JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Free Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.

Full Text

28,328 Views

11:46 min

March 12, 2012

DOI: 10.3791/3629-v

Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology,University of California, Riverside

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

루트 매듭 nematodes있는 화면 식물 별개의 두 가지 방법이 설명되어 있습니다. 설명한 방법은 번식 프로그램에서 이러한 식물의 이용을 촉진 비파괴 방식으로 nematodes과 높은 처리량 화면을 포함합니다.

Transcript

이 절차의 전반적인 목표는 뿌리혹선충에 감염된 식물을 선별하는 것입니다. 먼저 모래 토양이나 성장 주머니에서 건강한 묘목을 키웁니다. 다음으로, 선충이 아닌 뿌리의 감염률이 높은 2단계 청소년의 접종물을 생산합니다.

그런 다음 묘목을 적절하게 접종하고 감염시킵니다. 마지막으로 숙주 뿌리 시스템에서 선충 알 덩어리의 발달을 평가합니다. 우리는 선충이 아닌 뿌리가 있는 식물의 고처리량 및 저처리량 스크린을 시연할 것입니다.

그리고 고처리량 시스템의 주요 장점은 식물 성장을 위한 공간이 제한되어 있고 감염을 쉽게 평가할 수 있다는 것입니다. 따라서 이러한 접근 방식은 재현 가능하고 균일한 감염, 식물 뿌리의 선충 감염으로 이어지며 따라서 식물의 숙주 상태를 더 잘 평가할 수 있습니다. 따라서 일반적으로 선충이 아닌 뿌리가 있는 식물을 처음 평가하는 개인은 뿌리를 선충으로 감염시키기 위해 적절한 발달 단계를 사용하지 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

또한 일반적으로 감염력이 낮은 며칠 된 감염 단계 청소년을 사용하여 절차를 시연하는 것은 atian과 대학원생을 포옹하는 것입니다. 제 실험실에서는 냄비 분석을 위해 성장 파우치에서 스크리닝하는 절차를 시연할 것입니다. 선샤인 믹스와 같은 유기농이 풍부한 토양으로 채워진 단일 화분에 토마토 씨앗을 심고 발아 후 온실을 섭씨 22-28도로 유지합니다.

일주일에 한 번 기적과 함께 두 개의 진정한 잎 단계에서 발아 후 약 2 주 후에 개별 묘목을 멸균 모래 토양, 90 % 모래 및 10 % 유기물로 채워진 화분에 이식합니다. 오즈모 코트 서방성 비료를 추가하고 섭씨 22-28도의 온실에서 2주 동안 유지합니다. 기적의 성장으로 일주일에 한 번 비료를 계속 주십시오.

처리량이 많은 스크린의 경우 모래 토양의 트레이에 씨앗을 직접 심습니다. 발아할 때까지 플라스틱 랩으로 덮고 앞에서 설명한 대로 유지하십시오. 발아 후 Osmo coats, 서방형 비료를 추가하고 일주일에 한 번 인큐베이터에서 유지되는 여러 겹의 Kim White paper가 늘어선 페트리 접시에 기적의 성장 발아 씨앗을 25-28°C로 비료한 다음 묘목을 개별 파우치로 옮깁니다.

또는 종이 홈에 씨앗을 넣어 개별 파우치에서 직접 발아할 수 있습니다. 파우치를 플라스틱 걸이 파일 폴더에 폴더별로 놓고 랙에 폴더를 정렬합니다. 수직 위치에서.

랙을 섭씨 25-28도의 온도와 16시간 빛으로 유지되는 통제된 환경의 챔버에 놓습니다. 8 시간 다크 사이클 물, 하루에 한 번 또는 두 번 파우치에 물을 주며 파종 후 약 10-14 일 후에 반전 모시스 물을 뿌립니다. 3차 뿌리 끝이 있는 적절한 뿌리 시스템이 개발되면 묘목은 접종할 준비가 된 것입니다 계란 추출을 시작하기 전에 오염을 방지하기 위해 작업 영역과 모든 도구를 뜨거운 물로 철저히 세척하십시오.

