Name: 루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP. /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 배우세요 뿌리혹선충 Meloidogyne spp. 감염 식물의 고처리량 및 저처리량 선별 방법을. 이 기술은 식물 병리학 및 육종 프로그램에서 저항성 품종 개발을 위한 재현 가능한 감염 평가를 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kaloshian 연구실의 연구는 식량 농업의 미국 국립 연구소 (2007-35607-17765)에서 교부금에 의해 자금 지원을하고 있습니다. 로버츠 연구소의 연구는 국제 개발을위한 미국 기관에서 보조금 (GDG-G-00-02-00012-00 및 EDH--00-07-00005)과 캘리포니아 드라이 빈 자문위원회가 후원한다.

1. 냄비와 트레이에 토마토 묘목 성장 <ol><li> 위해 냄비 assays 같은 선샤인 믹스와 같은 유기 풍부한 토양에서 하나의 냄비에 공장 토마토 씨앗. 22-28에서 온실에서 유지 ° C. 발아 후 촉진제와 함께 일주일에 한 번씩 거름. </li><li> 약 2 주 발아 후 두 진정한 잎 단계에서, 90 %의 모래와 10 %의 유기 혼합을 포함하는 무균 모래 흙으로 가득 냄비 (10cm 직경과 깊이 17cm)에 개별적으로 묘목을 이식. 느린 릴리스 비료를 Osmocote 두 주 동안 22-28 ° C에서 온실에서 유지하는 추가합니다. 촉진제와 함께 일주일에 한 번씩 식물을 비옥하게하기 위해 계속합니다. </li><li> 높은 처리량 화면을 보려면 직접 모래 토양의 쟁반에있는 식물의 종자가 발아까지 플라스틱 랩과 트레이를 커버하고 위의 유지합니다. 발아 후, 느린 릴리즈 비료를 Osmocote 및 촉진제와 함께 일주일에 한 번은 비옥 추가합니다. </li></ol> 2. 묘목의 파우치에 Cowpea 성장 <ol><li> Seeds는 중, 배양 접시에있는 germinated Kimwipe 종이를 여러 레이어 줄지어 및 파우치에 홀로 전송 또는 파우치의 종이 홈에 직접 배치하고 germinated됩니다. </li><li> 폴더마다 플라스틱 교수형 파일 폴더, 두 파우치를 삽입하고, 수직 위치에있는 랙에 폴더를 배열합니다. 25-28의 온도 ° C와 16 H 라이트 / 8 H 어둠의 사이클에서 관리하고 통제된-환경 챔버에서 선반을 놓으십시오. 랙도 온실에서 유지하지만, 곰팡이 오염에 대한 가능성을 줄이기 위해, 호일이나 식물 줄기의 양쪽에 선반 위에 놓여 빳빳한 종이 커버를 요구할 수 있습니다. </li><li> 역삼투에 물을 한두 번 하루에 물은 파우치. 시딩 후 14-10 일 정도는 차 루트 도움말을 통해 적절한 루트 시스템이 개발되면 (그림 1), 묘목은 접종을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 3. 선충류의 달걀의 추출 전자의 추출감염된 뿌리에서 ggs은 Hussey와 바커 (1973)에 의해 개발된 프로토콜에서 수정됩니다. <ol><li> 3 ~ 사일 선충류의 접종 전에 감염된 토마토 뿌리에서 루트 매듭 선충류 달걀 압축을 풉니다. 계란 추출을 시작하기 전에 오염을 피하기 위해 뜨거운 물로 철저하게 작업 영역을 씻는다. 또한 뜨거운 물에 씻어 믹서기, 두 양동이, 와이어 메쉬 지원, 고무 망치, 425 세 sieves, 90 및 25 μm의 개구, 눈금 실린더와 가위. </li><li> 425, 90 및 25 μm의 개구 다음 순서로 위에서 아래까지 sieves를 스택. 계란은 하단에 25 μm의 정보 체에 수집됩니다. 싱크에서 지원 와이어 메쉬에 sieves 올려. 실행을 통해 솔루션을 수집하기 위해 철망 아래 양동이 놔. </li><li> inoculum의 원본으로 사용 감염된 식물 (들)의 꼭대기를 잘라, 그리고 버리고. 조심스럽게 화분에서 식물을 제거하십시오. 물이 가득 플라스틱 양동이에 수영으로 뿌리를 씻는다. 