Name: 라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 라이신 디메틸라제 활성을 MALDI 질량 분석법과 동위원소 표지법으로 정량하는 MassSQUIRM 기법을 통해 후성유전학 연구에서 단백질 메틸화 역학을 정밀하게 분석하는 방법을 익히세요.

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우리는 대량 spectrometric 지원 UAMS의 Proteomics 시설 감사드립니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 NIH 보조금 P20RR015569, P20RR016460 및 R01DA025755에 의해 제공되었다.

이 프로토콜은 블레어 외에서 수정됩니다. 6. 1. LSD1 Demethylation 분석 <ol><li> 20 μL의 최종 볼륨에서 demethylase 버퍼에서 0.25 μg 디 - 메틸 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴) (50 MM 트리스-CL 산도 8.5, 50 MM KCl, 5 밀리미터 MgCl 2, 5 %의 125 NG 재조합 LSD1을 결합 글리세롤). 또한, 아니 효소와 펩티드 혼자 컨트롤을 수행합니다. 제어 섹션 3이며 reductive methylation이 필요하지 않습니다. </li><li> 37에서 2 시간 동안 품어 ° C. </li><li> 펩티드를 수집하려면 각 샘플 ~ 8 μL POROS의 R2 20 마이크론 구슬을 추가하고 실온에서 15 분 동안 선동. 메탄올 1 볼륨으로 구슬 1 볼륨을 정지하여 POROS 비즈를 준비하고 5퍼센트 개미의 산성 / 0.2 % TFA 10 볼륨을 추가합니다. </li><li> 2 급 끝에 0.1 %의 TFA 20 μL를 aspirating하고 pipettor들과 다시 한번 밀어 C 18 ZipTips. 0.1 %의 T로 두번이 작업을 수행FA, 넷 70 % acetonitrile과 회 / 0.1 %의 TFA, 그리고 0.1 %의 TFA로 다시 네 번. </li><li> ZipTips에서 C 18 수지 뒤에 비드 슬러리를 pipetting과 pipettor로를 통해 볼륨을 밀어 에어컨 C 18 ZipTips에 두 개의 샘플을 (제어 및 demethylase 반응)로드합니다. </li><li> 0.1 %의 TFA 20 μL으로 두 번 ZipTips 씻으십시오. </li><li> 70 % acetonitrile / 0.1 %의 TFA의 40 μL에 Elute. </li><li> Speed​​Vac 농축기로 완전히 각 eluant을 Lyophilize. </li></ol> 2. Reductive Methylation 프로토콜의이 부분은 ​​블레어 외에서 수정됩니다. 및 Rayment 외. 6,7. <ol><li> 50 밀리미터 인산 버퍼, 산도 7.4의 100 μL의 demethylase 반응을 다시 일시 중지합니다. </li><li> demethylase 반응으로, 15 밀리그램 / ML borane dimethylamine 8 μL를 추가합니다. Borane dimethylamine은 15 밀리그램 / ML 재고 솔루션을 제공하기 위해, 50 MM 인산 버퍼, 산도 7.4에 녹아있다.이것은 신선한하여야한다. </li><li> demethylase 반응으로, 250 MM 진정제를 맞았을 포름 알데히드의 16 μL를 추가합니다. 250 MM 진정제를 맞았을 포름 알데히드는 H 2 0에서 주식을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다. 이것은 신선한하여야한다. </li><li> 12 시간 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 단계 2.2, 2.3 및 2.4 반복합니다. </li><li> 단계 2.2를 반복합니다. </li><li> 4에서 품어 ° C ~ 15 시간. </li><li> demethylase 샘플로 1M 트리스, reductive methylation 반응을 끄지하는 산도 7.4의 12.5 μL를 추가합니다. </li></ol> 3. 든 질량 분광법 <ol><li> demethylase 반응에 POROS R2 20 마이크론 구슬을 추가하고 단계 1.3-1.6에 설명된대로 ZipTips를 수집합니다. </li></ol> 참고 : 50 MM 인산 버퍼, 산도 7.4의 100 μL에 컨트롤을 다시 중지되고 다른 샘플 단계 3.1으로 시작하는으로 취급합니다. <ol start="2"><li> 33%가 포화 2 μL를 사용 든 샘플 플레이트에 ZipTips에서 제어 및 demethylase 반응 샘플을 EluteD 2,5 - dihydroxybenzoic 산. 33%에게 2,5-dihydroxybenzoic 산성을 준비하려면 70 % acetonitrile / 0.1 % TFA에 포화 33%로 희석 후 70 % acetonitrile / 0.1 % TFA에 2,5-dihydroxybenzoic 산성의 포화 용액을 만들고. eluted 샘플 건조하고 구체화하도록 허용합니다. </li><li> PerkinElmerSciex 든-prOTOF 질량 분석기 또는 가능한 