 우선, 표지된 탄소 기질이 존재하는 환경에서 미생물을 배양하며, 이 기질은 미생물의 단백질에 통합됩니다. 이후 미생물을 수확하여 아미노산을 추출하고, 가수분해 및 유도체화 과정을 거칩니다.시료를 가스 크로마토그래피 질량 분석기(GCMS)에 적용합니다. 생화학 네트워크 내 대사산물 간의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 미생물이 이용하는 기능적 대사 경로를 결정할 수 있습니다. 저는 Bert Burla입니다.여기에서 제시하는 방법은 미생물의 대사 경로를 결정하기 위해 전사체학 및 단백질체학을 보완하는 수단으로 사용될 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 시아노박테리아와 같은 광합성 미생물의 마이오트로픽(myotrophic) 또는 종속영양 탄소 이용 능력을 조사해 왔습니다. 본 영상에서는 표지된 탄소 기질을 사용하여 새로운 효소 기능을 발견하는 과정을 시연하기 위해 ANOTHE 5 1 1 42를 모델 균주로 사용할 것입니다.본 절차의 시연은 저와 li Yu, 그리고 Chu Yang Fang이 진행하겠습니다. 먼저 표시되지 않은 배지에서 cyana thesei 박테리아를 배양하여 이 절차를 시작하십시오. 박테리아가 대수 성장기의 중간 단계에 도달하면, 탄소 13 표지 배지에 부피 대비 3%를 접종하십시오.그 다음, 초기 접종 배양액으로부터 표시되지 않은 탄소가 대수 성장기 중간 단계의 동일한 표시 배지로 유입되는 것을 방지해야 합니다. 13C로 표시된 Cy Thesei 박테리아가 대수 성장기 중간 단계에 도달하면, 원심분리를 통해 10 milliliters를 수확합니다. 침전물을 1.5 milliliters의 6 M 염산에 재현탁하여 투명한 유리 스크류 캡 가스 크로마토그래피 또는 GC 바이알로 옮깁니다.바이알의 캡을 닫고 100 °C 오븐에 24시간 동안 넣어 바이오매스 단백질을 아미노산으로 가수분해합니다. 바이오매스 펠렛의 가수분해를 통해 20가지 일반 아미노산 중 16가지가 생성됩니다. 가수분해 후, 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 20,000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 가수분해 후, 고체 입자를 침전시키기 위해 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 20,000 GS에서 5분 동안 원심분리합니다.원심 분리 후, 가수분해 용액 내의 고체 입자가 GC 컬럼으로 유입되지 않도록 상층액을 새로운 GC 바이알로 옮깁니다. 다음으로, 가스 크로마토그래피 분리가 가능하도록 아미노산을 휘발성 형태로 유도하기 위해 건조합니다. 건조된 시료를 150 µL의 테트라하이드로퓨란(THF)과 150 µL의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아마이드(MSTFA)에 녹입니다.Acetamide, T-B-D-M-S 유도체화 시약을 넣고 모든 시료를 65~80°C 오븐에서 1시간 동안 배양합니다. 바이알 내의 대사물이 완전히 용해되도록 가끔씩 볼텍싱합니다. 시료를 20,000 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새 GC 바이알로 옮깁니다.상층액은 투명한 노란색 용액이어야 합니다. GC 온도는 다음과 같이 설정합니다. 150 °C에서 2분 동안 유지합니다. 이후 분당 3 °C씩 280 °C까지 승온합니다.분당 20 °C의 속도로 300 °C까지 온도를 높인 후 5분 동안 유지합니다. 그런 다음 30 m GC 컬럼의 경우, 용매 지연 시간(solvent delay)을 약 5분으로 설정하고 질량 대 전하비(mass to charge ratio) 범위를 60에서 500 사이로 설정합니다. 분석 조건은 분석법에 따라 분할비(split ratio) 1:5 또는 1:10, 주입 부피 1 µL, 운반 가스로 1.2 mL/min의 헬륨을 사용하여 GC-MS로 시료를 분석합니다.Microsoft Excel을 사용하여 GCMS 데이터를 분석합니다. 각 아미노산의 GC 머무름 시간과 고유한 질량 대 전하비 피크가 이 그림에 예시되어 있습니다.T-B-D-M-S. 유도체화된 아미노산은 일반적으로 MS에 의해 두 개의 전하 파편으로 명확하게 분리되는데, 이는 아미노산 전체를 포함하는 M minus 57 파편과 류신 및 이소류신의 아미노산 알파 카복실기가 결여된 M minus 1 59 파편입니다.M-57 피크는 다른 질량 피크 파편과 겹쳐 있었습니다. N-15는 전체 아미노산 표지를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, F 3 0 2 그룹은 대부분의 아미노산에서 자주 검출되며, 이는 아미노산 골격의 첫 번째 알파 카복실기(alpha carboxyl group)와 두 번째 탄소만을 포함합니다.