Name: 줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 지방유래 줄기세포를 키토산 마이크로스피어에 담아 콜라겐 하이드로겔로 전달하는 방법을. 이 기술은 세포의 다능성을 유지하며 재생의학 및 약물전달에 활용됩니다.

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1. 격리 지방 파생 줄기 세포 (ASC) 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 쥐 perirenal 및 epididymal 지방을 분리하고 이전 6 설명된대로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. </li><li> 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HBSS의 25 ML에 1-2그램을 전송. </li><li> 자유 부동 지방 조직 계층과 125 ML erlenmeyer 플라스크에 송금을 모아서 37시 45 분 대한 HBSS에서 collagenase 2 형 (200 U / ML)의 25 ML과 치료 ° 궤도 흔드는 (125 RPM)에서 C #. </li><li> 조심스럽게 액체 분획을 (오일과 지방 레이어 아래)을 제거하고 100 μm의 및 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 순차적으로 필터링합니다. 상온에서 10 분 동안 500g에 여과물을 원심 분리기, supernatan을 기음t 및 25 ML의 HBSS로 두 번 펠릿 씻는다. </li><li> MesenPRO RS 형성제 (100 U / 페니실린 G, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산과 0.25 μg / ML Amphotericin B의 ML) 항생제 - antimycotic으로 보충 성장 매체 (MesenPRO RS 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간)의 50 ML에 세포 펠렛을 Resuspend , 2 T75 flasks (25 ML / 플라스크)에 2 밀리미터 L-글루타민과 pipet 세포. </li><li> 문화 37 ° C (ASC가 모든 실험에 사용되는 항로 2-4)에서 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 ASC. </li></ol> 2. 키토산 Microspheres (CSM)을 준비 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> CSM은 우리의 이전 프로토콜 6을 사용 이온 coacervation 기법과 함께 워터 인 오일 유화 과정에서 준비가되어 있습니다. 콩으로 구성된 오일 위상 혼합물의 100 ML에 키토산의 수용액 (0.5 M 아세트산의 산성에서 3퍼센트 W / V 키토산 6 ML)를 유상으로 만들다석유, N-octanol (1시 2분 V / V) 5 % 솔비 탄 모노-oleate (폭 80) 유화제, 반대 방향으로, 오버헤드 (1700 RPM)과 동시에 자성 저어 (1000 RPM)를 사용. 초기 가교가 발생하기 전에에서 형성 micelles이 용액에 남아하고 아래로 정착 수없는 혼합 보장이 이중 방식입니다. 또한,의 자석 볶음 바 AIDS 마이셀 형성 및 rigidization 동안 키토산을 취소 수렴. </li><li> 혼합물은 지속적으로 안정적인 물 인 석유 유제를 얻을 때까지 약 1 시간 동안 흔들 수 있습니다. 이오니아 crosslinking은 4 H (24 ML 합계)에 대한 N-octanol 매 15 분 안에 1퍼센트 W / V 수산화 칼륨 1.5 ML의 추가와 함께 시작됩니다. </li><li> crosslinking 반응 완료 후, 천천히 혼합물이 포함된 CSM의 석유 단계를 가만히 따르다 즉시 아세톤 100 ML에 분야를 추가합니다. 오일 위상이 완전히 제거될 때까지 아세톤과 분야 씻으십시오. </li><li> 진공 건조기와 항문에서 복구된 분야 말리추가 처리없이 yze. 