고해상도 든 질량 분석계 8,9,10을 사용하여 질량 스펙트럼을 수집합니다. </li><li> 스펙트럼보기 및 질량 분광계 제조 업체에서 제공 PerkinElmerSciex TOFworks 소프트웨어 또는 소프트웨어를 사용하여 피크 영역을 추출합니다. </li><li> 탠덤 질량 spectrometric 기능을 제공하는 사용 가능한 대량 spectrometric 시스템과 석사 2로 반응 제품을 확인합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 무거운 포름 알데히드 (그림 1B)를 사용하여 만든 isotopic 중복 보상하기 위해, 피크 면적 13 C 2와 13 C 4 동위 원소 relativ의 (A)의 비율을 결정reductive methylation (그림 2A)를 겪은하지 않은 컨트롤 샘플에 대한 monoisotopic 최대 5. EQ 1 : 13C2 / 12C = R 1 EQ 2 : 13C4 / 12C = R 2 이렇게하면 실험 및 질량 분석계에 특정한 이들 isotopic 상태에서 기존 펩타이드의 비율 (R 1 &amp; R 2)를 제공할 것입니다. </li><li> demethylase 반응 시료의 각 변형 상태 (그림 2B)에 기존 펩타이드의 상대적 양을 quantifying에 대해 다음 수식에서 R 1 &amp; R이 값을 사용 EQ 3 : H3K4me2 = 1 EQ 4 : H3K4me = 2 - R 1 (1) EQ 5 : H3K4 = 3 - R 2 (1) - [R 1 (2 - R 1 (1))] </li></ol> 5. 대표 결과 LSD1를 사용하여, 우리는 quantifying 위해 MassSQUIRM의 효과를 보여라이신 demethylation. 와 같은 프로토콜 텍스트 섹션에서 설명한, 우리는 LSD1 125 NG와 0.25 μg 디 - 메틸 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴)와 demethylase 분석을 수행. 제어 및 demethylase 반응 표본 reductive methylation 및 든 질량 분광법를 받게되었다. reductive methylation을 받다 없었 제어 반응이 펩타이드에 대한 전형적인 isotopic 봉투를 보여주와 방정식 1과 2 (그림 2A)에 피크 영역을 제공했습니다. demethylase 반응에 대한 질량 스펙트럼은 방정식 3-5 (그림 2B)의 피크 영역을 제공했습니다. 제어 및 demethylase 반응의 피크 영역을 사용하여, 우리는 LSD1는 다음과 같은 반응 제품을주는 펩타이드를 demethylated 것을 결정 : 33.7 % 디 - 메틸 Lys4, 42.3 % 모노 메틸 Lys4 및 24% 해제 methylated LYS 4. 블레어 외 참조하십시오. 전체 LSD1 demethylase 활동의 분석뿐만 아니라 억제제 연구 6. 참고 이러한 반응 시간, 효소 등 변화하는 변수농도와 기판 농도는 활동에 대한 심층 분석에있게됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> 그림 1. MassSQUIRM 개요. () 히스톤 H3의 N-터미널 펩타이드가되는대로 표시됩니다 취소 (녹색), 모노 (빨간색) 또는 디 - (파란색) 라이신 4에 methylated. 각 펩타이드의 화학적 구성의 변화는 부량 복합 만들기 차등 이온화로 안내합니다. (B) Reductive methylation은 모든 펩티드가 비슷하게 이온화로 인해 디 - 메틸 상태에 대한 모든 리진 잔류물을 변환합니다. reductive methylation 반응에 무거운 포름 알데히드의 사용은 원래 methylation의 정체성 유지 수 있습니다. 닫힌 서클이 심한 methylation을 나타내는 반면 오픈 서클 밝은 methylation을 나타냅니다. 블레어 외. 2,011 6에서 수정하였습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> FigurE 2. MassSQUIRM는 differentially methylated 펩티드를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. () 디 - methylated 합성 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴)은 R 1 및 방정식 1과 2에서 R 2로 언급했다 질량 분광법과 monoisotopic에서 최대 상대적인 최대 비율을 사용하여 분석되었다. (B) 같은 합성 펩타이드는 37 ° C.에 두 시간 동안이나 demethylase 버퍼에 125 NG의 LSD1 함께 incubated되었다 샘플은 다음 분석을 MassSQUIRM를 받게되었다. 봉우리 중복의 혼합 인구는 그림 1B에서 본 세 가지 다른 methylation 상태를 나타냅니다. monoisotopic 봉우리 아래의 영역은 1, 2 및 3으로 언급되었다. 피크 영역은 방정식 3-5에 사용되었다. 닫힌 서클이 심한 methylation을 나타내는 반면 오픈 서클 밝은 methylation을 나타냅니다. 블레어 외에서 수정하였습니다. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

