Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 다양한 실험 조건 하에서 burkini 세포 수지상 돌기 트리의 발달을 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 생후 마우스 소뇌의 장기 배양 슬라이스 배양을 설정합니다. 그다음, 다양한 실험 조건에서 슬라이스 배양물을 배양합니다.

예를 들어, MGL R one 작용제의 효과를 테스트한 후 배양물을 고정하고, anti Calbindin 면역 염색을 통해 개별 퍼킨지 세포와 수지상 돌기 나무의 형태를 확인합니다. 마지막 단계는 대조군 또는 실험 조건에서 성장한 퍼킨지 세포의 수지상 돌기 나무를 분석하는 것입니다. 면역 염색된 퍼킨지 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 최종 결과를 얻으며, 수지상 돌기 나무의 크기와 분지 정도를 정량적으로 평가하면 신경전달물질 수용체, 특히 MGL R one의 활성화가 퍼킨지 세포의 수지상 돌기 나무 발달에 깊은 영향을 미친다는 것을 알 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 배양 기간 동안 Perkin 세포 말단의 거의 완전한 성장이 일어난다는 것이며, 따라서 수지상 돌기 형성(dendritic tree development)과 같은 매우 복잡한 문제를 in vitro 환경에서 연구할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 활동이 신경 돌기의 성장과 발달에 어떤 영향을 미치는지와 같은 발달 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 실체 현미경 하에서 얼음처럼 차가운 준비 배지를 사용하여 PA 마우스 새끼의 뇌에서 소뇌를 적출하십시오.

다음으로, McIlwain 조직 절단기를 사용하여 소뇌를 시상 방향으로 350 micron 두께의 절편으로 자릅니다. 절편을 분리한 후, 밀리포어(millipore) 세포 배양 인서트에 인서트당 약 6개의 절편을 올립니다. 그런 다음, 웰당 0.75 milliliters의 배양액이 미리 채워진 6-웰 플레이트에 넣고 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 농도의 가습 분위기에서 배양합니다.

배양액에 원하는 농도의 PMA 또는 DHPG를 첨가하여 체외(in vitro) 배양 3일째에 약물 처리를 시작하십시오. 2일 또는 3일마다 배양액을 교체할 때 약물도 함께 갱신해 줍니다. 배양물을 고정합니다.

먼저 배양액을 제거한 다음, Millicell insert의 막에 부착된 소뇌 절편이 들어 있는 각 웰에 파라포름알데히드 3 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 하룻밤 동안 배양물을 고정시킨 후 고정액을 제거합니다. 이어서 인산염 완충액으로 배양물을 헹굽니다.

다음으로, 블로킹 용액에 희석한 rabbit anti calbindin을 배양액에 첨가합니다. perikaryon 세포를 선택적으로 시각화하기 위해 rabbit anti calbindin을 1:1000 비율로 희석하고, 과립 세포를 선택적으로 시각화하기 위해 monoclonal anti NeuN을 블로킹 용액에서 1:500 비율로 희석합니다.

배양물을 4 °C에서 완만한 교반 상태로 하룻밤 동안 함께 배양합니다. 다음 날, 0.1 M 인산 완충액으로 배양물을 3회 세척하고, 2차 항체인 Goat anti rabbit Alexa 568 및 goat anti mouse Alexa 488을 0.1 M 인산 완충액 및 0.1% Triton X 100 혼합액으로 1:500 비율로 희석합니다.

상온에서 2시간 동안 배양물을 함께 배양합니다. 인산 완충액으로 배양물을 3회 세척한 후, 페인트 브러시를 사용하여 배양 웰에서 염색된 절편을 제거하고 super frosts plus 유리 슬라이드 위에 고정합니다. 적절한 봉입제를 사용하여 커버 슬립을 덮습니다.

그 후, 에피 형광 장치가 장착된 일반 현미경이나 공초점 현미경을 사용하여 bikini 세포의 형광 표지를 관찰합니다. 특정 세포의 수지상 돌기 나무가 다른 세포와 겹치지 않는다면, 그 크기를 쉽게 측정할 수 있습니다. 수지상 돌기 나무가 겹치지 않는 bikini 세포가 확인되면, 20 x 렌즈로 관찰합니다.

디지털 카메라로 이미지를 촬영한 후 이미지 분석 프로그램을 사용하여 분석합니다. 본 연구실에서는 Image Pro Plus를 사용합니다. 이 프로그램을 이용하면 마우스 클릭 한 번으로 세포의 수지상 돌기 구조를 외곽선으로 지정할 수 있습니다.

측정 모드에서 마술봉 도구를 사용하여 프로그램이 수지상 돌기 나무가 차지하는 면적을 계산하고 이를 Ms.Xl로 내보냅니다. 이후 분지점의 수에 대한 데이터의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. kinji 세포 ENDR 나무의 매우 분지된 미세한 형태 때문에, 분지점은 수동으로 계수해야 합니다. Adobe Photoshop을 사용하여 kinji 세포의 20 x 이미지 파일을 화면의 대부분을 차지하도록 확대합니다.

그런 다음 모든 분지점을 세고 빨간색 점으로 표시합니다. 식별된 bikini 세포를 반복적으로 촬영하여 수지상 돌기 나무의 성장을 모니터링했습니다. div 2에서 div 7까지 수지상 돌기의 분지가 지속적으로 성장했습니다.

div 4부터 div 11까지 수지상 돌기 나무(dendritic tree)가 상당히 확장되었습니다. 제시된 그림은 p KC 또는 mgl R one에 의한 bikini 세포의 수지상 돌기 나무 발달 억제 사례입니다. A와 D의 자극은 수지상 돌기 나무가 잘 발달된 처리되지 않은 대조군 세포를 보여줍니다. B와 E에서 보는 바와 같이, 9일간 PMA 처리를 한 후에는 수지상 돌기가 두꺼워 보이며 수지상 돌기 나무의 크기가 크게 감소합니다.

반면에, CNF는 DHPG 처리 9일 후 수지상 돌기 구조의 크기가 크게 감소했음을 보여줍니다. PMA 처리와는 달리, 1차 및 2차 수지상 돌기에서 매우 가늘고 짧은 측가지들이 많이 관찰되었습니다.

여기에서의 정량적 측정 결과는 상단 막대 그래프의 수상돌기 나무 크기와 하단 막대 그래프의 분지점 수 모두 PMA 또는 DHPG 처리 후 크게 감소했음을 보여주며, 대조군 수상돌기 나무와 처리된 배양물 유래 Purkinje 세포의 수상돌기 나무 간의 차이는 통계적으로 유의미했습니다. 이 절차 이후에는 수상돌기 나무의 형태 변화가 갖는 기능적 함의와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기생리학과 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 장기 배양형 소뇌 절편 배양을 설정하는 방법과 Purkinje 세포 및 형태학을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.