싱크대에 양동이를 놓아 모으고, 용액을 통과하고, 상단에 철망 지지대를 놓습니다. 조리개 크기가 줄어드는 순서대로 3개의 체를 위에서 아래로 쌓아 계란이 25미크론 체에 모이도록 합니다. 감염된 식물의 윗부분을 자르고 조심스럽게 버리십시오.

화분에서 식물을 제거하고 물을 가득 채운 플라스틱 양동이에 담궈 뿌리를 씻습니다. 토양 입자가 씻겨 나갈 때까지 흐르는 물에 뿌리를 더 헹굽니다. 그런 다음 감염된 토마토 뿌리에서 뿌리 매듭 선충 알을 추출합니다.

먼저 탭 뿌리를 가위로 잘라 뿌리를 처분합니다. 뚜껑이 있는 큰 플라스틱 병에 단일 식물의 잘게 썬 뿌리를 넣고 뿌리를 덮을 만큼만 10% 표백제 용액을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 병을 2분 동안 흔듭니다.

항아리를 열고 뿌리를 상단 체에 붓고 분무 노즐 세척에 연결된 호스로 세척하십시오. 표백제 냄새가 모두 사라질 때까지. 그리고 체가 막히지 않도록 망치를 사용하여 체의 측면을 두드리십시오.

일시 중지하고 상단 체를 제거하고 이물질을 헹굽니다. 그리고 두 번째 체. 두 번째 체를 제거하고 물병에서 부드러운 흐름으로 마지막 체의 계란을 포함하는 미세한 파편을 모으십시오.

부스러기를 체의 한쪽으로 옮깁니다. 최소한의 물과 함께 깨끗한 비커에 파편과 계란을 모으십시오. 양동이에 모인 물을 25미크론 체를 통해 흘려보내 빠져나갔을 수 있는 계란을 수집합니다.

물로 잘 헹구고 같은 비커에 모으십시오. 깨끗한 금속 바구니에 Kim을 몇 겹 깔아줍니다. 종이를 닦고 유리 페트리 접시에 끼우고 접시 바닥과 접시 사이에 1cm 거리를 둡니다.

추출한 선충 알을 종이에 붓습니다. 철사 바구니에. 철사 바구니의 바닥이 수면에 닿지만 물에 잠기지 않도록 충분한 액체를 넣으십시오.

매일 플라스틱 뚜껑으로 윗부분을 덮으십시오. 물이 증발하는지 확인하고 바구니 바닥이 물에 닿도록 페트리 접시에 물을 약간 추가합니다. 6일에서 8일에 걸쳐 격일로 알이 마르는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에서 2단계 어린 알이나 J twos가 들어 있는 물을 비커에 모으십시오.

사용하지 않는 경우 수집된 접종물을 실험실, 공기 공급 장치 또는 수족관 펌프에서 생성된 공기를 사용하여 실온에서 즉시 폭기합니다. 자기 교반 플레이트에서 접종물을 저속으로 교반하여 다음 단계를 시작합니다. 수집된 선충의 부분 표본 3개를 사용합니다.

회계에서 J 2의 수를 계산합니다. 슬라이드 또는 접시, 평균을 계산하고 원하는 접종량을 결정하십시오. 이것은 현미경으로 본 J twos입니다.

일반적으로 화분에 있는 식물당 3000 J twos가 사용되고 묘목 트레이에서 자란 식물에 대해 500 J twos가 사용됩니다. 식물에 접종하기 전에 토양이 촉촉하지만 너무 젖지 않았는지 확인하십시오. 냄비 접종을 위해 각 토마토 뿌리 시스템 주변의 모래에 냄비 깊이의 약 절반 깊이의 구멍 3개를 만드십시오.

연필을 사용하여 피펫을 사용하여 J 2를 세 개의 구멍에 전달하여 각 식물에 접종합니다. 그런 다음 트레이의 고처리량 스크린용 구멍을 덮습니다. 측면에 구멍이 뚫린 변형된 밀봉 팁 바늘을 5ml 피펫에 접착하여 사용합니다.