실행 아래에서 더욱 뿌리를 씻어토양 입자가 뿌리로부터 씻겨 때까지 물을 닝. </li><li> 작은 조각으로 가위로 뿌리를 잘라. 직근 처분. </li><li> 뚜껑이있는 커다란 플라스틱 항아리에서 단일 공장에서 다진 뿌리를 넣어 뿌리를 덮어 뚜껑을 닫습 충분 10 % 표백제 솔루션을 추가합니다. </li><li> 2 분에 대한 뿌리가 들어있는 항아리를 흔들어. </li><li> 항아리를 열고 맨 체를 향해 뿌리를 기름을 붓고 피부 노즐에 연결된 호스로 씻는다. 모든 표백제 냄새가 사라질 때까지 잘 씻는다. 체의 모공을 막힘 방지하기 sieves의 측면을 생략하고 망치를 사용하십시오. </li><li> 상단 체를 제거하고 두 번째 체의 파편을 린스. </li><li> 두 번째 체를 제거하고 마지막 체에서 계란을 포함 미세 파편을 수집합니다. 물통에서 완만한 스트림으로 체 중 한쪽으로 파편을 이동합니다. 물의 최소 금액과 깨끗한 비커에 파편과 계란을 수집합니다. </li><li> 체에 한 번 더 물은에서 수집한탈출 수있는 모든 계란을 수집하기 위해 25 μm의 정보 체를 통해 버킷. 물로 잘 씻어과 같은 비이커에 수집합니다. </li><li> 맨 체에서 식물 파편을 취소하고 가압 물로 깨끗이 세 sieves 씻는다. 그것은 기공 크기를 왜곡 수 있으므로 sieves의 메쉬 부분을 만지지 마십시오. </li></ol> 4. 부화 선충류의 계란 <ol><li> 라인은 깨끗한 금속 Kimwipe 종이를 몇 가지 레이어가있는 바구니와 유리 페트리 접시에 잘 맞습니다. 바구니와 접시의 바닥 사이에 1 cm 거리를 허용합니다. </li><li> 와이어 바구니에 종이쪽으로 추출 선충류 달걀을 붓고. 철사 바구니의 바닥이 물 표면을 만지는하지만 물속에 포장되어 있지 않도록 충분한 액체를 추가합니다. 플라스틱 뚜껑으로 상단을 커버. </li><li> 매일 물의 증발을 확인하고 바구니의 바닥은 물이 닿으 있도록 페트리 접시에 물을 추가합니다. 이것은 밖으로 건조에서 계란을 방지할 수 있습니다. </li><li> 격일로, 구미시를 수집비커에 페트리 접시에서 J2s을 포함 ter. 즉시 사용하지 않을 경우, 수족관 펌프에 의해 생성된 실험실 공기 공급 장치 또는 공기를 사용하여 실온에서 수집한 inoculum를 공기에 쐬다. 2 일 이내 aerated inoculum을 사용합니다. J2s은 6-8일 걸쳐 설정 부화에서 수집한 수 있습니다. </li></ol> 5. 냄비 또는 트레이와 감염에 대한 평가에서 토마토 루트 감염 <ol><li> 계수 슬라이드 또는 접시에 J2s의 수를 세어 수집 nematodes 세 aliquots를 사용하여 평균을 계산하고 접종에 대해 원하는 볼륨을 결정합니다. 일반적으로 3,000 J2s은 냄비와 묘목 트레이 재배 식물 500 J2s에 공장 당 사용됩니다. </li><li> 낮은 속도로 자기 저어 접시 inoculum를 저어. </li><li> 당신이 식물을 접종하기 전에 토양이 습한지만, 너무 무리하지 않았는지 확인합니다. 냄비 접종의 경우 (그림 2 연필을 사용하여 각 토마토 루트 시스템 주변 모래 사장에 대한 반 냄비 깊이의 세 구멍을 </강한&gt;). 피펫을 사용하여 세 개의 구멍에 J2s를 전달하여 각 식물의 예방. 그 후 구멍을 포괄합니다. </li><li> 트레이의 높은 처리량 화면의 경우 토양에 J2s를 제공하는 pipetter 따라 5 ML 피펫 팁 (그림 3)에 붙어 양쪽에 구멍 수정된 봉인된 팁 바늘을 사용합니다. 또는 nematodes는 단계 5.3에서와 같이 전달할 수 있습니다. </li><li> 24-27에서 온실에서 식물을 유지 ° C 6~8주입니다. 촉진제로 회 비옥하게하기 위해 계속합니다. </li><li> 감염의 평가 내용은 조심스럽게 화분에서 식물을 제거하고 뿌리를 (같은 단계 3.3에서 설명) 씻는다. </li><li> 15 분 동안, 1 MG / L erioglaucine에 뿌리를 잠수함이 잠수하여 청색 계란 대중을 청바지. </li><li> 물속에 뿌리를 씻어 및 개별 루트 시스템의 스테인드 계란 질량을 계산하여 평가합니다. 