Name: 활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 활액 유체를 이용한 3D 배양 시스템으로 인간 관절 연골세포를 장기간 배양하는 방법입니다. 이 기술은 연골 재생 및 관절염 치료제 선별 연구에 활용될 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 활액 유체 저장 및 원심 분리와 도움을 제공하는 로빈 Nye (Tufts 의료 센터), Tomoya Uchimura와 다나 케언즈 (Tufts 대학)을 감사드립니다. 이 작품은 출발지에 대한 NIH (1R01AR059106 - 01A1)에 의해 추진하는 사업

활액 액체에 culturing 인간의 관절 chondrocytes을위한 3D 시스템 이 작품에서 우리는 수정된 제조 - 제안 캡슐화 프로토콜 (Lonza, 31)를 사용 알지네이트요 비즈 인간의 관절 chondrocytes를 캡슐. 이러한 3 차원 구조를 사용하여, 우리는 인간 활액 액체의 다양한 비율을 포함하는 문화 매체 culturing 전지 시스템을 개발 및 연골의 유전자 발현에 대해 이러한 3D 구조를 평가했습니다. 1. 입체 (3D) 캡슐에 대한 인간의 관절 chondrocytes (HAC)를 준비 <ol><li> 37 일 분 ° C의 물을 욕조에 인간의 관절 chondrocytes (HAC) (Lonza) (항로 2) 유리병 (1 ML)을 녹여. </li><li> chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)와 세포를 수집하는 3-5 분 3,000 rpm으로 원심 분리기의 1ml와 함께 섞는다. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> chondrocyte 성장 미디어 Resuspend 세포 펠렛 (Lonza). </li><li> 10cm 조직의 플레이트 세포문화 플레이트 (BD Biosciences) 및 chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)의 문화가 세포가 합류 때까지. HACs없이 높은 세 이상 또는 4 (P3 또는 P4) 통로 번호를 사용해야합니다. </li><li> 알지네이트요 비드 캡슐에 대한 세포를 수집하는 trypsinzation 다음 155mM NaCl 대신 표준 PBS와 함께 접시에 HACs 씻으십시오. 일단 세포가 분리되며, 5 분에 대한 3000rpm에서 세포를 다운 스핀. 세포는 이제 3D 캡슐에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 3D 구슬로 HACs를 캡슐 8x10 5 셀 / ML의 밀도에 1.2 % 알지네이트요 솔루션 (시그마)의 HACs을 Resuspend. 휴대폰 번호는 표준 셀 카운터를 사용하기 전에 캡슐로 결정됩니다. 그것은 구슬에있는 세포의 균등을 보장하기 위해 잘 혼합하는 것은 매우 중요합니다. <ol><li> 피펫 22 게이지 바늘 (Tyco 의료, 주식 회사)에 연결된 12 ML 주사기로 HAC / 알긴산 솔루션 혼합물. </li><li> 한편, 102m와 50 ML의 비커를 준비볼륨에서 M CaCl 2 5 회 HAC / aginate 솔루션의. 비커 안에 저어 막대를 놓고 (약 150 RPM에서) 천천히 102 MM CaCl 2 용액을 저어. </li><li> CaCl 2 용액의 표면 위에 육인치에 대한 주사기의 끝부분을 잡고 CaCl 2 솔루션 dropwise로 HAC / 알긴산 혼합물을 추가합니다. 일반적으로 결과 알지네이트요 비즈는 약 10 4 세포 / 비드의 캡슐 밀도와 직경 2mm입니다. 참고 : CaCl 2 용액을 통해 주사기의 높이는 중요합니다. 짧은 거리는 고르지 않은 기계적 무결성과 세포를 캡슐 화 원인, 원형 모양의 구슬 대신 모양의 눈물 드롭집니다. </li><li> 비즈가 20-25 분 CaCl 2 용액에서 저어 보자. 다른 알지네이트요의 캡슐화 프로토콜은 10 분 정도의 짧은 배양 시간을 나타내는 반면, 우리는 CaCl 2 용액과 함께 더 이상 부화 시간이 될의 무결성을 향상 발견광고. </li><li> CaCl 2 용액을 제거 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 한 다음 2-3 번 NaCl로부터 2-3 권에 비즈를 씻어합니다. 다른 알지네이트요 비드 캡슐 프로토콜은 위의 세탁 절차 필터를 사용하여 포함하는 동안, 우리는 알지네이트요 비즈가 종종 따라서 캡슐의 효율성을 감소, 필터 및 드라이 아웃에 갇혀되고있는 것으로 나타났습니다. 우리는 가장 효율적인 비즈가 폐기되기 전에 비커의 바닥에 대한 해결책을 해결하도록 발견했습니다. </li><li> 문화 요리에 비즈를 전송하는 표준 주걱을 사용합니다. 