MassSQUIRM은 모노와 DI-methylation에 관여 라이신 demethylases의 활동의 종합적인 분석을위한 저렴하고 양적 방법입니다. MassSQUIRM는 반응의 제품뿐만 아니라 중간체를위한뿐만 아니라 quantitation를 제공합니다. 이 분석은 LSD1 및 기타 히스톤 demethylases의 메커니즘을 연구의 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 PHF8 많은 새로 발견된 라이신 demethylase 효소를 분류하고 특정 methyltransferase 효소에 사용될 수 유용할 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50,100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-비오틴 펩타이드 </td><td> 자체 준비 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> POROS R2 20 마이크론 구슬 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산성 (TFA) </td><td> 써모 </td><td> 28,904 </td></tr><tr><td> acetonitrile </td><td> 어부 </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxybenzoic 산 </td><td> 시그마 </td><td> 85,707 </td></tr><tr><td> Borane dimethylamine </td><td> 시그마 </td><td> 180,238 </td></tr><tr><td> isotopically 무거운 D 2 - 포름 알데히드 </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구소 </tD&gt; <td> DLM - 805-20 </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> 어부 </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 어부 </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 어부 </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> G33 </td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> Fluka </td><td> 06,440 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 어부 </td><td> A452 </td></tr><tr><td> 나 인산 </td><td> 어부 </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> Speed​​Vac 농축기 </td><td> 학자 </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> 든 - prOTOF 질량 분석계 및 TOFworks 소프트웨어 </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> 없음 </td></tr></tbody></table>

라이신 demethylase 활동의 양적 측정을위한 masssquirm의 응용

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

최근 epigenetic 규제는 1-3 여러 가지 질병의 주요 선수로 발견되었습니다. 결과적으로 이러한 효소는 작은 분자 연구 및 약물 개발 4 주요 목표입니다. 많은 epigenetic 규제는 최근에 발견하고 분류하는 과정이 아직 없습니다. 이들 효소 중 histones 및 다른 단백질에 lysines에서 메틸 그룹을 제거 라이신 demethylases 있습니다. 효소의이 클래스의 소설 특성으로 인해 몇 assays들은 활동을 공부하기 위해 개발되었습니다. 이 분류와 히스톤 demethylases의 높은 처리량 연구 양쪽에 도로를 차단했습니다. 현재 거의 demethylase의 assays가 존재합니다. 존재하지 그것들은 자연에서 질적 경향 동시에 다른 라이신 methylation 상태 사이에 분별없는 수 있습니다 (취소, 모노 -, 디 - 및 트라이 -). 질량 분석법은 일반적으로 demethylase 활동을 결정하는 데 사용하지만 현재 대량 spectrometric assays 할있다differentially methylated 펩티드 다르게 이온화 여부를 해결할 수 없습니다. methylated 펩티드의 차동 이온화는 methylation 상태가 어렵고 (그림 1A) 확실히 양적되지 비교 있습니다. 따라서 가능한 assays는 demethylase 활동의 포괄적인 분석을 위해 최적화되지 않습니다. 여기 따라서 본질적으로 동일한 화학 종족들을 만들고, 모든 lysines는 디 - methylated로 강제로 진정제를 맞았을 포름 알데히드와 아민 그룹의 reductive methylation을 기반으로 MassSQUIRM라는 방법을 (isotopic reductive methylation을 사용하여 질량 spectrometric quantitation) 설명하고 있으므로이 이온화 동일한 (그림 1B). reductive methylation에 따라 유일한 화학 변화는 수소와 든 이온화 효율에 영향을주지 않습니다 중수소입니다. MassSQUIRM 분석이 해제, 모노 또는 디 - methylated lysines와 demethylase 반응 제품에 대한 구체적인 것입니다. 분석은 또한 SA주는 라이신 methyltransferases에 적용나에게 반응 제품보기. 여기서는 reductive methylation 화학 및 든 질량 분광법 LSD1의 활동을 측정, 합성 펩티드 기질 5, 디 - 및 모노 - 메틸 그룹을 제거하는 능력이 라이신 demethylase.의 조합을 사용 이 분석은 간단하고 실험실이나 proteomics 시설을 통해 든 질량 분석기에 대한 액세스 권한이있는 모든 실험실로 쉽게받을 수있는 것입니다. 검정은 ~ 8 배 다이나믹 레인지를 가지고 있으며, 플레이트 형식 5 ~ 쉽게 확장 가능합니다.

