줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

이 프로토콜은 키토산 미세구에서 줄기세포를 콜라겐 겔 골격, 수확 및 배양으로 전달하는 체외 전략을 제공합니다. 그런 다음 1차 지방세포 줄기세포는 키토산 미세구의 제제를 유화하고 회수합니다. 다음으로, 줄기세포를 키토산 미세구에 파종하고 8미크론 기공 크기의 멤브레인 배양 플레이트 인서트에서 배양하여 CS 로딩 CSM을 생성하고 최종적으로 마이크로스피어 전달 시스템과 3차원 콜라겐 겔 스캐폴드를 혼합합니다.

궁극적으로 이 CSM 시스템은 재생 의학 및 약물 전달에 사용할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 세포 주입 또는 마이크로 캡슐화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 운반체 물질에 부착되어 초기 적용 후에도 지속될 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 esan 미세구에 고유한 정전기가 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

그리고 마이크로스피어 베드 위에 세포를 로드하는 것은 세포를 방해하지 않고 도전적일 것입니다. 랩에서 회음부 및 표피 지방 조직을 절제 및 세척한 다음 조직을 다진 다음 1-2g을 1% FBS를 함유한 25ml의 HBSS로 옮깁니다. 원심분리 후, 자유 부유 지방 조직층을 125 밀리리터 삼각 플라스크에 모읍니다.

25ml의 콜라겐분해효소 유형 2를 추가하고 오비탈 쉐이커에서 반응을 배양합니다. 이제 오일과 지방층 아래의 액체 분획을 조심스럽게 제거하고 170미크론의 나일론 메쉬 필터를 통해 순차적으로 필터링합니다. 25 밀리리터로 두 번 세척 한 후 원심 분리로 세포를 수확합니다.

HBSS Resus, 펠릿을 30 밀리리터의 보충 된 mesen pro 성장 배지에 현탁시킵니다. 정제된 지방 유래 줄기세포를 2개의 T 75 배양 플라스크로 분할하고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 A SC 제제를 증폭합니다. 이 CSM 프로토콜은 이온 분자 기술을 사용하는 오일 유화 공정의 물입니다.

안정된 물과 오일 에멀젼에 1 시간 동안 반대 방향으로 오버 헤드 및 자기 교반을 동시에 사용하여 100 밀리리터의 유상 혼합물에 6 밀리리터의 키토산 수용액을 유화하고, 1.5 밀리리터의 1 % 수산화 칼륨을 4 시간 동안 15 분마다 1 옥탈에 첨가한다. 이온 가교 반응이 완료된 후 오일 상을 천천히 기울이고 즉시 100ml의 아세톤에 구체를 첨가합니다. 오일 상이 완전히 제거될 때까지 구체를 아세톤으로 세척합니다.

그런 다음 회수된 구체를 진공 상태에서 건조시킵니다. Desiccate는 입자 크기 분석기를 사용하여 밀리그램당 평균 CSM 입자 크기 표면적과 단위 입방 부피를 결정합니다. 잔류 염을 제거하기 위해 멸균수로 CSM을 세 번 세척하십시오.

이제 50 밀리리터 유리관에서 세포 실험에 사용하기 위해 CSM 제제를 절대 알코올로 살균하고, 5 밀리그램의 마이크로 스피어와 1 밀리리터의 0.5 % TNBS 용액을 혼합하여 섭씨 40 도에서 4 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 6 개의 일반 염산 3 밀리리터를 넣고 섭씨 60도에서 2 시간 동안 배양합니다. 샘플을 실온으로 냉각한 후 탈이온수 5ml와 Ethel Ether 10ml를 추가합니다.

유리 TNBS를 추출하려면 수성상의 5ml 분취액을 제거하고 수조에서 섭씨 40도까지 15분 동안 예열하여 주변 온도로 냉각한 후 잔류 에테르를 증발시킵니다. 분광 광도계로 15ml의 물로 희석합니다. TNBS를 블랭크로 사용하여 345나노미터에서 준비된 키토산 미세구의 흡광도를 측정합니다.

또한 CSM 제제에 사용되는 키토산을 측정합니다. 이제 키토산의 총 아미노 그룹 수에 상대적인 CSM의 자유 아미노 그룹 수를 계산합니다. 멸균된 CSM 5mg을 멸균 HBSS에서 하룻밤 동안 평형을 이룹니다.

CSM을 24웰 배양 플레이트를 위한 8미크론 멤브레인 인서트로 옮깁니다. CSM이 안정된 후 HBSS를 조심스럽게 흡인합니다. 이제 인서트 내부에 300마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 인서트 외부에 700마이크로리터의 성장 배지를 추가합니다. 소생.

지방 유래 줄기세포를 200마이크로리터의 성장, 배지 및 종자에 현탁시켜 배양판 내부의 CSM 위에 놓습니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에 24시간 동안 인큐베이트를 삽입합니다. SC가 로드된 CSM을 삽입 멤브레인으로 이동한 세포를 방해하지 않고 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

이제 잔류 배지를 제거하고 각 튜브에 250마이크로리터의 신선한 성장 배지를 추가합니다. MTT 용액 25마이크로리터를 5밀리리터 당 5mg씩 넣고 4시간 동안 배양합니다. 매체를 제거하고 250 마이크로 리터의 디메틸 황산화물 소용돌이를 첨가하여 5 분 동안 2, 700G의 CSM을 복합 원심 분리기로 용해시킵니다.

630나노미터를 기준으로 570나노미터에서 상등액 흡광도를 측정합니다. 알려진 수의 실행 가능한 A SC로부터 얻어진 흡광도값에 상대적인 CSM과 관련된 세포 수를 결정하기 위해 진행한다. 5밀리그램의 SC 로딩 CSM과 밀리리터당 7.5밀리그램을 혼합합니다. 쥐에서 추출한 1형 콜라겐.

꼬리 힘줄, 두 개의 일반 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.8로 조정하고 배양 플레이트에 붓습니다. 이제 세동섬유에 삽입하고 12웰 플레이트로 옮기고 30분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 격일로 콜라겐 A-S-C-C-S-M 젤의 배지를 계속 새로 고칩니다.

또한 표준 현미경 기술을 사용하여 CSM에서 겔로 세포를 모니터링, 방출 및 이동합니다. 다음 예는 키토산 미세구에서 지방 유래 줄기세포를 콜라겐 겔 골격으로 전달하는 시험관 내 전략을 설명합니다. SEM 및 TEM 이미지는 균일한 크기의 다공성 CSM의 준비를 나타냅니다.

1 차 지방이 많은 유래 줄기 세포를 가진 미세구의 외피는 4, CSM 칼슘 am의 밀리그램 당 000의 세포를 나타낸다. SC의 염색은 미세구의 다공성 틈새로 filopodia를 확장하면서 CSM에 퍼져 있음을 보여줍니다. 적재된 세포가 콜라겐 겔과 혼합되었을 때, 세포는 겔 속으로 이동하고 시간이 지남에 따라 추적될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 즉시 대량의 만성 조직 손실 치료로 확장됩니다. 그러나 이 치료 요법은 다양한 수준의 연조직 및 심장 조직 손실을 치료하는 데 사용되는 다양한 세포 및/또는 생체 재료와 통합할 수 있는 다재다능함으로 인해 훨씬 더 많은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법이 숙주 세포 전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을지 의심스럽습니다.

또한 주사제, 치료 약물 전달, 세포와 치료 약물을 함께 전달하는 하이브리드 시스템 개발과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.