우리는 일반적으로 문화를 잘 chondrocyte 성장 매체 2 일간 3cm 당 12 구슬을 chondrocytes들이 전에 활액 액체와 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 스위칭 성장 있던 매체 캡슐 프로세스 조정할 수 있습니다. </li></ol> 3. 활액 유체 문화 매체 문화 chondrocytes <ol><li> 신선한 활액 액체는 O에서 구할 수 있습니다utpatient 클리닉 (우리는 Tufts 의료 센터에서 활액 액체를 취득). 활액 액체는 실험실로 15ml 팔콘 튜브에 전송하고, 즉시 세포 파편을 제거하는 15을 위해 3000 RPM에서 centrifuged 수 있습니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는는 세포 무료 활액 액체, 동결 - 해동 반복되지 않도록합니다. 뜨는는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 이전 culturing하기 위해 지속적인 100mM 아스코르비 산의 농도와 9 밀리 CaCl 2 (CaCl 2의이 추적 금액 알지네이트요의 무결성을 보장하는 것입니다과 체적 비율을 변화시 chondrocyte 차별화 매체와 활액 유체 (CDM, Lonza)를 혼합 구슬). </li><li> 37 ° C 배양기에서 락을 플랫폼에서 번호판을 유지 (출렁 이는 주파수 : 약 75 회 / 분) 알지네이트요 비즈 내에서 영양 배포를 도와, 그리고 구슬의 clumping 줄일 수 있습니다. 이것은 장시간 (최대 4 주)에 대한 우리 문화의 이러한 chondrocytes와 같이 특히 중요합니다. 주의: chondrocyte 성장과 차별화 미디어 (Lonza는) 2 일반적으로 사용되는 항생제 gentamycin과 amphotericin를 포함하는 동안 우리는 chondrocyte culturing에 대한 활액 액체의 다른 비율을 사용할 때, 우리는 어떤 항생제를 보충하지 않았다. 오염이도 관찰되지 않았습니다. </li><li> 모든 2-3일 미디어 혼합물을 변경합니다. 활액 유체의 점도는 장기적인 문화 중 알지네이트요 비즈에서 캡슐 culturing의 chondrocytes의 주요 장애물이었다. 우리는 또한 알지네이트요 비즈의 무결성을 강화 102mM CaCl 2 (50 % V / V)와 활액 유체 - 보충 미디어를 희석하는 것이 가장 효과적인 발견했습니다. 이러한 방법으로, 매체는 천천히 구슬을 손상시키지 않고, pipet로 제거할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유전자 발현 분석을위한 알지네이트요 비즈에서 수확 HACs 유전자 발현 분석을위한 알지네이트요 비즈에서 HACs을 수확 때 특별한주의가 있어야합니다. <ol><li> 알지네이트요 비즈 - 3 TI 씻으십시오약 5 분 때마다 102 MM CaCl 2 대. </li><li> 4-5 번 그 구슬의 볼륨에서 55 밀리미터의 NaCitrate을 추가하여 chondrocytes를 검색하십시오. 알지네이트요 비즈가 완전히 NaCitrate 솔루션에 열중하는 것이 중요합니다. 흔들거나 20-30 분 바위. </li><li> 세포를 돌려서 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RT - PCR 분석을 위해, 세포 세포 용해 버퍼의 펠릿 (Qiagen RNA 격리 키트) 및 RNA 정화 진행을 resuspend. </li></ol> 5. histological 분석을 위해 알지네이트요 비즈에서 HACs을 수정 특별한주의가 histological 분석을위한 3D 비즈에서 HACs을 수확하기 위해주의가 필요하다. <ol><li> 5 분 약 때마다 102 MM CaCl 2의 알지네이트요 비즈에게 3 번 씻으십시오. 완전히 점성 유체 활액을 멀리 세척하기 위해, 우리는 37 ° C 배양기 (출렁 이는 주파수에 락을, 야간 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)로 세척하는 것이 가장 효과적인 발견 : 약 75 시간S / 분). chondrocyte 성장 매체는이 연장 씻어에서 chondrocyte 생존을 보장하고 고정 에이전트의 최대 침투를 허용하는 데 사용되었다. </li><li> 야간 70 % 에탄올에 비즈를 수정하고, histological 분석 진행합니다. Dapi의 얼룩을 수행하려면, 부드러운 락을 미만 1 시간에 대한 Dapi 솔루션 (500ng/ml)와 알지네이트요 비즈를 품어, 15 분 102mM CaCl 2 때마다 3 번 씻는다. Dapi 이미지는 다음 형광 현미경으로 볼 수 있습니다. 구슬은 alcian 파란색과 H &amp; E의 얼룩에 대한 sectioned 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 활액 액체의 높은 비율 인간의 chondrocytes위한 3D culturing 방법은 Fig.1에 표시된 설계도 다이어그램에 그려져 있습니다. 