조명 데스크 확대경은 계란 대중을 시각화하기 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 스크린 식물이 더 g 필요한 경우enetic 연구, 평가에 대한 뿌리를 세척하기 전에 꼭대기를 잘라하지 않습니다. 계란 대중을 더럽히는 것과 집계 후 온실에서 유기 토양에 묘목을 이식 증산을 줄이기 위해 크게 꼭대기를 치다 및 유지. </li></ol> 6. 파우치 및 감염의 평가에 Cowpea 루트 감염 <ol><li> 선충류의 inoculum 백작과 앞에서 설명한대로 자기 저어 접시에 저어. </li><li> 수평 표면에 매달려 폴더와 장소에서 파우치를 제거합니다. 5 ML 1500 J2s 각 주머니의 예방. 주머니의 플라스틱 커버를 들고 뿌리의 표면 위에 균일하게 nematodes을 배포합니다. </li><li> 빛을 제외 어두운 종이로 덮여 접종 후 24 H에 대한 수평 위치에 파우치 보관 후 성장 챔버에 매달려 폴더로 돌아갑니다. </li><li> 표 1; 절반 강도 Hoagland의 솔루션 (Hoagland &amp; Arnon 1950 년 함께 한 두 번 매일 필요에 따라 물이 식물, </강한&gt;) 비료에 대한 반응이 관찰 때까지 일반적으로 향상된 단풍의 녹화 등 활발한 촬영 성장. 보통 식물은 연속 반 강도 Hoagland 삼일로 물이나됩니다. 그 후 물을 파우치가 촉촉한 유지. </li><li> 약 30 일 (범위 28~35일) 접종 후, 75 MG / L erioglaucine의 10-20에 대한 ML 각 주머니를 불어 넣다. 하룻밤 수평 위치에 색소 과다 분비 파우치 보관하십시오. </li><li> 파우치를 분출과 조명 책상 확대경 아래에 계란 질량을 계산하여 루트 시스템을 평가합니다. </li><li> 스크린 식물이 더 유전 연구 또는 번식 작업에 필요한 경우에는 신중하게 온실에서 화분에서 유기농 토양에서 종이, 이식에서 뿌리를 꺼내 유지. </li></ol> 7. 대표 결과 설명한 두 시스템에 대한 선충류 예방 접종을위한 토마토와 cowpea 식물의 적절한 단계는 그림에 표시됩니다1과 2. 또한, 토마토와 cowpea의 잘 감염된 뿌리의 예제는 그림 4와 5에 표시됩니다. 대부분의 질병 저항 화면에서와 마찬가지로, 그것은 감​​염 속도의 평균을 계산하는 선충류의 접종에 대한 유전자형 당 적어도 6-10 식물을 사용하는 것이 좋습니다. 식물 사이의 선충류 감염의 변동은 동일한 유전자형으로 인해 균일한 식물의 크기와 정확한 금액과 inoculum의 전달을 사용하여 줄일 수 있습니다. 쟁반과 성장 파우치의 사용은 작은 성장 공간에서 식물의 수천 수백의 심사를 가능하게합니다. 성장 파우치도 닦고 뿌리 (그림 4)에 대한 필요성과 루트 매듭 선충류 감염의 신속하고 효율적인 비파괴 평가를 허용합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> 그림 1. 두 주간 된 cowpea 공장 주머니 재배 및 루트 - 매듭 NEMA 준비접종 tode. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> 그림 루트 - 매듭 선충류의 접종에 대해 2. 세 주일 오래된 토마토 공장 준비 완료. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> 그림 3. nematodes의 높은 처리량 접종에 사용되는 수정 바늘과 피펫 팁. 바늘의 아래쪽은 봉인되어 구멍이 세 가지 세트는 레이저 빔을 이용하여 바늘로 뚫고 있었다. 그런 다음 수정된 바늘은 5 ML 피펫 팁에 붙어되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> 그림 4. 루트 - 매듭 nematodes에 감염된 토마토 루트 시스템. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> 그림 5. 30 일 이후의 접종에서 재배 erioglaucine 물들일 계란 대중과 cowpea 루트 시스템28 ° C.