하지만 이러한 Ms.Peak는 신호 대 잡음비가 높은 경우가 많으므로, F 3 0 2를 정량적인 대사 플럭스 분석에 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 아미노산이나 중심 대사산물의 유도체화 과정에서 carbon 13, oxygen 18, silicon 29 및 silicon 30을 포함하여 천연적으로 표지된 다량의 동위원소가 유입됩니다. 가공되지 않은 질량 동위원소 또는 스펙트럼 내 천연 동위원소로 인한 측정 노이즈는 공개된 소프트웨어를 사용하여 보정할 수 있습니다.최종 동위원소 표지 데이터는 질량 분율로 보고됩니다. 예를 들어, M0, M1, M2, M3 및 M4는 0개에서 4개의 $^{13}\text{C}$ 표지 탄소를 포함하는 조각을 나타냅니다. 이 5 1 1 2에는 일반적인 isle 합성 경로에서 three anine을 two keto butyrate로 전환시키는 효소인 three anine ammonia lyase가 포함되어 있지 않습니다.따라서 이 생물체에서 isle 경로를 규명하기 위해, cyana THESEI 5 1 1 42를 54 millimolar 글리세롤이 포함된 ASP two 배지에서 배양하고 여기에 제시된 비디오의 설명대로 GCMS를 통해 분석하였습니다. Cyana Thesei 5 1 1 4 2는 2번 위치가 표지된 글리세롤을 주요 탄소원으로 사용하며, 전구체가 pyruvate인 thianine과 alanine은 하나의 표지된 탄소를 가지는 반면 ISO leucine은 세 개의 탄소가 표지되었음을 관찰하였습니다. 그러므로 cyana these 5 1 1 4 2의 synthesis는 대부분의 생물체가 사용하는 thianine 경로에서 유도될 수 없습니다. 반면, leucine과 ISO leucine은 fragment M minus 15 및 fragment M minus 1 59를 기반으로 동일한 표지 패턴을 보입니다.예를 들어, 분절되지 않은 아미노산을 포함하는 $^{15}\text{N}$ 동위원소 또는 데이터에서 류신(leucine)과 이소류신(isoleucine)의 표지가 동일하게 나타났습니다. 따라서 류신과 이소류신은 동일한 전구체인 피루브산(pyruvate)과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로부터 합성되어야 합니다. 이러한 관찰 결과는 이소류신 합성을 위한 시트르산-말산 경로(citramalate pathway)의 표지 탄소 전이와 일치합니다.이 방법은 매우 다양한 미생물의 대사를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 숙달되면 시작부터 종료까지 약 일주일 만에 수행할 수 있습니다.

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연구

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생물학

채용 안정 동위 원소 라벨 작업...

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

생화학 적 경로에 관여하는 효소 활성의 유효성 기능성 상보성 분석 (FCA)를 사용하여 설명 될 수있다. 아미노산, 세균 엄격한 반응 세균 펩티도 글리 칸의 생합성의 대사에 관여하는 효소의 효소 활성을 보여주는 FCA 분석이 논문에 설명한다.

기능 보완 분석 (FCA) : 설계 및 생화학 적 경로의 교육을 보완하기 위해 구현 된 실험실 운동

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.

질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.

13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

함께 비디오 GELFREE 8100 분획화 시스템의 사용, 분자량을 기준으로 파티션 복잡한 단백질 샘플을 설명하고 액상에있는 분수를 복구합니다. 비디오 기술이 사용 방법, 작동 및 fractionated 소 간 homogenate의 polyacrylamide 젤 전기 영동 분석, 결과 데이터를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

배우세요 탄소-13 동위원소 표지를 이용한 세균 대사 경로 분석 방법입니다. GC-MS로 아미노산을 분석하여 미생물의 생화학적 네트워크를 추적하고 기능적 대사 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색^{13 C - 라벨링}

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