인간 chondrocytes가 알지네이트요 비즈에서 캡슐 후에, 그들은 활액 액체의 비율을 변화와 보완 매체 성장할 수있었습니다. 때문에 활액 유체의 점도, 그것은하는 것이 필수적입니다문화 chondrocytes는 지속적인 락을 조건 아래에있는 연골 구조의 clumping을 방지하고 영양도 배포를 보장합니다. 이것은 고정 또는 용해 버퍼 (Fig.1) 비즈 침투 수 있도록 chondrocytes을 검색하기 전에 광범위하게 알지네이트요 비즈를 씻어도 필수적입니다. 알지네이트요 비즈의 chondrocytes의 명시야 (BF) 이미지 Fig.2에 표시됩니다. Dapi의 얼룩은 비즈 내에서 세포의 usniform 분포 (그림 2) 확인 수행되었다. 21 일 문화 기간의 끝에, 유전자 표현 분석 qRT - PCR에 의해 수행되었다. 그것이 chondrocytes 32 qPCR 분석을위한 가장 안정적인 레퍼런스 유전자 중 하나가 될하기로 결정했습니다로서 참조 유전자 GAPDH는 모든 PCRs에 대한 정상화를 위해 사용되었다. 예제는 그림에 표시됩니다. 우리가 관절염 여섯 환자에서 풀링된 활액 액체의 교양 인간의 관절 chondrocytes에서 결과를 분석 3. 사실과 일치와는 chondrocytesLonza는 불가피하게 취소 분화 33 이어질 것이 2D 문화에서 확장되었습니다, 우리는 그런 일 0 chondrocytes는 연골 매트릭스 유전자의 최소한의 수준 (그림 3) 표현 발견했습니다. 활액 액체로 보충 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)이나 매체 chondrocytes의 3D culturing 크게 날 21 일 (Fig.3) 34에 의해 다시 차별 chondrocyte을 나타냅니다 콜라겐, aggrecan 및 MMP13의 연골의 유전자 발현을 증가시켰습니다. 미디어의 활액 액체의 비율을 증가 시키면 연골 매트릭스 마커 콜라겐 II ​​및 aggrecan의 mRNA 발현 (Fig.3A 및 3B)의 비교 수준의 결과. 중간 혼자 (Fig.3C)에서 교양 이들과 비교뿐만 아니라, 100 % 활액 액체의 양식 chondrocytes도 연골 저하 효소 MMP13 mRNA 표현의 감소를 전시. 흥미롭게도, 세포 죽음이 표시 caspase 3의 표현 수준은 점차 제안, 활액 액체의 비율 증가와 함께 감소되는의ynovial 유체 culturing 감소 apoptosis 수준 (그림 3D)으로되었다. 따라서, 우리의 결과는 3D 환경에서 활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes이 가능한 기술입니다 보여줍니다. 테이블과 피규어 <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> 그림 1. 3D 알지네이트요 비즈의 활액 액체의 높은 비율의 문화 인간의 관절 chondrocytes에 대한 방법의 도식 다이어그램. 첫째, chondrocytes 및 알지네이트요 솔루션은 혼합 수 있습니다. CaCl 2 솔루션 드롭 현명 적용하면, chondrocytes는 가교 CA - 알지네이트요의 히드로겔 비즈 내에서 움직일 수 있습니다. 이러한 3D 구조는 다음 인간 활액 액체의 비율을 변화와 chondrocyte 차별화 매체 (Lonza)에 양식이 있습니다. 락을 조건 culturing 21 일 후에 세포를 포함하는 알지네이트요 비즈는 세포가 유전자에 대한 검색되는 이후에 광범위하게 씻어 아르표현 분석. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> 그림 2. 브라이트 필드 (BF)와 인간의 관절 chondrocytes의 Dapi 이미지 0퍼센트, 30 %, 50 %, 70 % 및 100 % 활액 액체와 캡슐 문화. Chondrocytes 모든 문화 조건에서 모양 구형했다. 명시야 (BF)와 Dapi의 이미지는 chondrocytes의 위치와 분포를 확인하기 위해 입혔다했다. Insets, 확대 이미지를 표시합니다. 화살촉, BF와 Dapi의 얼룩 이미지의 chondrocytes의 colocalization. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> 그림 3. 하루 캡슐 인간의 관절 chondrocytes의 qRT - PCR 분석 0 (D0) 활액 액체 (SF) (0 %, 30 %, 50 %, 70 다양한 비율로 보충 매체 culturing (D21) 21 일 후에 % 및 100 %). 네 독립 표본의 결과는 여기에 표시됩니다. GAPDH는 모든 PCRs에 대한 내부 참조로 사용되었다. <str긴 사연이&gt;. 콜라겐 II의 mRNA의 표현. B. Aggrecan의 mRNA의 표현. C. MMP13 mRNA의 표현. D. Caspase 3 mRNA의 표현. 통계 중요성은 일 0 샘플과 0 %의 주 21 샘플 및 INSTAT 소프트웨어를 사용 백퍼센트 활액 액체 (SF) culturing를 평가했다. * 나타냅니다 P &lt;0.05.