<ol><li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li>
<li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Circ%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li>
<li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.%2C+including+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li>
<li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li>
<li>Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatkin%2C+OA+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Manual%22">Calif. Agric. Exp. Stn. Manual</a>. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).</li>
<li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li>
<li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li>
<li>Perry, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+RN+%22Root-Knot+Nematodes%22">Root-Knot Nematodes</a>. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).</li>
<li>Starr, J. L., Cook, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStarr%2C+JL+%22Resistance+to+Parasitic+Nematodes%22">Resistance to Parasitic Nematodes</a>. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

고도로 infective의 inoculum과 적절한 발달 단계에서 식물 사용의 준비 : 성공적으로 선충류 화면의 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 루트 매듭 선충류 달걀의 부화 비율은 5 사이의 높은 변수 및 범위는 - 50 %. 따라서 해치와 고도로 infective의 J2s의 최적 수준을 얻기 위해, 가까운주의 계란 추출 및 부화 절차에 지불되어야합니다. 달걀은 최소한의 기간 동안 표백제에 노출되어야하며 표백제를 루트 혼합물에서 잘 씻어서 아웃해야합니다. 언제 부화 계란, 계란을 포함하는 슬러리는 물속에 잠수해서는 안됩니다. 또한, 부화 점이 수집되는 기본 페트리 접시에 계란을 흘리게하지 마십시오. 부화 과정에서 달걀을 흘리고 피하는 방법 중 하나는 종이 깰 수도로 Kimwipe에 직접 물을 추가하지 않는 것입니다. 대신 배양 접시에 직접 물을 추가합니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 부화 J2s을 사용합니다. 만약 hatcH 속도가 낮은 많은 inoculum이 필요, J2s는 더 이상 기간 동안 15 ° C에서 저장할 수 있습니다. 접종 이전 nematodes를 재생 상온에 보관 inoculum을 따뜻하게. 그러나, 심지어는 15 연장 기간 동안 J2s를 저장하지 ° C에서 굶주린 J2s 효율적으로 감염하지 않습니다. 어린 모종은 뿌리 - 매듭 선충류의 접종위한 최상의 발달 단계입니다. 그러나이 J2s에 대한 진입 점으로 루트 팁 충분한 숫자를 제공하는 적절한 루트 시스템의 형성과 균형 있어야합니다. 최적의 식물의 성장 상태를 유지하면 화면에 중요합니다. 특별히 파우치 재배 이들을 이상을 돋구는 식물을 피하십시오. 파우치를 과잉 물을 같은 곰팡이의 성장을 촉진하고 뿌리 건강을 축소 수 파우치의 바닥에 물을 서로 표시. assays 추가 선충류 감염의 평가와 계란 / 뿌리 시스템과 달걀의 개수의 계산 모두와 / g fre의쉬 루트가 수행할 수 있습니다. 토마토 assays 경우, 각각의 뿌리는 무게 있으며 추출한 계란은 inoculum 준비 (섹션 3)에 대해 설명했다. 식물 샘플 수의 처리하면 개별 루트 시스템은 계란 추출을위한 믹서를 사용하여 분해 수 있습니다. 계란의 수는 적어도 세 aliquots에 포함하고 신선한 뿌리 시스템의 계란 / g이 계산되어야한다. 주머니 assays 들어, 루트 시스템은 종이 삽입을 해봤 무게, 달걀이 추출됩니다.