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램 당 면적과 단위 입방 볼륨이 입자 크기 분석기를 사용하여 결정되었다. </li><li> 후속 실험의 경우 잔류 염분을 제거하고 절대 알코올로 소독하는 살균 물로 CSM 세 번 씻는다. </li></ol> 3. CSM에서의 자유 아미노 그룹의 개수를 결정 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> Bubins 및 Ofner 7 trinitro benzenesulfonic (TNBS) 산성 분석을 사용하여 이온 crosslinking 후 CSM에있는 무료 아미노 그룹의 개수를 결정합니다. 40 ° C 4 H에 대한 50 ML 유리관의 0.5 % TNBS 용액 1 ML과 microspheres의 5 밀리그램을 부화하고 2 시간 동안 60 ° C에서 6N HCL 3 ML의 추가와 함께 hydrolyze. </li><li> 실내 온도에 샘플을 냉각하고, 탈이온수 5 ML과 에틸 10 ML을 추가하여 무료 TNBS를 추출에테르. </li><li> ° C 물 목욕 15 분 실온에 시원한 잔여 마취제, 증발 및 물 15 ML로 희석하기 위해 40 수성 단계의 5 ML의 나누어지는을 따뜻하게. </li><li> 빈과 키토산은 아미노 그룹의 총 수를 결정하기 위해 CSM 준비에 사용으로 키토산없이 TNBS 솔루션을 사용하여 분광 광도계로 345 nm의 흡광도에서 측정. 키토산에 상대적인 CSM 무료 아미노 그룹의 수를 예상됩니다. </li></ol> 4. CSM의 로딩 ASC 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 하룻밤 무균 HBSS의 섹션 2.5에서 소독 CSM의 5 밀리그램을 평형과 8 μm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 (24 - 웰 플레이트)에 추가합니다. </li><li> CSM은 멤브레인에 정착한 후, 조심스럽게 HBSS를 기음과 세기에 성장 미디어 삽입 700 μL의 내부에 성장 배지 300 μL를 추가할삽입 이외의 전자. </li><li> 문화 플레이트 인서트 내부 CSM 이상 성장 매체와 종자 200 μL의 적절한 농도에서 Resuspend ASC (1 X 10월 4일에서 4일까지 × 10 4). 문화 삽입 내에서 매체의 최종 부피는 시딩 후, 500 μL입니다. </li><li> 37시 5 % CO 2 humidified 배양기에서 24 H 위해 CSM에 대한 ASC 씨앗을 품어 ° C. </li></ol> 5. CSM에 ASC로드 및 세포 생존 능력의 비율을 결정 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 부화 후 삽입 막으로 마이그레이션한 세포를 방해하지 않고 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 ASC-로드된 CSM를 수집합니다. </li><li> 잔여 매체를 제거하고 튜브에 신선한 성장 매체 250 μL를 추가합니다. </li><li> 각각의 튜브는 25 μL MTT에게 [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium의 브로마이드] 추가하려면용액 (5 밀리그램 / ML) 37시 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 4 H 동안 품어 ° C. </li><li> 부화 후, 매체를 제거 디메틸 sulfoxide 250 μL를 추가하고 formazan 복잡한 solubilize 위해 2-5 분 와동 혼합. </li><li> 5 분 동안 2,700 X g에서 CSM을 원심 분리기, 그리고 참고로 630 nm의를 사용하여 570 nm의에서 측정 뜨는 흡광도를 결정한다. </li><li> 가능한 ASC의 알려진 숫자에서 얻은 흡광도 값에 상대적 CSM과 관련된 휴대폰 번호를 확인합니다. </li></ol> 6. ASC-CSM-임베디드 콜라겐 젤 특성화 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 2 N NaOH를 사용하여 6.8로 산도를 조정 후 Bornstein 8 fibrillate의 방법에 따라 쥐의 꼬리 힘줄에서 추출한 제 1 형 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML)와 믹스 ASC-로드된 CSM (5 MG는 ≈ 2 X 10 4 세포를 포함). </lI&gt; <li> 12 잘 판에 fibrillated 콜라겐-ASC-CSM 혼합물을 추가하고 37에서 5 % CO 2 humidified 배양기에서 30 분 동안 품어 ° C. </li><li> 전체 세동 후, 37 ° C.