루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.

이 절차의 전반적인 목표는 뿌리혹선충이 감염된 식물을 선별하는 것입니다. 먼저, 모래 토양 또는 재배 파우치에서 건강한 묘목을 성장시킵니다. 다음으로, 감염도가 높은 뿌리혹선충의 2기 유충 접종원을 준비합니다.

그 후 묘목에 적절히 접종하여 감염시킵니다. 마지막으로 숙주 뿌리 체계에서 선충 알 덩어리의 발달 정도를 평가합니다. 본 영상에서는 선충이 아닌 뿌리를 가진 식물의 고처리량 및 저처리량 스크리닝 방법을 시연하겠습니다.

고속 처리 시스템(high throughput system)의 주요 장점은 식물 성장에 필요한 공간이 제한적이며 감염 평가가 용이하다는 것입니다. 따라서 이러한 접근 방식은 재현 가능하고 균일한 감염, 즉 식물 뿌리의 선충 감염을 유도하여 식물의 기주 상태를 더 정확하게 평가할 수 있게 합니다. 일반적으로 선충을 이용한 뿌리 식물 평가 경험이 부족한 연구자들은 뿌리에 선충을 감염시킬 때 적절한 발달 단계를 사용하지 않아 어려움을 겪는 경우가 많습니다.

또한 일반적으로 감염력이 낮은 수일 된 감염기 2령 유충을 사용하여, 학부생과 대학원생에게 해당 절차를 시연할 것입니다. 본 실험실에서는 포트 시험을 위한 성장 파우치 내 스크리닝 절차를 시연하겠습니다. 유기물이 풍부한 Sunshine Mix와 같은 토양을 채운 단일 포트에 토마토 씨앗을 심고, 발아 후 온실 온도를 22 to 28 °C로 유지하십시오.

발아 약 2주 후, 본엽 2매 단계에서 miracle grow를 사용하여 일주일에 한 번 시비합니다. 개별 묘를 90%의 모래와 10%의 유기물로 구성된 멸균 사양토가 채워진 화분에 옮겨 심습니다. osmo coat 완효성 비료를 추가하고, 22~28 °C의 온실에서 2주 동안 유지합니다. 일주일에 한 번 miracle grow로 시비를 계속합니다.

고속 대량 스크리닝을 위해, 모래질 토양이 담긴 트레이에 종자를 직접 심습니다. 발아할 때까지 플라스틱 랩으로 덮고 앞서 설명한 대로 유지합니다. 발아 후에는 Osmo coat 완효성 비료를 추가하고 일주일에 한 번씩 Miracle-Gro로 시비합니다. 페트리 접시에 Kim White 페이퍼를 여러 겹 깔고 25~28°C의 인큐베이터에서 종자를 발아시킨 후, 묘를 개별 파우치로 옮깁니다.

또는, 종자를 종이 홈에 배치하여 개별 파우치에서 직접 발아하도록 합니다. 파우치를 플라스틱 걸이형 파일 폴더에 폴더당 일정 수량씩 넣고, 폴더를 랙에 수직 방향으로 배치합니다.

랙을 25~28°C의 온도와 16시간 광주기, 8시간 암주기가 유지되는 제어 환경 챔버에 넣습니다. 파종 후 약 10~14일 뒤부터 역삼투압수로 파우치에 하루 한두 번 물을 줍니다. 3차 뿌리 끝이 포함된 적절한 뿌리 시스템이 발달하면 유묘의 접종 준비가 완료된 것입니다. 알 추출을 시작하기 전, 오염을 방지하기 위해 작업 영역과 모든 도구를 뜨거운 물로 철저히 세척하십시오.

통과 용액을 수집하기 위해 싱크대에 버킷을 놓고, 그 위에 와이어 메쉬 지지대를 배치하십시오. 알이 25 micron 체에 수집될 수 있도록, 구멍 크기가 큰 순서대로 위에서 아래로 세 개의 체를 쌓으십시오. 감염된 식물의 윗부분을 잘라 주의 깊게 폐기하십시오.