<ol><li>Centers for Disease Control and P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+state-specific+increases+in+self-reported+doctor-diagnosed+arthritis+and+arthritis-attributable+activity+limitations--United+States%2C+2005-2030%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).</li>
<li>Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+correlates+of+arthritis-attributable+work+limitation+in+the+US+population+among+persons+ages+18-64%3A+2002+National+Health+Interview+Survey+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data.</a> Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage tissue.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).</li>
<li>Glowacki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+engineering+of+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro engineering of cartilage.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).</li>
<li>Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-In+vitro+Effects+of+Compression+and+Time+in+Culture+on+Aggregate+Modulus+and+on+Gene+Expression+and+Protein+content+of+Collagen+Type+II+in+Murine+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. , (2009).</li>
<li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering%3A+the+role+of+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering: the role of biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li>
<li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).</li>
<li>Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+in+chronic+inflammatory+synovitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Rheumatol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cytokines in chronic inflammatory synovitis.</a> Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).</li>
<li>Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secreted+glycoprotein+lubricin+protects+cartilage+surfaces+and+inhibits+synovial+cell+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth.</a> J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).</li>
<li>Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+reduces+inflammation+in+experimental+arthritis+by+modulating+TLR-2+and+TLR-4+cartilage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2011).</li>
<li>van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Biorheology. 37, 45-55 (2000).</li>
<li>Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+arthritic+synovial+fluid+influences+proteoglycan+biosynthesis+and+degradation+in+organ+culture+of+bovine+nasal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage.</a> Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).</li>
<li>Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+normal+synovial+fluid+on+the+metabolism+of+articular+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+nonresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor+1+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis.</a> Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+stimulation+of+chondrocyte+proteoglycan+synthesis+by+human+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid.</a> Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).</li>
<li>Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+unresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor-1.+A+novel+pathogenetic+mechanisms+for+cartilage+destruction+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis.</a> Agents Actions. 26, 193-195 (1989).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+and+peripheral+blood+immune+complexes+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+induce+apoptosis+in+cytokine-activated+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol.+Int%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes.</a> Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).</li>
<li>Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).</li>
<li>Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+normal+articular+cartilage+induced+by+late+phase+osteoarthritic+synovial+fluid+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs.</a> Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).</li>
<li>Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+subchondral+progenitor+cells+is+impaired+by+rheumatoid+arthritis+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid.</a> J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+culture+system%3A+Synovial+fibroblasts+modulate+articular+chondrocyte+matrix+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro.</a> Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).</li>
<li>Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+synovial+fluid+from+injured+knee+joints+on+in+vitro+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis.</a> Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).</li>
<li>Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+growth+factors+and+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+perichondrium%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Plast.+Reconstr.+Surg.+Hand.+Surg.%22%5BJournal%5D)">The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium.</a> Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).</li>
<li>Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+synovial+fluid+and+synovial+fluid+cells+on+chondrocyte+metabolism+in+short+term+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture.</a> J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).</li>
<li>Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+tissue+inhibits+proteoglycan+production+in+human+osteoarthritic+cartilage%3B+Establishment+and+characterisation+of+a+long-term+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture.</a> Arthritis Rheum. , (2011).</li>
<li>Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+knee+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Knee.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro.</a> Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).</li>
<li>van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).</li>
<li>Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+fluid+and+synovium+supernatants+up-regulate+tumor+necrosis+factor+receptors+on+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).</li>
<li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li>
<li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Eukaryot.+Gene.+Expr%22%5BJournal%5D)">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li>
<li>Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+growth+characteristics+of+chondrocytes+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads.</a> Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).</li>
<li>Toegel, S., Huang, W., Piana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+qPCR+studies+on+chondroprotective+action%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action.</a> BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).</li>
<li>Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+human+chondrocytes+during+passaged+monolayer+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation.</a> J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).</li>
<li>Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chondrocytes+differentially+express+matrix+modulators+during+in+vitro+expansion+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).</li>
<li>Anat, J. 121, 107-118 (1976).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