에 최대 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 14 일 동안 콜라겐-ASC-CSM의 젤을 품어 </li><li> 겔에 CSM에서 세포의 출시 및 마이 그 레이션은 표준 현미경 기술을 이용하여 관찰되었다. </li></ol> 7. 대표 결과 현재 연구에서 우리는 콜라겐 젤 발판으로 키토산 microspheres (CSM)에서 줄기 세포를 전달에서 체외 전략을 개발했습니다. 균일한 크기 (직경 175-225 μm의)와 구성 다공성 CSM은 휴대 캐리어 (그림 2)로 준비하고 사용되었습니다. CSM으로 ASC를 잠복기되면 세포는 CSM 2 X 10 4 cells/5mg의 농도에 첨부. filopodia을 확장하는 동안 세포가 microsphere를 통해 확산이 가능했다microsphere의 다공성 틈새 (그림 3)에. 휴대 로드된 CSM은 콜라겐 젤과 혼합되었다되면, 세포는 즉시 젤류 (그림 4)로 이주하기 시작했다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> 표 1. 줄기 세포 전달 시스템의 키토산과 콜라겐의 사용에 대한 생물 학적 장점. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> 그림 1. 도식은 ASC-CSM 로드된의 콜라겐 공사장 공중 발판의 이중 사용을위한 전반적인 전략을 묘사. 그림 2, 3 및 4는 이미지의 해석에 도움을 도식 내에 주석이 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> 그림 2. 도식 표현은 키토산 microspheres에 줄기 세포를 퍼뜨리고하는 과정을 묘사. PROCμm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 - ESS는 8 CSM과 함께 공동 culturing ASC 관련이 있습니다. 24 시간 이내에, microspheres는 삽입에서 제거 및 biomaterial 행렬에 포함되어있는 준비가됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> 그림 3. ASC와 CSM-로드의 형태학의 특성. 패널 B는 공촛점 형광 현미경으로 얻은 이미지로 겹쳐보기의 같은 필드를 표시하는 동안 패널, ASC-로드된의 CSM의 가벼운 현미경을 묘사. ASC는 calcein AM (녹색)가 미리로드되었습니다. 패널 D는 microsphere (별표)에 싣게되는 세포를 보여주면서 패널 C는, 신이 microsphere의 SEM 이미지의 이미지를 묘사. 패널 전자의 TEM 이미지는 신이 microsphere의 단면을 보여줍니다. 모공과 틈새의 무리가 microsphere에 걸쳐 위치하고 있습니다. 패널 F는 세포와 교차 sectioned microsphere (화살표)를 첨부하고 cre로 filopodia을 확장 보여줍니다나쁜. 원래 배율 : &amp; B = 70X; C = 500x, D = 2,000 X, E &amp; F = 2,500 X. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> 그림 4. 입체 콜라겐 발판으로 CSM에서 ASC의 마이 그 레이션. 패널은 A와 B는 세포가 떨어져 microsphere의 이주와 함께 일 3 콜라겐 매트릭스 (, 화살표)으로 CSM을 묘사. 패널 B는 12 일 후에 유사한 문화를 보여줍니다. 전송 전자 현미경은 (TEM) 이미지가 C, D, 및 C와 D에서 E가 별표에 묘사된하고는 세포가 microsphere (화살표)에서 떨어져 마이 그 레이션과 함께 교차 sectioned되었습니다 microsphere를 보여줍니다. 패널 D의 높은 배율은 패널 전자에 묘사된, 그리고 콜라겐 원섬유 (삽입된 페이지)에 부착된 세포 filopodia를 보여줍니다. 원래 배율 : &amp; B = 100x, C &amp; D = 6,000 X; E = 20,000 X, 삽입된 페이지 = 150,000 X. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> 그림 5.도식은 재생 의료 및 약물 전달에 CSM의 광대한 사용을 묘사.

