Name: 에서 세포 외액의 Vampiric 절연 Caenorhabditis elegans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 세포 외액을 분리하는 새로운 기법으로 RNAi 신호 전달 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 유체 역학과 유전자 조절 연구에 활용됩니다.

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우리는 헌터 연구소의 협력 자연을 인정하고,이 기술의 개발이 가능하고, 즐거운 한 도움이 토론과 도움에 감사합니다. 나이젤 Delaney와 웜과 박테리아 변종에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터를 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 CPH에 GM089795 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기 모델 유기체 C.에서 세포 외액의 절연 및 특성을 수있는 새로운 방법을 발표 elegans. 기술은 세포 외액 자신의 총 볼륨을 높이기 위해 기증 웜의 유전자 또는 물리적 조작을 시작합니다. 세포 외액은 다음 수정 microinjection 기술을 사용하여 절연하고 있습니다. 웜은 절차를 수행하는 동안 여전히 벌레를 잡아 건조 아가로 오스 패드를 사용하여 microinjection에 장착되어 있습니다. 패드에 대한 물리적 첨부 파일 hydrostatically 곳에서 웜을 보유 할 수있는 드라이 패드의 desiccating 전원을 사용합니다. 웜가 탑재되면 사용할 수있는 세포 물이 기증자 동물로부터 배출되는 시작하기 때문에, 도전을 선물한다. 따라서 신속하게 작동 할 수 필수적입니다. 이 사출 패드에 미네랄 오일에 웜을 중지 할 experimenters에게 도움이 될 수 있지만, 그들을 패드와 접촉을하지. 일에 주입 패드를 장착 한 후전자 현미경 및 웜과 바늘을 정렬은 패드와 접촉을하고 &...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 일</strong</td&gt;<td<strong&gt; 웜 준비</strong</td&gt;<td<strong&gt; 재료 준비</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 사전</td&gt;<td&gt; 깨끗한 유지 잘 공급<em&gt; CLR-1 (e1745)</em&gt;와 N2 웜</td&gt;<td&gt; 사출 패드, NGM 플레이트, NGM + Carb / IPTG 접시, OP50 LB 주식을 만들기</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<tdLB에 대한 RNAi 음식 아웃&gt; 승리 + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; RNAi 음식 박 3 ML의 예방</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; RNAi 판에 배아 이동</td&gt;<td&gt; 종자 RNAi 판</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; 4 시간 동안 25 웜를 Shift</td&gt;<td&gt; 검정 접시 만들기</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; NGM 플레이트를 청소 벌레를 이동</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric 전송</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; 수신자를 복구</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 1</td&gt;<td&gt; 이전 수신자를 제거</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2</td&gt;<td&gt; 점수 자손</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; 표 1.</strong&gt; 재료 준비 일정.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 장비</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter 압력 주입기</td&gt;<td&gt; 워너 계측기</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 불타는 / 브라운 micropipette 풀러</td&gt;<td&gt; 셔터 계측기</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; 시약</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 미네랄 오일</td&gt;<td&gt; EM 과학</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50없이 1 ½ 커버 유리</td&gt;<td&gt; 코닝</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE 아가로 오스</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50,004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 붕규산 유리 모세 혈관</td&gt;<td&gt; 세계 Precisions 계측기</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 차아 염소산 나트륨 솔루션 (5 % 유효 염소)</td&gt;<td&gt; JT 베이커</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt;와 박테리아 변종</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; CLR-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; glp-1</em&gt; RNAi 벡터<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<tdBioscience&gt; 소스 (Ahringer 수유 도서관)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; PAL-1</em&gt; RNAi 벡터<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; pHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. 대장균</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; 표 2.</strong&gt; 특정 시약 및 장비.</p

에서 세포 외액의 vampiric 절연<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

유전자 다루기 쉬운 모델 생물 C. elegans의 성장과 작은 크기의 용이성, 그 짧은 세대 시간으로 활성화, 생물의 질문 무수히으로 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작은 크기는하지만 다른 모델 시스템에서 발견 된 기술적 접근 방법의 수를 금지하고 있습니다. 예를 들어, 포유류의 시스템과 식물의 접목 기술의 수혈은 순환 시스템 조성과 신호의 질문을 수 있습니다. 최근 직접 분석에 불가능 때까지 웜의 순환 시스템 pseudocoelom이 있습니다. 세포 신호 및 순환 시스템을 구성 C.의 질문에 답변하려면 elegans 연구원은 전통적으로 유전자 분석, 세포 / 조직 특정 구조, 그리고 모자이크 분석 해 나가고 있습니다. 이 기술은 세포 사이에 어떤 일이 일어나고 있는지를 추론 할 수있는 수단을 제공하지만, 세포 분자의 식별 및 특성에 보편적으로 적용되지 않습니다. 여기 NE을 제시직접 검정 C.의 pseudocoelomic 유체에 wly 개발 기술 elegans. 기술은 세포 외액의 볼륨을 높이기 위해 중 유전 적 또는 물리적 조작으로 시작됩니다. 이후 동물은 고급 밸런스 압력 제어 할 수있는 microinjection의 장비를 사용하여 vampiric 역방향 microinjection 기술을 받게됩니다. 세포 외액의 분리 후, 수집 된 유체가 다른 동물로 전송 또는 분자에 의해 assayed 할 수 있습니다. 이 기법의 효과를 입증하기 위해 우리는 체계적 RNAi 반응 동안 분석 세포 신호 분자, 긴 dsRNA의 특정 예를에 자세한 방법을 제시한다. 체계적 RNAi의 특성은 원리 예제의 증거이지만, 우리는 순환 시스템 조성과 신호의 질문에 다양한 대답을 적응 것으로이 기법을 참조하십시오.

