급성 상피 헤르페스의 예 VIVO Organotypic 각막 모델은 바이러스 종류 나 감염을 단순

저는 이콘인 제인 클리포드입니다. 저는 드렉셀 의과대학의 생화학 및 분자생물학 교수 겸 학과장이며, 제 이름은 올라 iv(Ola iv)이고 클리포드 박사 연구실의 MD 박사 과정 학생입니다. 올리와 제가 여러분을 위해 준비한 비디오는 토끼와 인간 돈 기증자로부터 얻은 각막의 생체 외 배양을 보여줍니다.

우리는 헤르페스 바이러스 감염을 연구하기 위해 이러한 각막을 활용했으며 각막의 다른 질병을 연구하기 위해 옥수수의 다른 질병에 확실히 적용할 수 있으며 세포 및 단일 배양과 비교하여 특히 관련성이 높은 생체 외 모델입니다. 헤르페스 각막염은 단순 포진 바이러스 1형과 관련된 가장 심각한 병리학 중 하나입니다. 현재 선진국에서 각막 유래 및 감염 관련 실명의 주요 원인입니다.

헤르페스 각막염은 전통적으로 두 가지 유형의 실험 모델로 연구됩니다. 배양된 각막 상피 세포의 단층이 페트리 접시에서 감염되는 체외 모델은 단순성, 높은 수준의 재현성, 빠른 실험 및 상대적으로 저렴한 비용을 제공합니다. 반면에, 토끼나 생쥐와 같은 동물을 각막에 직접 접종하는 헤르페스 각막염의 생체 내 모델은 매우 정교한 생리학적 시스템을 제공하지만 비용이 많이 들고, 실험이 더 길고, 동물을 보살피는 데 필요하고, 가변성이 더 큽니다.

이 비디오 기사에서는 in vitro 및 in vivo 모델의 장점을 결합한 급성 각막 상피 HSV one 감염의 새로운 생체 외 모델에 대한 자세한 시연을 제공합니다. 생체 외 모델은 일반적으로 배양에서 유지되고 HSV에 감염된 온전한 각막 기관을 사용합니다. 생체 외 모델을 사용하면 생리학적으로 매우 기반적인 결론을 내릴 수 있지만 비용이 많이 들고 체외 모델에 필적하는 STEM 헌신이 필요합니다.

절차를 시작하기 전에 다음을 준비합니다. 페트리 접시 인산염 완충 식염수, 각막 배양 및 골격 미디어 거즈 스폿 플레이트 스트립, 신선한 안구, 메스, 집게 및 날카로운 가위. PBS로 좁은 거즈 스트립을 적시고 안구를 감싸 단단히 고정합니다.

시술 중에는 날카로운 메스를 사용하여 공막에서 약 50cm 떨어진 공막을 접선 절개합니다. 가위를 사용하여 각막 공막 버튼을 완전히 절제합니다. 절개 부위가 확장되면 안구 내부의 압력이 감소하여 조직을 잡고 조작하기가 어려워집니다.

이러한 이유로 이 단계에서는 날카롭고 신뢰할 수 있는 가위를 사용하는 것이 좋습니다. 각막 공막이 분리되면 집게로 공막 가장자리를 잡고 홍채를 떼어냅니다. 내피를 손상시키거나 각막에 과도한 스트레스를 가하지 마십시오.

중간 용액에 1%agros를 준비하고 준비하십시오. 섭씨 55도에서 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 멸균 PBS로 각막을 철저히 헹굽니다. 각막 상피 쪽을 멸균 스포트라이트의 우물에 아래로 놓습니다.

Medium을 포함하는 agros를 각막의 내피 오목한 부분에 추가합니다. 완전히 채울 수 있을 정도로. 아그로스가 굳을 때까지 약 1분 정도 기다립니다.

지지 아그로스 스캐폴드 상피 면이 위로 향하게 하여 조직 배양 접시에 각막을 놓고 상피 표면을 덮기 위해 보충된 MEM 배지를 추가합니다. 각막은 이러한 방식으로 일주일 이상 배양될 수 있으며 48시간마다 중간 변화가 있습니다. 원하는 양의 바이러스를 함유한 배지 1ml를 조직 배양 접시에 추가합니다.

농업 골격 상피 쪽이 아래로 향하도록 각막을 바이러스가 포함된 배지에 놓습니다. 조직 배양 인큐베이터에 각막을 넣어 1시간 후 10-15분마다 간헐적으로 흔들어 1시간 동안 감염시킵니다. 바이러스가 포함된 배지를 흡인하고 PBS로 2-3회 헹구어 잔류 바이러스 입자를 제거합니다.

PBS로 헹굴 때 농업 골격에서 각막이 빠지지 않도록 주의하십시오. 상피 표면을 덮기 위해 새로운 매체를 추가하십시오. 실험적 치료는 실험의 성격에 따라 감염 전이나 후에 시작될 수 있습니다.

배양 배지는 48시간마다 교체됩니다. 배지를 잘 혼합하고 플라크 분석에 즉시 사용하십시오 : 나중에 사용하기 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 보관하십시오. 다른 시점에서 샘플을 채취하는 경우 PBS로 각막을 잘 헹굽니다.

농업 골격을 제거하고 각막에서 공막 조직의 고리를 자극하여 각막 상피 물질만 수집되도록 합니다. 메스를 사용하여 분리할 물질의 유형에 따라 각막 상피 세포를 적절한 완충액으로 긁어냅니다. 공막 가장자리를 제거하면 각막이 물을 흡수하여 빠르게 팽창할 수 있습니다.

부기로 인해 긁힘이 복잡해질 수 있으므로 전체 샘플이 수집되었는지 확인하기 위해 페트리 접시를 빠르게 헹구는 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 농업 골격을 제거하고 각막을 헹굽니다. PBS와 함께라면 말이죠.

각막을 사용하여 실험 목표에 따라 여기에서 설명한 대로 파라핀 조직 블록 또는 냉동 조직 블록을 만듭니다. 최적의 절단으로 각막을 삽입하고, 시편 금형 내의 온도 화합물, 에탄올 드라이 아이스 수조에서 각막을 급속 동결합니다. 이 비디오에서 보여준 것은 각막을 준비하고, 각막을 절개하고, 각막을 외배양에 넣고, 각막을 헤르페스 바이러스로 감염시키는 것입니다.

이것은 생체 외 헤르페스 바이러스 감염을 연구하는 데 매우 유용한 모델에 대한 기술을 제공했으며, 각막 세포를 사용한 다른 실험에 다른 사람들에게도 유용하기를 바랍니다.