라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

질량 분열(Mass Squirm) 프로토콜은 동위원소 메틸화 및 말디 질량 분석법을 사용하여 라이신 탈메틸화효소 활성을 정량화하는 것을 목표로 하며, 먼저 메틸화된 라이신을 함유한 펩타이드에서 효소 촉매 탈메틸화 반응을 수행합니다. 그런 다음 잔류물은 탈수소화 포름알데히드와 탈메틸화효소 반응의 펩타이드 생성물을 화학적으로 메틸화하여 maldi에 의해 동일한 방식으로 이온화되는 균일하게 메틸화된 펩타이드를 생성하고, 다중 질량 분석법으로 각 펩타이드 종을 정량화하고 동위원소 중복을 설명합니다. un mono dye 및 trimm 메틸화 펩티드의 상대적인 양을 확인하기 위해 질량 squirm 결과는 질량 변화에 따라 각 demethylase 반응 생성물의 상대적인 양을 결정합니다.

일상적인 곰팡이 질량 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 질량 점수가 서로 다른 메틸화 펩타이드 간의 이온화 차이를 설명한다는 것입니다. 우리는 동위원소가 무거운 무수아세트산을 사용하여 히스톤 아세틸화 수준을 측정하는 방법을 개발했을 때 이 접근 방식에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 기법의 과제는 피크 면적 데이터를 추출하는 것인데, 이는 펩타이드 동위원소 포락선의 중복으로 인해 복잡해질 수 있습니다.

탈메틸라제 반응을 위해 125나노그램의 재조합 라이신 특이적 데메틸라아제 1개 효소와 0.25마이크로그램의 비오틴화 디메틸 히손 H 3 펩타이드를 20마이크로리터 데메틸라제 완충액의 최종 부피에 결합했습니다. 또한 LSD 1개 효소 없이 0.25마이크로그램 펩타이드를 함유한 대조군 샘플을 준비하고, 반응 및 대조 튜브를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로 R을 준비하기 위해 2개의 20미크론 다공성 비드를 동일한 부피의 비드와 메탄올을 혼합합니다.

그런 다음 10 부피의 TFA 포름산을 첨가하고 각 샘플에 8 마이크로 리터의 다공성 비드를 첨가 한 다음 실온에서 15 분 동안 교반합니다. 한편, 컨디셔닝 C 18 지퍼 팁 2개. 0.1%TFA 20마이크로리터로 2회 피펫팅, 70%아세토 니트릴 0.1%TFA로 4회, 0.1%TFA로 다시 4회.

다음으로, 두 개의 샘플을 컨디셔닝된 지퍼 팁에 로드합니다. 피펫터를 사용하여 C 18 수지를 통해 볼륨을 밀어 넣습니다. 두 샘플의 총 부피가 지퍼 팁을 통해 밀려날 때까지 반복합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 0.1%TFA 용리 샘플로 지퍼 팁을 두 번 세척합니다.amp40마이크로리터 환상 버퍼에 넣고 speed vac 집중 장치로 완전히 건조시킵니다. 먼저 100마이크로리터의 50밀리몰 인산염 완충액, pH 7.4에 샘플을 재현탁합니다. 그런 다음 8마이크로리터의 보어 디메틸 아민과 16마이크로리터의 경감된 포름알데히드를 추가합니다.

섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 보링 디메틸 아민과 중수소화 포름알데히드를 첨가하여 환원성 메틸화를 반복하고 2시간 동안 배양합니다. 세 번째에는 보링 디메틸 라민을 넣고 섭씨 4도에서 15시간 동안 배양합니다.

12.5 마이크로리터의 1몰 트리스로 반응을 담금질합니다.pH 7.4는 speed vac 집중 장치로 완전히 건조시킵니다. 먼저 Resus, 100 마이크로리터의 50 밀리몰 인산염 완충액 pH 7.4에서 대조군 및 탈메틸라제 반응 샘플을 현탁시킵니다.

이제 8개의 마이크로리터 다공성 비드를 대조군 및 탈메틸화효소 반응 샘플에 추가하고 앞서 표시된 것처럼 지퍼 팁에 수집합니다. 2마이크로리터 부피를 MALDI 시료 플레이트에 넣고 실온에서 건조시켜 결정화합니다. 질량 분석법으로 시료 분석을 진행합니다.

스펙트로 파일을 열어 작업 소프트웨어를 만들고 M over Z 소프트웨어로 내보냅니다. 또한 세로로 세로로 연결되는 질량 분석법으로 반응 생성물을 확인하십시오. 먼저, 대조군 시료에 대한 단일 동위원소 피크에 대한 탄소 13 C 2 및 탄소 13 C 4 동위원소의 피크 면적 비율을 측정합니다.

이러한 계산된 비율을 사용하여 각 변형에 존재하는 펩타이드의 상대적인 양을 정량화할 수 있습니다. 탈메틸라제 반응 샘플의 상태. LSD 단일 효소는 라이신 탈메틸화의 대량 분지움 정량화에 효과적으로 사용될 수 있습니다.

대조 반응은 환원성 메틸화를 거치지 않기 때문에 이 펩타이드에 대한 일반적인 동위원소 외피를 나타냅니다.결과 피크 면적은 탄소 13 C 2 및 탄소 13 C 4에 존재하는 펩타이드의 배경 비율을 결정합니다. 동위원소 상태, 대조 반응을 위한 질량 스펙트럼의 피크 면적을 통해 각 변형 상태에 존재하는 펩타이드의 상대적인 양을 정량화할 수 있습니다. 탈메틸 분해 효소 반응에서 이러한 제어 및 탈메틸 분해 효소 반응의 피크 면적은 33.7 % 디메틸 라이신 4 42 0.3 % 모노 메틸 라이신 4 및 24 % 메틸화되지 않은 라이신 4를 결정합니다.

이 대량 스퀌 접근법은 히스톤 라이신 잔기의 탈메틸화가 다양한 질병에 어떻게 기여하는지와 같은 히스톤 후성 유전학 분야에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 메틸화 분석법은 탈메틸화효소 연구에 적용되었지만 메틸 전이효소를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.