이 보고서에서는, 우리는 인간 활액 액체의 높은 농도를 포함 매체 3D 환경에서 인간의 관절 chondrocytes의 문화에 대해 수있는 방법을 개발했습니다. 활액 액체는 관절 chondrocytes이있는 공동 구멍에 자연 환경을 구성하는 주요 구성 요소 중 하나입니다. 그러나, 활액 유체의 점도는 chondrocytes의 세 차원 장기 culturing에 대한 큰 도전을했습니다. 3D 막아야 환경에서 구축하고 방지하기 위해 집계에서도 영양소 분포를 유지하는 도전을 극복하기 위해, 우리는 부드러운 락을 함께 지속적인 운동에 따라 연골 구조를 배치. 연골 구조의 구조적 무결성을 향상시키기 위해, 우리는 비드 형성과 미디어의 변화 과정 31 시간의 길이 최적화를 포함 알지네이트요의 히드로겔에 시딩 chondrocytes의 전통적인 절차를 수정했습니다. 때 이러한 절차는 필수입니다연골 구조는 장기적인 문화 동안 점성 유체 활액로 결제됩니다. 우리는이 방법을 우리...

특정 시약 및 장비의 테이블 : <table border="1"><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 알긴산 (Alginic 산성 나트륨 소금) </td><td> 시그마 </td><td> A2158 - 250G </td><td> 2.4 % 용액은 40 ° C에 보관 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 이수화물, 세분화된 </td><td> JT 베이커 </td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Chondrogenic 성장 미디어 </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC - 3156 (기본 미디어) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4409 (보충) </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Chondrogenic 차별화 미디어 </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC - 3226 (기본 미디어) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4408 (보충) </td></tr><tr><td> 인간 관절 chondrocytes </td><td> Lonza </td><td > CC - 2550 </td><td></td></tr><tr><td> Dapi (4 &#39;, 6 Diamidino - 2 - phenylindole의 dihydrochloride) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 (RNA 추출을위한) </td><td> Qiagen </td><td > 74,104 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 시약 : SYBR 녹색 </td><td> 콴타 </td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ML의 주사기 </td><td> Tyco - 켄달 - Monoject </td><td > 512,852 </td><td></td></tr><tr><td> 22 - Gague의 피하 니들 </td><td> Tyco - 켄더나 - Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 플랫폼 로커 </td><td> Thermoscientific thermolyne </td><td > Vari - 믹스 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Primers 시퀀스 </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 IIa - 앞으로 </td><td> 5&#39; - TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 IIa - 역방향 </td><td> 5&#39; - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 - 앞으로 </td><td> 5&#39; - TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 - 역방향 </td><td> 5&#39; - AGA AGC 개그 CTT TGA GTC AT &amp; T GCC - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3 - 앞으로 </td><td> 5&#39; - TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3 역 </td><td> 5&#39; - TGG ATG AAC 편대의 편대 장의 개그 CCA TCC TTT의 -3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr></table>