우리는 라이신 methylation의 변화를 계량하는 데 든 질량 분광법과 reductive methylation 화학을 사용하는 방법을 제시한다.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

최근 후성유전학적 조절 인자들이 다양한 질환의 핵심 요소임이 밝혀졌습니다 1-3. 그 결과, 이러한 효소들은 소분자...

Mass squirm 프로토콜은 동위원소 메틸화 및 MALDI 질량 분석법을 사용하여 라이신 탈메틸화 효소(lysine demethylase)의 활성을 정량화하는 것을 목표로 합니다. 먼저, 메틸화된 라이신을 포함하는 펩타이드에서 효소 촉매 탈메틸화 반응을 수행합니다. 그 후, 탈메틸화 효소 반응으로 생성된 펩타이드 생성물을 중수소화 포름알데히드로 화학적으로 메틸화하여 MALDI에서 동일한 방식으로 이온화되는 균일하게 메틸화된 펩타이드를 생성합니다. 이어서 MALDI 질량 분석법으로 각 펩타이드 종을 정량화하고 동위원소 중첩을 고려합니다. 비메틸화, 단일 메틸화, 이중 메틸화 및 삼중 메틸화된 펩타이드의 상대적 양을 식별하기 위해, mass squirm 결과는 질량 변화를 기반으로 각 탈메틸화 반응 생성물의 상대적 양을 결정합니다.통상적인 몰드 질량 분석법과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 질량 점수가 서로 다르게 메틸화된 펩타이드 간의 이온화 차이를 반영한다는 점입니다. 저희는 동위원소가 표지된 무거운 무수 초산을 사용하여 히스톤 아세틸화 수준을 측정하는 방법을 개발했을 때 처음으로 이 접근 방식에 대한 아이디어를 얻었습니다. 이 기술의 어려운 점은 피크 면적 데이터를 추출하는 것이며, 이는 펩타이드 동위원소 포락선의 중첩으로 인해 복잡해질 수 있습니다.탈메틸화 반응을 위해 125 nanograms의 재조합 lysine specific demethylase one 효소와 0.25 micrograms의 biotinylated dimethyl hisone H three 펩타이드를 최종 부피 20 microliters의 demethylase 버퍼에 혼합합니다. 또한 LSD one 효소가 없는 0.25 micrograms의 펩타이드를 포함하는 대조군 샘플을 준비합니다. 반응 튜브와 대조군 튜브를 37 degrees Celsius에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로 R two 20 micron 다공성 비드를 준비하기 위해 비드와 메탄올을 동일한 부피로 혼합합니다.그 다음 TFA 포름산 10배 부피를 첨가하고, 각 샘플에 다공성 비드 8 µL를 넣은 후 상온에서 15분 동안 교반합니다. 그동안 두 개의 C 18 zip tip을 컨디셔닝합니다. 0.1% TFA 20 µL로 두 번 피펫팅하고, 70% 아세토니트릴 0.1% TFA로 네 번, 다시 0.1% TFA로 네 번 피펫팅합니다.다음으로, 컨디셔닝된 zip tip에 두 샘플을 로딩합니다. 피펫을 사용하여 C 18 수지를 통해 용액을 밀어 넣습니다. 두 샘플의 전체 부피가 zip tip을 모두 통과할 때까지 이 과정을 반복합니다.그런 다음 0.1% TFA 20 µL로 zip tip을 두 번 세척하고, 40 µL의 용출 버퍼(elution buffer)로 샘플을 용출한 후 speed vac 농축기로 완전히 건조합니다. 먼저 샘플을 50 mM 인산 완충액(pH 7.4) 100 µL에 재현탁합니다. 그다음 borane dimethyl amine 8 µL와 derated formaldehyde 16 µL를 첨가합니다.4°C에서 2시간 동안 배양합니다. 보론 디메틸아민과 중수소화 포름알데하이드를 첨가하여 환원적 메틸화를 반복하고 2시간 동안 배양합니다. 세 번째로, 보론 디메틸아민을 첨가하고 4°C에서 15시간 동안 배양합니다.1M Tris (pH 7.4) 12.5 µL를 가하여 반응을 정지시킨 후, SpeedVac 농축기로 완전히 건조시킵니다. 대조군 및 탈메틸화 효소 반응 샘플을 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.4) 100 µL에 재현탁합니다.이제 대조군과 탈메틸화 효소 반응 샘플에 8 µL의 다공성 비드를 추가하고, 앞서 설명한 대로 집 팁(zip tip)으로 수집합니다. 2 µL씩 MALDI 샘플 플레이트에 용리시킨 후, 실온에서 결정화될 때까지 건조합니다. 질량 분석법을 통해 샘플 분석을 진행하십시오.spectro 파일을 작업 소프트웨어에서 열고 M over Z 소프트웨어로 내보냅니다. 탠덤 질량 분석법을 통해 반응 생성물을 추가로 검증합니다. 먼저, 대조군 샘플에 대해 단일 동위원소 피크 대비 carbon 13 C two 및 carbon 13 C four 동위원소의 피크 면적 비율을 결정합니다.이 계산된 비율을 사용하여 각 변형에 존재하는 펩타이드의 상대적 양을 정량화하십시오. 탈메틸화 반응 샘플의 상태입니다. LSD 단일 효소는 라이신 탈메틸화의 질량 분석 정량화에 효과적으로 사용될 수 있습니다.대조군 반응은 환원적 메틸화를 거치지 않으므로, 이는 해당 펩타이드의 전형적인 동위원소 포락선을 나타냅니다. 결과 피크 면적을 통해 carbon 13 C two 및 carbon 13 C four 형태로 존재하는 펩타이드의 배경 비율이 결정됩니다. 대조군 반응의 질량 분석 스펙트럼에서 얻은 동위원소 상태 및 피크 면적을 통해 각 수식 상태로 존재하는 펩타이드의 상대적 양을 정량화할 수 있습니다. 데메틸라아제 반응에서, 이러한 대조군 및 데메틸라아제 반응의 피크 면적을 통해 33.7%의 dimethyl lysine 4, 42.0.3%의 monomethyl lysine four, 그리고 24%의 unmethylated lysine four가 결정됩니다.이러한 질량 분석 기반의 스크리닝(mass squam) 접근 방식은 히스톤 라이신 잔기의 탈메틸화가 다양한 질병에 어떻게 기여하는지와 같은 히스톤 후성유전학 분야에 핵심적인 통찰을 제공합니다. 이 메틸화 분석법은 탈메틸화 효소를 연구하는 데 적용되어 왔지만, 메틸전이효소를 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