화분에서 식물을 꺼내고 물이 가득 담긴 플라스틱 버킷에 담가 뿌리를 세척합니다. 흙 입자가 모두 씻겨 나갈 때까지 흐르는 물에 뿌리를 더 헹굽니다. 그런 다음 감염된 토마토 뿌리에서 뿌리혹선충 알을 추출합니다.

먼저 가위로 뿌리를 잘게 자르고 주근은 폐기합니다. 한 개체에서 얻은 잘게 자른 뿌리들을 뚜껑이 있는 큰 플라스틱 병에 넣고, 뿌리가 잠길 정도로만 10% 표백제 용액을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 병을 2분 동안 흔들어 줍니다.

병을 열고 뿌리를 상단 체에 부은 다음, 미스트 노즐이 연결된 호스로 세척하십시오. 표백제 냄새가 완전히 사라질 때까지 충분히 세척합니다. 이때 체가 막히는 것을 방지하기 위해 말렛으로 체의 측면을 가볍게 두드리십시오.

잠시 멈추고, 상단 체를 꺼내 잔해물을 헹굽니다. 두 번째 체도 마찬가지입니다. 두 번째 체를 꺼내어, 물병의 완만한 수류를 이용해 이전 체에서 내려온 알을 포함한 미세 잔해물을 수집합니다.

체 위에 쌓인 찌꺼기를 한쪽으로 밀어냅니다. 찌꺼기와 알을 최소량의 물이 든 깨끗한 비커에 모읍니다. 버킷에 모인 물을 25 micron 체에 걸러 혹시 빠져나갔을 수 있는 알을 모두 수집합니다.

물로 충분히 헹군 후 동일한 비커에 수집합니다. 깨끗한 금속 바스켓에 KimWipe 페이퍼를 몇 겹으로 깝니다. 유리 페트리 접시 위에 바스켓을 맞추어 배치하고, 바스켓 바닥과 접시 사이에 1cm의 간격을 둡니다.

추출된 선충 알을 종이 위에 붓습니다. 와이어 바스켓에 넣습니다. 와이어 바스켓의 바닥이 수면에 닿지만 물에 잠기지 않을 정도의 액체를 추가합니다.

매일 상단을 플라스틱 뚜껑으로 덮어 줍니다. 수분 증발 여부를 확인하고, 바스켓 바닥이 물에 닿을 수 있도록 페트리 접시에 물을 추가합니다. 6~8일 동안 격일로 알이 마르는 것을 방지하기 위해, 페트리 접시에서 2단계 유충(J2)이 포함된 물을 비커로 옮겨 수집합니다.

즉시 사용하지 않을 경우, 실험실 공기 공급 장치나 수족관 펌프로 생성된 공기를 사용하여 수집한 접종균을 실온에서 즉시 폭기하십시오. 다음 단계는 자석 교반기 위에서 접종균을 저속으로 교반하며 시작하십시오. 수집한 네마토드(nematodes)를 세 개의 분주량으로 나누어 사용하십시오.

회계 시 J twos의 수를 세기 위해 슬라이드나 디쉬에서 평균을 계산하고 접종에 필요한 희망 부피를 결정합니다. 이들은 현미경으로 관찰한 J twos입니다.

일반적으로 화분 재배 식물에는 개체당 3000 J twos를 사용하며, 육묘 트레이에서 grown된 식물에는 500 J twos를 사용합니다. 식물에 접종하기 전, 토양이 촉촉하되 너무 젖어 있지 않은지 확인하십시오. 화분 접종의 경우, 각 토마토 뿌리 시스템 주변의 모래에 화분 깊이의 약 절반 정도 되는 구멍 세 개를 뚫습니다.

연필을 사용하여, 파이펫으로 J twos를 세 개의 구멍에 주입함으로써 각 식물에 접종합니다. 그 후, 트레이에 담긴 고속 대량 스크리닝용 구멍들을 덮습니다. 5 mL 파이펫에 접착제로 고정한 측면에 구멍이 있는 변형된 밀봉 팁 니들을 사용하십시오.