활액 유체에 culturing 인간 관절 chondrocytes을위한 3d 시스템

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

연골 파괴는 관절염의 중심 병적인 기능, 미국에서 장애의 주요 원인이다. 성인의 연골은 생체내 매우 효과적으로 재생되지 않으며, 그 결과로 관절염은 연골 손실을 돌이킬에 이르게하고 만성 통증과 부동의 1,2와 함께합니다. 연골 조직 공학 조직 기능을 재생 및 복원하기 위해 유망한 가능성을 제공합니다. 이 기술은 일반적으로 결과 3D 엔지니어링의 목표 생체내 3-6 결함 사이트에 이식 수 화학적 및 biomechanically 성숙한 조직과 일정 기간 동안 균형 매체 만드는 천연 또는 합성 공사장 공중 발판과 culturing에 시딩 chondrocytes을 포함 . chondrocyte 성장과 매트릭스 증착을위한 최적의 조건을 달성하면 연골 조직 공학의 성공을 위해 필수적입니다. 북극의 원시 공동 캐비티, 연골에뼈 ular 표면은 활액 액체에서 목욕을합니다. 이 명확하고 점성 유체의 avascular 관절 연골에 영양분을 제공하고 성장 요인, 크린 시토킨 및 chondrocyte 신진 대사를 7,8에 대한 중요한 효소가 포함되어 있습니다. 또한, 활액 액체는 주로 secreting 두 가지 핵심 구성 요소, hyaluronan과 lubricin 9 10를 통해 연골 표면 사이의 낮은 마찰 운동을 용이하게합니다. 반면, 조직 공학 연골은 가장 자주 인공 미디어 양식입니다. 이러한 미디어 가능성이 chondrocyte 신진 대사를 공부에 대한 더 정의된 조건을 제공할 수 있지만, 활액 액체는 대부분 정확하게 관절 chondrocytes 안으로 거주하는 자연 환경을 반영 사실, 활액 액체가 얻고 저장하기 위해 쉽게되는 장점을 가지고 있으며, 자주 정기적으로 기관 보충함 수 있습니다. 몇몇 그룹은 성장 인간, 소, 토끼 및 개 C에서 활액 액체와 문화 매체를 보충해야hondrocytes하지만, 대부분의 활액 액체 (아래 20 %) 11-25 만 낮은 수준을 사용합니다. 닭, 말과 인간 chondrocytes는 활액 액체의 높은 비율과 매체 교양되었습니다 있지만, 이러한 문화 시스템은 2 차원 26-28되었습니다. 여기는 21 일 기간 동안 활액 액체의 높은 비율 (최대 100 %)과 3D 시스템에 culturing 인간의 관절 chondrocytes 우리의 방법을 제시한다. 이렇게, 우리는 활액 액체의 높은 점도로 표시 주요 장애물을 극복. 이 시스템은 더 이상을위한 자연 환경을 모방하는 연골에 대한 자연 환경을 구성하는 두 개의 다른 중요한 요소 (산소 긴장과 기계적 부하) 29,30와 함께 할 수있는 3D 설정에서 활액 액체 인간의 chondrocytes 공부의 가능성을 제공합니다 연골 성장. 또한,이 시스템은 또한 활액 chondrocytes에서 유체의 활동을 시금 사용 및 개발을위한 플랫폼을 제공 수 있습니다연골 재생 기술과 관절염에 대한 치료 옵션을 제공합니다.

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

연골 파괴는 미국 내 장애의 주요 원인인 골관절염의 핵심적인 병리적 특징입니다. 성인의 연골은...