모델 생물<em&gt; C. elegans</em&gt; 수동 순환 시스템으로 pseudocoelomic 유체를 사용합니다. 이 유체의 직접 분석은 이전에 수 없었습니다. 여기에 직접 검정 세포 공간을에 소설 기법을 제시하고, 원칙 예제의 증거로 RNAi 반응하는 동안 조직 입을 신호를 사용합니다.

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

유전적 조작이 용이한 모델 생물인 C. elegans는 짧은 세대 시간 덕분에 수많은 생물학적 질문에 대한 통찰을 제공해 왔으며, ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 가성 액체(pseudo fluid)의 조성 및 기능과 관련된 질문, 예를 들어 RNAi 신호 전달과 관련된 문제를 해결하기 위해 세포외액을 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 벌레에게 dsRNA를 발현하는 박테리아를 먹여 쉽게 판별 가능한 RNAi 표현형을 유도합니다. 그 다음, 벌레의 전신으로 RNAi 침묵 신호가 확산되도록 합니다.그런 다음 이용 가능한 세포외액의 총 부피를 증가시킵니다. 마지막으로, 마이크로인젝션 바늘을 사용하여 세포외액을 제거한 후 RNAi 미처치 웜에 주입합니다. 최종적으로, 주입된 웜의 자손을 스코어링함으로써 RNAi 사이런싱 신호의 존재를 확인할 수 있습니다.이 방법을 통해 세포외액의 조성을 분석함으로써 전신 RNAi뿐만 아니라 다양한 세포 간 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자는 작업 속도가 매우 빨라야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 공여체 웜을 준비하기 위해 LB plus CARIL 플레이트에 DS RNA를 발현하는 E 1745 박테리아를 스트리킹하여 단일 콜로니를 형성시키며, 본 시연에서는 PAL one DS RNA 생산 박테리아가 사용되었습니다.플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 단일 콜로니를 선택하여 carbenicillin이 첨가된 lb 배지 3 mL에 접종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 배양액 15 µL를 25 µg/mL의 carbenicillin과 1 mM IPTG가 첨가된 35 mm NGM 플레이트에 파이펫으로 분주합니다.박테리아를 플레이트의 중심에서 벗어난 곳에 도말하십시오. 배양이 건조될 때까지 기다립니다. 그다음, 준비된 플레이트 위에 갓 제조한 표백제 용액 10 µL를 피펫으로 분주하십시오.역방향 미세주입을 위해 작고 깨끗하며 동기화된 clear. One E 1745 개체군을 얻으려면 표백제 방울을 박테리아 지점에서 떨어진 곳에 배치하십시오. 2~10마리의 중년 성체(grave adults)를 골라 표백제 방울 속에 넣으십시오.성체는 용해되어 사라지고, 깨끗하며 발달 단계가 부분적으로 진행된 배아만 남게 됩니다. 이후 이 배아들이 부화하면 유충이 먹이 쪽으로 기어갑니다. 배아를 20°C에서 4일 동안 배양하십시오.그 후, 팽창을 유도하기 위해 플레이트를 25 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 벌레를 선택하여 세척되지 않은 NGM 플레이

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 전체 벌레를 온전한 세포의 FACS 또는 면역침전에 적합한 단일 세포 현탁액으로 해리하는 방법을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 단일 세포 해리: 살아있는 세포를 분리하는 방법

출처: Petersen, C. 외, 모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물군 분리 및 특성화. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 Caenorhabditis elegans와 관련된 박테리아 종의 분리와 배양 과정을 보여줍니다. 구슬 기반 C. elegans 용해와 선택적 배양을 통해 다양한 미생물 균주를 분리하여 추가 분석을 할 수 있습니다.

카에노르합디티스 엘레간스 관련 박테리아의 분리 및 배양

이 비디오는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 형광 표지된 뉴런을 분리하는 방법을 보여줍니다. 세포 현탁액은 콜린성 뉴런에서 형광 단백질 융합 소포형 막관통 수송체를 발현하도록 조작된 형질전환 웜에서 얻습니다. 그런 다음 형광 표지된 뉴런은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 분리되고 배양에서 유지됩니다.

Fluorescence-Activated Cell Sorting을 통한 Caenorhabditis elegans 의 뉴런 분리

여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

이 기사에서는 예쁜꼬마선충을 세포외 소포를 생성, 정화 및 정량화하는 방법을 제시합니다.

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.

Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 세포 외액을 분리하는 새로운 기법으로 RNAi 신호 전달 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 유체 역학과 유전자 조절 연구에 활용됩니다.

에서 세포 외액의 Vampiric 절연

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