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줄기 세포 기반 요법의 주요 장애물은 수리를 위해 지정된 지역에 세포의 전달을위한 효율적인 방법을 개발하고있다. 환자의 다양성에 대한 환자로 인해 조직 유형, 부상 크기와 깊이, 전달하는 줄기 세포의 방법론은 사례별로 결정되어야합니다. 매트릭스 내에서 줄기 세포를 내장하고 상처 사이트에 배달하는 것은 조직 공학을위한 다음 논리적인 접근 방식 것으로 보이지만 몇 가지 기술적인 장애물이 남아있다. 이것은 매트릭스에 연결하고 세포 anoikis 9-10 전에 분아 따위에 의해 중식 첨부하여 적합한 microenvironment을 다시 수있는 주변 biocompatible를 제공하는 임베디드 세포의 기능이 포함됩니다. 이 과정은 세포들이 매트릭스 리모델링 기계, 사전 증식, 이주 및 줄기 세포의 분화의 원하는 셀에 프로세스로 수행하는 일이 소요될 수 있습니다 프로세스를 upregulate해야합니다. 이러한 문제를 회피하려면, 우리는 H번가 전에 손상된 조직을 복구하기위한 적절한 행렬로 그들을 삽입에 대한 키토산 m...

<table border="1" ><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 행크스 BalancedSalt 솔루션 (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14,175 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Collagenase 타입 II </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C6685 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 70 μm의 나일론 메쉬 필터 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,350 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 100 μm의 나일론 메쉬 필터 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,360 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> MesenPRO 성장 매체 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> T75 조직 배양 플라스크 </td><td> BD Biosciences </td><td> 137,787 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 키토산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 448,869 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 320,099 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> N-Octanol </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 150,630,025 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 솔비 - 모노-oleate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S6760 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 수산화 칼륨 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1767 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 피셔 과학 </td><td> L-4859 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 270,741 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Trinitro Benzenesulfonic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P2297 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 염산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 320,331 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 에틸 에테르 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 472-484 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 8 μm의 조직 문화 플레이트 삽입물 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,097 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-408-129 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> MTT 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 디메틸 Sulfoxide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D8779 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Qtracker 셀 라벨 키트 (Q 추적기 655) </td><td> 분자 프로브 </td><td> Q2502PMP </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 한 콜라겐을 입력 </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S8045 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 12 음 조직 배양 플레이트 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,043 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 </td><td> 뉴 브 런 즈윅 Scienctific </td><td> C24 </td><td> 장비 </tD&gt; </tr><tr><td> 에어 5 % CO 2와 Humidified 인큐베이터 </td><td> 써모 과학 </td><td> 모델 370 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 오버헤드 활동가 </td><td> 이카 </td><td> Visc6000 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 마그네틱 활동가 </td><td> 코닝 </td><td> PC-210 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 진공 건조기 </td><td> - </td><td> - </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 입자 크기 분석기 </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 피셔 과학 </td><td> Isotemp210 </td><td> 장비 </TD&gt; </tr><tr><td> 분광 </td><td> Beckman </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 DU800UV/Visible 분광 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 와동 </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> Microplate Reader를 </td><td> 분자 장치 </td><td> SpectraMax M2 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 형광 / 라이트 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX71 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 공촛점 현미경 스캐닝 FV-500 레이저 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 전자 현미경 검사 </td><td> 칼 자이스 혈구 마이크roImaging </td><td> 레오 435 부사장 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 전송 전자 현미경 </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> 장비 </td></tr></tbody></table>

줄기 세포 - 로드된 키토산 microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent 줄기 세포는 재생 의료 1-3 분야에서 매우 유용한 것으로 표시되었습니다. 그러나, 조직 재생을 위해 효과적으로 이들 세포를 사용하기 위해서는 변수의 수를 고려되어야한다. 이러한 변수는 다음과 같습니다 : 총 볼륨 및 주입 사이트의 표면적, 조직의 기계적 성질과 vascularization의 금액 및 세포외 기질의 구성 요소를 포함하는 조직 microenvironment를. 호스트 조직을 모방한 것이었 기계적 강도를 유지하면서 따라서 이러한 세포를 전달하기 위해 사용되는 자료는 정의된 화학 성분과 biocompatible이어야합니다. 이 자료는 또한 산소와 영양소를 세포 부착 및 분아 따위에 의해 번식하는 데 유리한 microenvironment를 제공하기 위해 대한 투과이어야합니다. 키토산, 우수한 biocompatibility과 양이온 다당류, 쉽게 화학적으로 바뀌었 및 생체내 맥에서 함께 바인딩 높은 친화력을 가지고 있습니다romolecules 4-5. 키토산은 세포 접착, 마이 그 레이션 및 확산을위한 기판으로 작동할 수 있도록, 세포외 기질의 glycosaminoglycan 부분을 모방한 것이었 지요. 본 연구에서는 입체 비계 6 기반의 콜라겐으로 지방 파생 줄기 세포 (ASC)를 제공하는 microspheres의 형태로 키토산을 활용. 이상적인 휴대 microsphere 비율은 배양 시간 및 로드할 수있는 세포의 최대 개수를 달성하기위한 세포 밀도에 대하여 산출된 것입니다. ASC는 키토산 microspheres (CSM)에 놓는되면, 그들은 콜라겐 발판에 포함된 및 확장 기간 동안 문화를 유지하실 수 있습니다. 요약이 연구는 정확하게 입체 biomaterial 발판 내에서 줄기 세포를 제공하는 방법을 제공합니다.

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

다능성 줄기세포는 재생 의학 분야에서 매우 유용한 것으로 밝혀졌습니다1-3. 하지만 이러한 세포들을 효과적으로 사용하기 위해서는...