다음 실험의 전반적인 목표는 활액 내에서 인간 관절 연골 세포를 장기 배양하는 것입니다. 이를 위해 먼저 연골 세포를 알긴산 비드에 캡슐화합니다. 그 다음 연골 세포를 활액에서 배양하며, 이를 통해 연골 세포가 실제 성장 조건과 유사한 3D 환경에서 증식할 수 있도록 합니다.세포가 영양분에 충분히 접근할 수 있도록 배지를 주기적으로 교체해야 합니다. 절차의 마지막 단계는 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위해 alginate 비즈에서 연골세포를 회수하는 것입니다. 이러한 분석을 통해 alginate 비즈에서 배양된 연골세포가 생존 및 증식하며, 상당량의 연골 기질을 발현함을 확인합니다.기존 방법들과 비교하여 이 기술을 사용할 때의 주요 장점은 연골 세포를 2D가 아닌 3차원 환경에서 분석한다는 점입니다. 또한 인공 배지 대신 활액을 배지로 사용합니다. 따라서 3차원 구조물을 사용하고 활액을 이용하는 조합을 통해, 플레이트 위의 2차원 환경이나 인공 배지를 사용하는 방식보다 더 자연스러운 환경에서 세포를 분석할 수 있습니다.이 방법은 연골 생물학 및 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 연골 세포 또는 chondrocyte는 장기간 활액 내에서 어떻게 행동하는가? 또한, 숙주에 이식하기 전에 연골 세포를 활액에 적응시켜야 하는가? 등이 있습니다.인간 관절 연골세포 또는 동결 보존된 세포 1 mL 바이알을 따뜻한 물에서 1분 동안 해동하여 준비합니다. 그런 다음, 따뜻하게 데운 연골세포 성장 배지 2 mL가 들어 있는 바이알에 해동된 세포를 혼합합니다. DMSO가 포함된 동결 보존 배지를 제거하기 위해 3000 RPM에서 3~5분 동안 세포를 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후 7 mL의 연골세포 성장 배지로 세포를 재현탁합니다.다음으로, 세포를 10 centimeter 플레이트로 옮겨 세포가 합류(confluent)될 때까지 배양합니다. hACKs는 계대 배수 3회 또는 4회 이하에서 사용해야 합니다. 세포가 합류되면 PBS 대신 염화나트륨 용액으로 hACKs를 세척합니다.그 다음 0.5 mL의 표준 trypsin EDTA 용액을 사용하여 트립신 처리로 세포를 수집합니다. 세포가 떨어져 나오면 원심 분리하여 3D 캡슐화 준비를 마칩니다. 펠릿화된 세포를 파이펫으로 흡입하여 상층액을 제거한 후, mL당 800,000 cells의 밀도로 1.2% alginate 용액에 현탁합니다.이제 헉-알지네이트(hack alginate) 용액 부피의 5배에 해당하는 염화칼슘 용액을 준비하십시오. 헉-알지네이트를 준비하는 동안 용액을 천천히 계속 교반하십시오. 헉-알지네이트 용액을 22게이지 바늘이 장착된 12밀리리터 주사기에 피펫으로 옮겨 담으십시오.염화칼슘 용액이 준비되면, 주사기 팁을 염화칼슘 용액 표면에서 약 6인치 위에 유지합니다. 주사기의 높이가 중요합니다. 염화칼슘 용액은 매우 중요합니다.충분히 높게 들지 않으면 비드가 구형으로 형성되지 않습니다. 그다음 알긴산 혼합물을 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다. 일반적으로 생성된 비드의 직경은 2 mm이며, 비드당 약 10⁴개의 세포가 포함됩니다.비드의 무결성을 높이기 위해, 비드를 용액에서 20~25분 동안 교반합니다. 교반이 완료되면 비드를 가라앉힌 후 염화칼슘 용액을 데칸테이션하여 제거합니다. 다음으로, 비드 부피의 약 2~3배 되는 염화나트륨 용액으로 비드를 2~3회 세척합니다.필터를 사용하는 대신, 세척액을 교체할 때마다 비드(beads)가 가라앉도록 하여 습윤 상태를 유지하십시오. 염화칼슘 세척 후, 1회 세척하고 연골세포 분화 배지를 처리하십시오. 그다음 스패튤라를 사용하여 비드를 배양 접시로 옮기고, 연골세포 분화 배지로 바꾸기 전까지 48시간 동안 연골세포 성장 배지에서 배양하십시오.활액이 포함된 분화 배지. 활액은 채취 직후에 준비해야 합니다. 신선한 활액을 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 즉시 3000 RPM에서 15분 동안 원심분리합니다. 세포 파편을 제거한 상층액이 정제된 활액이며, 이를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 소분하여 활액의 최적 농도가 결정될 때까지 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다.일정한 농도의 ascorbic acid와 calcium chloride가 포함된 배양액을 사용하고, synovial fluid와 chondrocyte differentiation medium을 다양한 부피 비율로 혼합하여 서로 다른 배양 배지를 구성하십시오. 플레이트를 37 °C 인큐베이터 내의 rocking platform 위에 놓으십시오. 2~3일마다 기존 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체하십시오.점도를 낮추고 동시에 비드의 무결성을 강화하기 위해 이를 염화칼슘 용액으로 희석합니다. 그 후 플레이트에서 천천히 피펫으로 옮깁니다. 비드의 증식 및 매트릭스 생성 정도와 실험 목적에 따라 수확 전까지 최대 4주 동안 배양할 수 있습니다.유전자 발현 또는 조직학적 분석을 위해 알긴산 비드에서 조각들을 수확할 때, 유전자 발현 분석의 경우에는 필터를 사용하지 않고 염화칼슘 용액으로 알긴산 비드를 3회 세척하십시오. 비드 부피의 4~5배에 해당하는 시트르산나트륨에 담가 연골세포를 분리하십시오. 혼합물을 20~30분 동안 교반한 후, 15 milliliter 튜브에서 세포를 원심 분리하십시오.상층액을 제거하고 세포 펠렛을 일반 키트의 세포 용해 버퍼로 재현탁한 후, 표준화된 RNA 정제 프로토콜을 진행하여 고정을 위한 세척된 비드를 준비합니다. 염화칼슘 세척 후에는 Wash Inc. 연골 분화 배지를 사용하여 하룻밤 동안 배양합니다.비드를 70% ethanol 2 mL에 넣고 4°C에서 15분 이상 고정시킨 후, DAPI 염색을 위한 조직학적 분석을 진행합니다. alginate 비드를 DAPI 용액에 넣고 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 형광 현미경으로 alginate 비드를 관찰하기 전에 calcium chloride 용액으로 비드를 3회 세척합니다.비드는 Ian Blue 및 H&amp;E 염색을 위해 절편화할 수도 있습니다. DAPI로 염색된 알긴산 비드의 조직학적 절편을 명시야 이미지와 겹쳐 분석한 결과, 활액이 없는 배지부터 전적으로 활액 기반인 배지까지 모든 조건에서 배양된 비드 내에 세포가 균일하게 분포되어 있음을 확인하였습니다. 21일간의 배양 기간이 끝난 후, 이전 보고서들과 일치하게 골관절염 환자 6명으로부터 수집하여 활액에서 배양한 인간 관절 연골세포의 유전자 발현을 측정하였습니다. 0일 차 연골세포는 연골 기질 유전자를 최소 수준으로 발현하였습니다. 연골세포 분화 배지 또는 활액이 첨가된 배지를 이용한 연골세포의 3D 배양은 collagen two, acan 및 MMP 13의 연골 유전자 발현을 유의하게 증가시켰으며, 이는 연골세포의 재분화를 나타냅니다.21일 차에 배지 내 활액의 비율을 높인 결과, 연골 기질 마커의 수준이 유사하게 나타났습니다. 100% 활액에서 배양된 연골세포의 Collagen two 및 ADAMTS-5 mRNA 발현은 배지만으로 배양한 세포와 비교했을 때 연골 분해 효소인 MMP 13 mRNA 발현의 감소마저 보였습니다. 흥미롭게도, 세포 사멸 지표인 caspase three의 발현 수준은 활액의 비율이 증가함에 따라 점진적으로 감소하였으며, 이는 활액 배양이 세포 사멸 수준을 감소시켰음을 시사합니다.따라서 3D 환경에서 인간 관절 연골 세포를 배양하고 고농도의 활막액을 처리하는 것은 실행 가능한 기술입니다. 일단 숙련되면, 캡슐화 기술은 완료하는 데 1시간 미만이 소요될 수 있습니다. 배지를 교체할 때마다 비드를 철저히 세척해야 합니다.또한 피펫을 사용하는 동안 비드가 손상되지 않도록 주의해야 합니다.