파이퍼를 따라 팁을 주어 J twos를 토양으로 전달합니다. 식물을 섭씨 24도에서 27도의 온실에서 6주에서 8주 동안 유지하십시오. miracle grow로 한 달에 두 번 비료를 계속 주십시오.

감염 평가용. 윗부분을 자르고 화분에서 식물을 조심스럽게 제거하고 뿌리를 씻으십시오. 그런 다음 뿌리를 리터당 1밀리그램에 담궈 달걀 덩어리를 파란색으로 염색합니다.

15분 동안 Aerio 글로싱. 뿌리를 물로 헹구고 개별 뿌리 시스템에서 얼룩진 계란 덩어리를 세어 평가합니다. 조명이 켜진 죽음 돋보기를 사용하여 알 덩어리를 시각화하고, 선충, 접종물을 세고, 앞서 설명한 대로 자기 교반판에서 교반하는 데 도움이 될 수 있습니다.

걸이형 폴더에서 파우치를 제거하고 수평면에 놓습니다. 각 파우치에 5 밀리리터에 1, 500 J 2를 접종하십시오. 주머니의 플라스틱 덮개를 들어 올리고 선충을 뿌리 표면에 고르게 분포시킵니다.

접종 후 24시간 동안 파우치를 수평 위치에 유지하고 빛을 차단하기 위해 어두운 종이로 덮으십시오. 그런 다음 파우치를 성장실 물 속의 매달린 폴더에 다시 넣습니다. 식물은 비료에 대한 반응이 관찰 될 때까지 약 3 일 동안 하루에 한두 번 절반 강도의 호글 랜드 용액이 필요합니다.

일반적으로 단풍 녹화가 향상되고 새싹이 더 활발하게 자랍니다. 3일 후에는 파우치를 물로 촉촉하게 유지하십시오. 접종 후 약 30일 후에 각 파우치에 75mg 리터 10-20밀리리터를 주입합니다.

에어로 글로싱. 염료가 가득 찬 파우치를 밤새 수평 위치에 두십시오. 다음 날, 파우치를 비우고 조명이 켜진 책상 아래에서 알 덩어리를 세어 뿌리 시스템을 평가합니다.

여기에 표시된 돋보기는 널리 퍼진 계란 덩어리가 파란색으로 염색된 잘 감염된 토마토 식물의 뿌리입니다. 트레이를 사용하면 작은 성장 공간에서 수백 개의 식물을 스크리닝할 수 있습니다. 성장 파우치는 또한 뿌리를 씻을 필요가 없는 선충 감염이 아닌 뿌리에 대한 빠르고 불충분한 비파괴 평가를 가능하게 합니다.

또한 이 방법을 사용하면 작은 성장 공간에서 수천 개의 식물을 고처리량으로 스크리닝할 수 있습니다. 여기서 주머니에서 자란 암소 P 식물의 뿌리 시스템은 접종 후 파란색으로 얼룩진 알 덩어리를 보여줍니다. 감염 시기는 선충을 이용한 식물 분석에서 매우 중요합니다.

따라서 감염을 며칠이라도 지연시키면 감염 수준이 매우 낮아질 수 있습니다. 따라서 이 비디오를 시청한 후에는 이제 뿌리혹 선충으로 식물을 감염시키고 평가하는 방법을 잘 이해하게 되었을 것입니다. 선충에 감염된 뿌리는 적절하게 처리해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

뿌리를 처분하기 전에 고압멸균하면 선충의 확산을 제한할 수 있습니다. 또한 공중 글리신을 고용량으로 사용하면 주의하십시오. 발암성입니다.

따라서 장갑을 사용하여이 화학 물질에 감염된 뿌리를 다루고이 화학 물질을 준비해야합니다.

Explore More Videos

면역학 이슈 61 Cowpea Meloidogyne 루트 감염 루트 매듭 nematodes 토마토 묘목 성장 파우치