루트 - 매듭 nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 meloidogyne spp.</em

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

루트 - 매듭 nematodes가 (속 Meloidogyne) 고맙게 여기게 식물 기생충입니다. 그들은 매우 polyphagous하고 가장 경제적으로 중요한 식물 기생 nematodes 중 하나로 간주됩니다. 계란에 한번 molted 미세한 두 번째 단계는 청소년 (J2)는, infective 단계입니다. J2s는 계란에서 부화 물을 필름 내에 토양에서 자유롭게 이동하고, 적합한 식물 종의 루트 도움말을 찾습니다. 그들이 먹이 사이트를 구축하고 stylets를 사용하여 먹이를 시작할 위치를 식물 뿌리를 관통 후, 그들은 혈관 실린더으로 마이 그 레이션. 다세포 먹이 사이트는 cytokinesis없이 karyokinesis을 (유사 분열을 반복) 받았습니다 세포에서 형성되는 &#39;거대 세포&#39;라 불리는 몇몇 확대 multinuclear 세포 구성되어 있습니다. 이웃 pericycle 세포는 분열과 크기가 일반적인 담즙 또는 루트 매듭, 루트 매듭 선충류 감염의 특징적인 증상을 유발 해주 확대. 일단 수유가 시작되면 J2s는 정주의 및 취소 될성인이 될 세 개의 추가 molts을 dergo. 성인 여성은 루트의 표면이나 아래에 젤라틴 매트릭스에 150-250 알을 낳는. 계란에서 새로운 infective의 J2s 까기 새로운 사이클을 시작합니다. 루트 매듭 선충류 수명주기는 26-28에서 4~6주에 완료됩니다 ° C. 여기 루트 매듭 nematodes 및 높은 처리량 assays를위한 두 가지 방법과 화분 재배 식물, 감염 전통적인 프로토콜을 소개합니다. 두 번째는 그러한 cowpea 및 일반 콩 같은 대형 씨앗과 식물에 대한 반면 첫 번째 높은 처리량 방법은 같은 토마토와 같은 작은 씨앗과 식물에 사용됩니다. 대형 씨앗은 최소한의 영양 보충과 확장 묘목의 성장을 지원합니다. 첫 번째 높은 처리량 분석은 두 번째 분석 식물에서 토양의 부재에있는 파우치 재배하는 동안 트레이에 모래 재배 모종을 활용합니다. 묘목의 성장 주머니는 씨앗이나 모종이 배치되는 2-CM-깊이 여물을 형성 상단에 접혀, 15.5 X 12.5cm 종이 심지로 만들어졌다.종이 심지는 투명 비닐 주머니 안에 들어 있습니다. 이러한 성장 파우치는 투명 주머니의 표면 아래 뿌리와 달걀 대량 생산의 갤링 선충류 감염 증상의 직접 관찰하실 수 있습니다. 두 가지 방법은 생산을 건너거나 씨앗에 대해 phenotyping 후, 스크린 식물의 사용을 허용합니다. 파우치가 랙에 배치 플라스틱 걸려 폴더에 저장되기 때문에 성장 파우치의 사용으로 추가적인 장점은 작은 공간 요구 사항입니다.

루트 매듭 nematodes있는 화면 식물 별개의 두 가지 방법이 설명되어 있습니다. 설명한 방법은 번식 프로그램에서 이러한 식물의 이용을 촉진 비파괴 방식으로 nematodes과 높은 처리량 화면을 포함합니다.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.</em

뿌리혹선충(Meloidogyne 속)은 절대성 식물 기생충입니다. 이들은 매우 광범위한 기주 식물 범위를 가지며, 경제적으로 가장 중요한...