a-3d-system-for-culturing-human-articular-chondrocytes-synovial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

이 문서에 설명 된 방법은 동시 UV 중합과 bioprinter에 상용 잉크젯 프린터로 변환하는 방법을 보여줍니다. 프린터는 세포 및 생체 재료와 3 차원 조직 구조를 구축 할 수있다. 여기에 설명이 연구는 3D neocartilage을 건설했다.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

우리는 인간 무릎 관절의 연골, 뼈, 지방 패드 및 활막을 재현하는 데 사용되는 인간 중간엽 줄기 세포에서 4가지 유형의 조직을 생성하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 4 개의 조직은 맞춤형 생물 반응기에 통합되고 미세 유체를 통해 연결되어 무릎 관절 온 칩을 생성합니다.

관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

우리는 활막의 급성 염증, 감염, 구조적 변화를 평가할 수 있는 인간 체외 트랜스웰 시스템을 개발했습니다.

기능과 구조가 보존된 체 외 인간 낙액 조직을 이용한 전임상 접속 모델

학습하세요 활액 유체를 이용한 3D 배양 시스템으로 인간 관절 연골세포를 장기간 배양하는 방법입니다. 이 기술은 연골 재생 및 관절염 치료제 선별 연구에 활용될 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

더 많은 동영상 탐색