inducible 리진 탈카복실화효소의 활동은 톨루엔에 차등 용해도를 부가물을 형성 2,4,6 - trinitrobenzensulfonic의 소산으로 기판 L - 라이신과 제품 cadaverine을 반응에 의해 모니터링됩니다.

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

SPOT 방법으로 합성된 펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

여기서, 우리는 KDM1A 억제물로 처리된 인간 또는 동물 세포, 조직 또는 혈액 샘플에서 KDM1A 표적 결합을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 무료 KDM1A 효소의 화학 프로브 태깅및 화학 프로브 기반 면역 검술을 사용하여 표적 직업의 직접 정량화를 채택하고 전임상 및 임상 연구에서 사용될 수 있습니다.

화학 프로브 기반 면역 분석제사용 KDM1A 표적 결합의 직접 측정

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

이 연구는 유전 암호 확장을 활용하여 대 장균 과 포유류 세포에서 인간 에놀라제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)의 특정 부위에 락틸-라이신(Klac)을 성공적으로 통합하는 방법을 확립했습니다.

대 장균 과 포유류 세포에서 유전 암호 확장을 통한 부위 특이적 라이신 락틸화

배우세요 라이신 디메틸라제 활성을 MALDI 질량 분석법과 동위원소 표지법으로 정량하는 MassSQUIRM 기법을 통해 후성유전학 연구에서 단백질 메틸화 역학을 정밀하게 분석하는 방법을 익히세요.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

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