이 절차의 전반적인 목표는 뿌리혹선충이 감염된 식물을 선별하는 것입니다. 먼저, 모래 토양 또는 재배 파우치에서 건강한 묘목을 성장시킵니다. 다음으로, 감염도가 높은 뿌리혹선충의 2기 유충 접종원을 준비합니다.그 후 묘목에 적절히 접종하여 감염시킵니다. 마지막으로 숙주 뿌리 체계에서 선충 알 덩어리의 발달 정도를 평가합니다. 본 영상에서는 선충이 아닌 뿌리를 가진 식물의 고처리량 및 저처리량 스크리닝 방법을 시연하겠습니다.고속 처리 시스템(high throughput system)의 주요 장점은 식물 성장에 필요한 공간이 제한적이며 감염 평가가 용이하다는 것입니다. 따라서 이러한 접근 방식은 재현 가능하고 균일한 감염, 즉 식물 뿌리의 선충 감염을 유도하여 식물의 기주 상태를 더 정확하게 평가할 수 있게 합니다. 일반적으로 선충을 이용한 뿌리 식물 평가 경험이 부족한 연구자들은 뿌리에 선충을 감염시킬 때 적절한 발달 단계를 사용하지 않아 어려움을 겪는 경우가 많습니다.또한 일반적으로 감염력이 낮은 수일 된 감염기 2령 유충을 사용하여, 학부생과 대학원생에게 해당 절차를 시연할 것입니다. 본 실험실에서는 포트 시험을 위한 성장 파우치 내 스크리닝 절차를 시연하겠습니다. 유기물이 풍부한 Sunshine Mix와 같은 토양을 채운 단일 포트에 토마토 씨앗을 심고, 발아 후 온실 온도를 22 to 28 °C로 유지하십시오.발아 약 2주 후, 본엽 2매 단계에서 miracle grow를 사용하여 일주일에 한 번 시비합니다. 개별 묘를 90%의 모래와 10%의 유기물로 구성된 멸균 사양토가 채워진 화분에 옮겨 심습니다. osmo coat 완효성 비료를 추가하고, 22~28 °C의 온실에서 2주 동안 유지합니다. 일주일에 한 번 miracle grow로 시비를 계속합니다.고속 대량 스크리닝을 위해, 모래질 토양이 담긴 트레이에 종자를 직접 심습니다. 발아할 때까지 플라스틱 랩으로 덮고 앞서 설명한 대로 유지합니다. 발아 후에는 Osmo coat 완효성 비료를 추가하고 일주일에 한 번씩 Miracle-Gro로 시비합니다. 페트리 접시에 Kim White 페이퍼를 여러 겹 깔고 25~28°C의 인큐베이터에서 종자를 발아시킨 후, 묘를 개별 파우치로 옮깁니다.또는, 종자를 종이 홈에 배치하여 개별 파우치에서 직접 발아하도록 합니다. 파우치를 플라스틱 걸이형 파일 폴더에 폴더당 일정 수량씩 넣고, 폴더를 랙에 수직 방향으로 배치합니다.랙을 25~28°C의 온도와 16시간 광주기, 8시간 암주기가 유지되는 제어 환경 챔버에 넣습니다. 파종 후 약 10~14일 뒤부터 역삼투압수로 파우치에 하루 한두 번 물을 줍니다. 3차 뿌리 끝이 포함된 적절한 뿌리 시스템이 발달하면 유묘의 접종 준비가 완료된 것입니다. 알 추출을 시작하기 전, 오염을 방지하기 위해 작업 영역과 모든 도구를 뜨거운 물로 철저히 세척하십시오.통과 용액을 수집하기 위해 싱크대에 버킷을 놓고, 그 위에 와이어 메쉬 지지대를 배치하십시오. 알이 25 micron 체에 수집될 수 있도록, 구멍 크기가 큰 순서대로 위에서 아래로 세 개의 체를 쌓으십시오. 감염된 식물의 윗부분을 잘라 주의 깊게 폐기하십시오.화분에서 식물을 꺼내고 물이 가득 담긴 플라스틱 버킷에 담가 뿌리를 세척합니다. 흙 입자가 모두 씻겨 나갈 때까지 흐르는 물에 뿌리를 더 헹굽니다. 그런 다음 감염된 토마토 뿌리에서 뿌리혹선충 알을 추출합니다.먼저 가위로 뿌리를 잘게 자르고 주근은 폐기합니다. 한 개체에서 얻은 잘게 자른 뿌리들을 뚜껑이 있는 큰 플라스틱 병에 넣고, 뿌리가 잠길 정도로만 10% 표백제 용액을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 병을 2분 동안 흔들어 줍니다.병을 열고 뿌리를 상단 체에 부은 다음, 미스트 노즐이 연결된 호스로 세척하십시오. 표백제 냄새가 완전히 사라질 때까지 충분히 세척합니다. 이때 체가 막히는 것을 방지하기 위해 말렛으로 체의 측면을 가볍게 두드리십시오.잠시 멈추고, 상단 체를 꺼내 잔해물을 헹굽니다. 두 번째 체도 마찬가지입니다. 두 번째 체를 꺼내어, 물병의 완만한 수류를 이용해 이전 체에서 내려온 알을 포함한 미세 잔해물을 수집합니다.체 위에 쌓인 찌꺼기를 한쪽으로 밀어냅니다. 찌꺼기와 알을 최소량의 물이 든 깨끗한 비커에 모읍니다. 버킷에 모인 물을 25 micron 체에 걸러 혹시 빠져나갔을 수 있는 알을 모두 수집합니다.물로 충분히 헹군 후 동일한 비커에 수집합니다. 깨끗한 금속 바스켓에 KimWipe 페이퍼를 몇 겹으로 깝니다. 유리 페트리 접시 위에 바스켓을 맞추어 배치하고, 바스켓 바닥과 접시 사이에 1cm의 간격을 둡니다.추출된 선충 알을 종이 위에 붓습니다. 와이어 바스켓에 넣습니다. 와이어 바스켓의 바닥이 수면에 닿지만 물에 잠기지 않을 정도의 액체를 추가합니다.