본 프로토콜은 키토산 마이크로스피어(chitosan microspheres)에서 콜라겐 겔 스캐폴드로 줄기세포를 전달하여 회수 및 배양하는 인비트로(in vitro) 전략을 제공합니다. 먼저, 일차 지방세포 줄기세포를 유화하여 키토산 마이크로스피어 제제를 회수합니다. 다음으로, 줄기세포를 키토산 마이크로스피어에 파종하고 8 $\mu\text{m}$ 공극 크기의 멤브레인 배양 플레이트 인서트에서 배양하여 CS가 로딩된 CSM을 생성한 후, 마지막으로 마이크로스피어 전달 시스템을 3차원 콜라겐 겔 스캐폴드와 혼합합니다.궁극적으로, 이 CSM 시스템은 재생 의학과 약물 전달 분야에서 활용될 가능성이 있습니다. 세포 주입이나 미세 캡슐화와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 세포가 운반체 물질에 부착되어 초기 적용 후에도 지속될 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자의 경우, esan 미세구체가 고유의 정전기를 띠고 있어 수행에 어려움을 겪을 수 있습니다.또한, 세포를 자극하지 않고 마이크로스피어 층 위에 로딩하는 것은 매우 까다로운 작업입니다. 회음부 및 표피 지방 조직을 절제하여 세척하고, 조직을 잘게 다진 후 1% FBS가 포함된 25 mL의 HBSS에 1~2 g을 옮깁니다. 원심분리 후, 부유하는 지방 조직층을 125 mL 삼각 플라스크에 수집합니다.25 milliliters의 collagenase type two를 첨가하고 궤도형 진탕기(orbital shaker)에서 반응물을 배양합니다. 이제 오일 및 지방층 아래의 액체 분획을 조심스럽게 제거하고, 170 microns 크기의 나일론 메쉬 필터로 순차적으로 여과합니다. 25 milliliters로 두 번 세척한 후 원심분리를 통해 세포를 회수합니다.HBSS 재현탁 후, 펠릿을 보충제가 첨가된 mesen pro 성장 배지 30 milliliters에 현탁합니다. 정제된 지방 유래 줄기세포를 두 개의 T 75 배양 플라스크에 나누어 담고, 37 degrees Celsius의 5% carbon dioxide 습윤 배양기에서 ASC 준비물을 증폭시킵니다. 이 CSM 프로토콜은 이온 코어 기술을 이용한 수중유(water in oil) 유화 공정입니다.오버헤드 교반기와 마그네틱 교반기를 이용해 서로 반대 방향으로 1시간 동안 동시에 교반하여 100 mL의 오일 상 혼합물에 6 mL의 키토산 수용액을 유화시켜 안정적인 수-유 유화액을 만듭니다. 여기에 n-옥톨에 희석한 1% 수산화칼륨 1.5 mL를 4시간 동안 15분마다 첨가합니다. 이온 가교 반응이 완료되면 오일 상을 천천히 따라내고, 구체를 즉시 100 mL의 아세톤에 넣습니다. 오일 상이 완전히 제거될 때까지 아세톤으로 구체를 세척합니다.그런 다음 회수된 구체들을 진공 상태에서 건조합니다. 입도 분석기를 사용하여 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램당 표면적 및 단위 입방 부피를 결정하기 위해 건조 처리합니다. 잔류 염을 제거하기 위해 CSM을 멸균수로 3회 세척하십시오.이제 세포 실험에 사용할 수 있도록 50 mL 유리 튜브에 담긴 CSM 준비물을 절대 알코올로 멸균하고, 5 mg의 미세구체(microspheres)를 1 mL의 0.5% TNBS 용액과 혼합하여 40 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 3 mL의 6 N 염산을 첨가하고 60 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 시료를 실온으로 냉각한 후, 5 mL의 탈이온수와 10 mL의 에틸 에테르(Ethel Ether)를 첨가합니다.유리 TNBS를 추출하기 위해 수성층에서 5 mL의 분취액을 취하고, 상온으로 냉각한 후 잔류 에테르를 증발시키기 위해 항온수조에서 40 °C로 15분 동안 가열합니다. 분광광도계를 사용하여 15 mL의 물로 희석합니다. TNBS를 공시료(blank)로 사용하여 준비된 키토산 미세구의 흡광도를 345 nm에서 측정합니다.CSM 제조에 사용된 키토산의 양도 측정하십시오. 이제 키토산의 총 아미노기 수 대비 CSM의 유리 아미노기 수를 계산하십시오. 멸균된 CSM 5mg을 멸균된 HBSS에 넣고 하룻밤 동안 평형화하십시오.CSM을 24웰 배양 플레이트용 8µm 멤브레인 인서트로 옮깁니다. CSM이 가라앉은 후, HBSS를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이제 인서트 내부에 300µL의 성장 배지를 추가하고, 인서트 외부에 700µL의 성장 배지를 추가합니다.Resus.