피펫을 기울여 J2를 토양에 주입합니다. 식물을 온실에서 24 to 27 °C로 6 to 8주 동안 유지합니다. 한 달에 두 번 Miracle-Gro로 계속 시비합니다.

감염 여부를 평가하기 위해, 상단부를 자르고 식물을 화분에서 조심스럽게 꺼내 뿌리를 세척합니다. 그다음 뿌리를 1 mg/L 용액에 담가 알 덩어리를 파랗게 염색합니다.

15분 동안 공기 중 건조(Aerio glossing)를 수행합니다. 뿌리를 물로 헹구고 개별 뿌리 체계에서 염색된 알 덩어리의 수를 세어 평가합니다. 조명된 해부 현미경(death magnifier)을 사용하여 알 덩어리를 시각화하고, 이전에 설명한 대로 마그네틱 교반기 위에서 선충과 접종원을 세고 섞는 데 사용할 수 있습니다.

매달린 폴더에서 파우치를 꺼내 수평면에 놓습니다. 각 파우치에 5mL당 1,500마리의 J2를 접종합니다. 파우치의 플라스틱 덮개를 들어 올리고 뿌리 표면에 선충을 고르게 분산시킵니다.

접종 후 24시간 동안 빛을 차단하기 위해 암실지(dark paper)로 덮은 상태에서 파우치를 수평으로 유지하십시오. 그 후, 파우치를 성장 챔버 내의 물이 담긴 행잉 폴더(hanging folders)로 되돌려 놓으십시오. 비료에 대한 반응이 관찰될 때까지 약 3일 동안 하루에 한두 번 0.5배 농도의 Hoagland 용액을 식물에 공급하십시오.

일반적으로 잎의 녹색이 짙어지고 shoot 성장이 더욱 왕성해집니다. 3일 후, 파우치에 물을 주어 습윤 상태를 유지하십시오. 접종 후 약 30일이 지나면, 각 파우치에 75 milligrams liter 용액을 약 10 내지 20 milliliters 주입하십시오.

에어로 글로싱(Aero glossing). 파우치를 수평 상태로 유지하며 염료가 가득 찬 상태로 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 파우치의 액체를 따라내고 조명 데스크 아래에서 알 덩어리의 수를 세어 뿌리 체계를 평가합니다.

여기 확대된 이미지는 광범위하게 분포하여 파란색으로 염색된 알 덩어리가 있는, 심하게 감염된 토마토 식물의 뿌리를 보여줍니다. 트레이를 사용하면 좁은 생육 공간에서도 수백 개의 식물을 스크리닝할 수 있습니다. 생육 파우치를 사용하면 뿌리를 세척할 필요 없이 뿌리 상태와 선충 감염 여부를 빠르고 효율적으로 비파괴 평가할 수 있습니다.

이 방법은 또한 좁은 성장 공간에서 수천 개의 식물을 고처리량으로 스크리닝할 수 있게 합니다. 여기서는 접종 후 파우치에서 재배된 cow P 식물의 뿌리 체계에 청색으로 염색된 알 덩어리가 나타난 모습을 보여줍니다. 선충을 이용한 식물 분석에서는 감염 시점이 매우 중요합니다.

따라서 감염을 단 며칠만 지연시켜도 감염 수준이 매우 낮아질 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 뿌리혹선충으로 식물을 감염시키고 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 선충에 감염된 뿌리는 적절하게 처리해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

뿌리를 폐기하기 전에 오토클레이브로 멸균하면 선충의 확산을 제한할 수 있습니다. 또한, 고농도의 aerial glysine을 사용할 때 주의하십시오. 이는 발암성 물질입니다.

따라서 이 화학 물질을 조제할 때와 이 물질에 감염된 뿌리를 취급할 때 모두 반드시 장갑을 착용해야 합니다.