매일 상단을 플라스틱 뚜껑으로 덮어 줍니다. 수분 증발 여부를 확인하고, 바스켓 바닥이 물에 닿을 수 있도록 페트리 접시에 물을 추가합니다. 6~8일 동안 격일로 알이 마르는 것을 방지하기 위해, 페트리 접시에서 2단계 유충(J2)이 포함된 물을 비커로 옮겨 수집합니다.즉시 사용하지 않을 경우, 실험실 공기 공급 장치나 수족관 펌프로 생성된 공기를 사용하여 수집한 접종균을 실온에서 즉시 폭기하십시오. 다음 단계는 자석 교반기 위에서 접종균을 저속으로 교반하며 시작하십시오. 수집한 네마토드(nematodes)를 세 개의 분주량으로 나누어 사용하십시오.회계 시 J twos의 수를 세기 위해 슬라이드나 디쉬에서 평균을 계산하고 접종에 필요한 희망 부피를 결정합니다. 이들은 현미경으로 관찰한 J twos입니다.일반적으로 화분 재배 식물에는 개체당 3000 J twos를 사용하며, 육묘 트레이에서 grown된 식물에는 500 J twos를 사용합니다. 식물에 접종하기 전, 토양이 촉촉하되 너무 젖어 있지 않은지 확인하십시오. 화분 접종의 경우, 각 토마토 뿌리 시스템 주변의 모래에 화분 깊이의 약 절반 정도 되는 구멍 세 개를 뚫습니다.연필을 사용하여, 파이펫으로 J twos를 세 개의 구멍에 주입함으로써 각 식물에 접종합니다. 그 후, 트레이에 담긴 고속 대량 스크리닝용 구멍들을 덮습니다. 5 mL 파이펫에 접착제로 고정한 측면에 구멍이 있는 변형된 밀봉 팁 니들을 사용하십시오.피펫을 기울여 J2를 토양에 주입합니다. 식물을 온실에서 24 to 27 °C로 6 to 8주 동안 유지합니다. 한 달에 두 번 Miracle-Gro로 계속 시비합니다.감염 여부를 평가하기 위해, 상단부를 자르고 식물을 화분에서 조심스럽게 꺼내 뿌리를 세척합니다. 그다음 뿌리를 1 mg/L 용액에 담가 알 덩어리를 파랗게 염색합니다.15분 동안 공기 중 건조(Aerio glossing)를 수행합니다. 뿌리를 물로 헹구고 개별 뿌리 체계에서 염색된 알 덩어리의 수를 세어 평가합니다. 조명된 해부 현미경(death magnifier)을 사용하여 알 덩어리를 시각화하고, 이전에 설명한 대로 마그네틱 교반기 위에서 선충과 접종원을 세고 섞는 데 사용할 수 있습니다.매달린 폴더에서 파우치를 꺼내 수평면에 놓습니다. 각 파우치에 5mL당 1,500마리의 J2를 접종합니다. 파우치의 플라스틱 덮개를 들어 올리고 뿌리 표면에 선충을 고르게 분산시킵니다.접종 후 24시간 동안 빛을 차단하기 위해 암실지(dark paper)로 덮은 상태에서 파우치를 수평으로 유지하십시오. 그 후, 파우치를 성장 챔버 내의 물이 담긴 행잉 폴더(hanging folders)로 되돌려 놓으십시오. 비료에 대한 반응이 관찰될 때까지 약 3일 동안 하루에 한두 번 0.5배 농도의 Hoagland 용액을 식물에 공급하십시오.일반적으로 잎의 녹색이 짙어지고 shoot 성장이 더욱 왕성해집니다. 3일 후, 파우치에 물을 주어 습윤 상태를 유지하십시오. 접종 후 약 30일이 지나면, 각 파우치에 75 milligrams liter 용액을 약 10 내지 20 milliliters 주입하십시오.에어로 글로싱(Aero glossing). 파우치를 수평 상태로 유지하며 염료가 가득 찬 상태로 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 파우치의 액체를 따라내고 조명 데스크 아래에서 알 덩어리의 수를 세어 뿌리 체계를 평가합니다.여기 확대된 이미지는 광범위하게 분포하여 파란색으로 염색된 알 덩어리가 있는, 심하게 감염된 토마토 식물의 뿌리를 보여줍니다. 트레이를 사용하면 좁은 생육 공간에서도 수백 개의 식물을 스크리닝할 수 있습니다. 생육 파우치를 사용하면 뿌리를 세척할 필요 없이 뿌리 상태와 선충 감염 여부를 빠르고 효율적으로 비파괴 평가할 수 있습니다.이 방법은 또한 좁은 성장 공간에서 수천 개의 식물을 고처리량으로 스크리닝할 수 있게 합니다. 여기서는 접종 후 파우치에서 재배된 cow P 식물의 뿌리 체계에 청색으로 염색된 알 덩어리가 나타난 모습을 보여줍니다. 선충을 이용한 식물 분석에서는 감염 시점이 매우 중요합니다.따라서 감염을 단 며칠만 지연시켜도 감염 수준이 매우 낮아질 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 뿌리혹선충으로 식물을 감염시키고 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 선충에 감염된 뿌리는 적절하게 처리해야 한다는 점을 잊지 마십시오.뿌리를 폐기하기 전에 오토클레이브로 멸균하면 선충의 확산을 제한할 수 있습니다. 또한, 고농도의 aerial glysine을 사용할 때 주의하십시오. 이는 발암성 물질입니다.따라서 이 화학 물질을 조제할 때와 이 물질에 감염된 뿌리를 취급할 때 모두 반드시 장갑을 착용해야 합니다.