지방 유래 줄기세포를 200 µL의 성장 배지에 부유시킨 후, 배양 플레이트 내부의 CSM 위에 파종합니다. 37 °C, 5% carbon dioxide 가습 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 인서트 막으로 이동한 세포가 흐트러지지 않도록 주의하며, ASC가 적재된 CSM을 멸균 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.이제 잔여 배지를 제거하고 각 튜브에 250 µL의 신선한 성장 배지를 추가합니다. 5 mg/mL MTT 용액 25 µL를 첨가하고 4시간 동안 배양합니다. 배지를 제거하고 250 µL의 dimethyl sulf oxide를 첨가한 후, 포르마잔 복합체를 용해시키기 위해 볼텍싱합니다. CSM을 2,700 G에서 5분 동안 원심 분리합니다.630 nanometers를 참조 파장으로 하여 570 nanometers에서 상층액의 흡광도를 측정합니다. 알려진 수의 생존 가능한 A SC로부터 얻은 흡광도 값과 비교하여 CSM과 관련된 세포 수를 결정합니다. A SC가 적재된 CSM 5 milligrams를 7.5 milligrams per milliliter의 쥐 유래 제1형 콜라겐(Type one collagen extracted from rat's)과 혼합합니다.꼬리 건(tail tendon)의 pH를 2N 수산화나트륨을 사용하여 6.8로 조정한 후 배양 플레이트에 붓습니다. 섬유화(fibrillation)를 위해 삽입한 다음 12웰 플레이트로 옮겨 30분 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 이틀마다 collagen A-S-C-C-S-M 겔의 배지를 계속해서 교체해 줍니다.또한 표준 현미경 기술을 사용하여 CSM에서 겔로 세포가 방출 및 이동하는 것을 모니터링하십시오. 다음 예시는 키토산 마이크로스피어에서 콜라겐 겔 스캐폴드로 지방 유래 줄기세포를 전달하는 인 비트로(in vitro) 전략을 설명합니다. SEM 및 TEM 이미지는 균일한 크기의 다공성 CSM이 제조되었음을 나타냅니다.마이크로스피어를 일차 지방 유래 줄기세포와 함께 배양한 결과, CSM 칼슘 am 1mg당 4,000개의 세포가 확인되었습니다. 단일 세포(SC)의 염색 결과, 세포가 CSM 전체로 퍼지며 마이크로스피어의 다공성 틈새로 필로포디아(filopodia)를 뻗어내는 것이 관찰되었습니다. 세포가 로딩된 CSM을 콜라겐 겔과 혼합하자, 세포들이 겔 내부로 이동하였으며 시간에 따른 이동 경로를 추적할 수 있었습니다.이 기술의 함의는 즉각적으로 광범위하고 만성적인 조직 손실 치료로 확장됩니다. 하지만, 이 치료법은 다양한 세포 및 다양한 수준의 연조직 및 심장 조직 손실 치료에 사용되는 바이오 소재와 결합할 수 있는 다재다능함 덕분에 훨씬 더 많은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법이 숙주 세포 전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 것으로 기대됩니다.또한 이는 주사제와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있으며, 치료제를 전달하거나 세포와 치료제를 함께 전달하는 하이브리드 시스템을 개발하는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을...

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.

인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

본 프로토콜은 키토산-제니핀 마이크로겔의 제조를 위한 비에멀젼 기반 방법을 기술한다. 이러한 마이크로겔의 크기는 정밀하게 조절할 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 표시하고, 생체내에서 분해되며, 시간이 지남에 따라 지속적으로 방출되는 치료 분자로 로딩될 수 있어 조직 공학 응용에 매우 적합합니다.

조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

배우세요 지방유래 줄기세포를 키토산 마이크로스피어에 담아 콜라겐 하이드로겔로 전달하는 방법을. 이 기술은 세포의 다능성을 유지하며 재생의학 및 약물전달에 활용됩니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

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