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

이 비디오에서는 선충에 대한 저분자 선충제의 효능을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 시연합니다. 선충제는 노출 후 샘플에서 이동성 선충의 수를 감소시키는 경우 효과적인 것으로 간주됩니다.

Small Molecule Nematicides 스크리닝 분석: Ditylenchus dipsaci 에 대한 잠재적 선충제를 스크리닝하는 중간 처리량 방법

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

여기서, 레니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형의 신속한 비파괴 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시된다. 프로토콜은 감염 반응을 결정하기 위하여 선충 감염한 면 묘목의 뿌리를 시각적으로 검토하는 관련시킵니다. 각 식물에서 식물 싹은 다음 종자 생산을위한 식물을 복구하기 위해 전파된다.

르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형 검열

이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

본 프로토콜은 Ditylenchus dipsaci를 배양, 수집 및 스크리닝하기 위한 안정적이고 간단한 방법을 기술한다.

식물 기생 선충류 Ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

우리는 농부들이 생물 살충제로서 곤충병원성 선충을 대량 번식하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 선충 배양 기질로 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하고, 두 번째 방법은 폴리머 코팅된 면모를 배양 기질로 사용합니다. 두 방법 모두 곤충 시체 내에서 선충을 생 체 내에서 전파하는 데 의존합니다.

곤충병원성 선충의 재배자 기반 생체 내 전파

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

배우세요 뿌리혹선충 Meloidogyne spp. 감염 식물의 고처리량 및 저처리량 선별 방법을. 이 기술은 식물 병리학 및 육종 프로그램에서 저항성 품종 개발을 위한 재현 가능한 감염 평가를 가능하게 합니다.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.

더 많은 동영상 탐색