Name: 옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 LNA-FISH와 유세포 분석을 이용한 단일 세균 세포 내 소형 RNA 검출 방법을. 생물학적 연구에서 RNA 발현 변화를 정량적으로 분석할 수 있는 고효율 기술입니다.

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이 작품은 미국 해군 연구소의 핵심 연구 기금을 통해 해군의 사무실에 의해 지원되었다.

1. LNA 프로브 및 실험 설계 <ol><li> 귀하의 베꼈는데 sRNA / mRNA의 반대로 보완거나 그들에 사용자 정의 설계 디자인 LNA 프로브 <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . 사용자 정의 디자인 옵션을 사용하면 순서를 알아,하지만 LNA의 급상승 패턴하지 않습니다. 사이의 T m의 증가에 DNA 또는 RNA oligonucleotide 결과에 각 LNA 잔여물의뿐만 아니라, 둘, 10 ° C LNA - RNA의 하이브 리다이 제이션 이중 14. 이상적으로, 설계 LNA 프로브의 길이는 20-25 세포핵 (이상 프로브는 종합 더 어렵습니다) 사이와 85-90 사이의 T m ° C RNA에 대한이 하이브 리다이 제이션 있어야합니다. </li><li> 순서를 설계 후, 폭발을 사용 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi를</a> 하거나 프로브는 여러분의 sRNA / 관심의 mRNA에 따라 다릅니다 수 있도록 로컬 데이터베이스에 프로브 시퀀스를 비교합니다. </li><li>LNA 프로브를 주문하면, LNA의 oligonucleotide의 5 &#39;끝에 비오틴 - TEG 수정을 추가합니다. biotinylation은 streptavidin 염색 활용과 사후 하이브 리다이 제이션 얼룩 필요합니다. 그것은 3이 수정을 추가할 수 있습니다 &#39;필요하면 끝, 그러나 5 추가&#39;끝이 저렴하고 높은 수율을 초래한다. </li><li> 세 가지 부정적인 컨트롤 방법에 포함되어야합니다 (I) LNA 프로브는 하이브 리다이 제이션 단계에서 추가되지되는 &#39;아니오 LNA&#39;통제하고, (ii) &#39;아니오 염료&#39;컨트롤이있는 LNA 프로브가에 hybridized입니다 대상 sRNA하지만 하이브 리다이 제이션 이벤트가 형광 얼룩의 부재로 인해 탐지하고, 순서에 존재하지 않는 또는 비 표현 sRNA을 대상으로 LNA 프로브를 이용 (3) &#39;이외의 표현 sRNA / mRNA&#39;제어하지 않습니다 불특정 하이브 리다이 제이션을 모니터링합니다. </li><li> 여기에 구체적인 LNA의 프로브 (LNA의 단량체의 sRNA CsrB를 보완하고 &#39;5&#39; - 비오틴 - TEG - gTccAttTccCgtCctTagCagC - 3 순서를 가지고) 문자를 대문자로. </li><li> -20 ° C.에 10-20 μL aliquots에서 50 μg / ML 및 저장하는 nuclease 무료 물로 resuspend 동결 건조된 LNA 수령, 다음 </li></ol> 솔루션 <ul><li> 8퍼센트 paraformaldehye (pfa), PBS에서 10 % 초산 : 믹스 1 ML 32% pfa, 400 μL 초산, 400 μL 10X PBS, 산도 = 7.4, 그리고 2.2 ML nuclease없는 물. 냉동 aliquots 들어, 초산없이 -20 ° C에서 단일 사용 aliquots에서 동결. </li><li> 60% dextran 황산 솔루션 : 50 ML 원뿔 튜브 6.0 g dextran 황산을 추가하고 10 ML의 최종 볼륨에 물을 추가할 수 있습니다. dextran 황산은 (1-2 시간 걸릴 수 있습니다) 해산되기 전까지 ° C 물 목욕에 65이 혼합물을 가열. 추가 물 10 ML 볼륨을 유지하기 위해 solubilization 과정에서 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 나누어지는 60% dextran 황산 솔루션과 저장합니다. </li></ul> 2. 정치 <ol><li> 발광 생물의 수확 1x10 8 셀 <em&gt; 장염 campbellii 또는 세균 관심 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 그들을 전송합니다. 세포의 수량이 네 흐름 - 물고기 샘플 (한 특정 LNA 프로브 샘플과 세 부정적인 컨트롤)에 대한 충분한 시작 자료를 제공합니다. 다른 sRNA / mRNA 종의 테스트해야 할 경우 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 aliquots가 수집되어야합니다. </li><li> 펠렛 5 분 동안 2,300 XG에서 원심 분리하여 세균 세포. pipetting하여 뜨는을 취소하고 1X PBS 400 μL의 세포를 resuspend. </li><li> 이 혼합하려면, (1X PBS) 솔루션을 식염수 버퍼 잘 혼합 1X 인산염의 8 % paraformaldehye (pfa)와 10 %의 아세트산 400 μL를 추가, 25 10 분 동안 품어 ° C 5 분 후에 한 번 혼합. 별도로 명시하지 않는 한 모든 incubations은, 가열 튜브 홀더에서 수행됩니다. pfa 솔루션은 신선한 준비 또는 초산의 추가 후 냉동 aliquots에서 사용해야합니다. Paraformaldehyde는 crosslinking의 정착액입니다 Helps은 세포 형태를 유지하고 세포내 RNA를 유지합니다. </li><li> 펠렛은 2 분 동안 4,500 XG에서 원심 분리하여이 혼합물의 세포와 pipetting하여 뜨는을 제거합니다. 원심 분리가 필요한 모든 미래의 단계가 동일한 설정 (7K, 2 분)을 사용해야합니다. supernatants가 pipetting과 decanting하지 의해 제거되어야한다는 다음 원심 분리에 유의하는 것이 중요합니다. </li><li> 400 μL 1X PBS로 두 번 세포를 씻어 400 μL 1X PBS의 마지막 셀을 펠렛을 resuspend. 세포는 현재 고정되고 ° C 400 μL 1X PBS에서 최고 7 일 동안 4 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 디에틸의 pyrocarbonate 처리 <ol><li> 1X PBS (400이 솔루션의 μL 따라 너무 규모의 테스트로 모든 샘플이 필요합니다)에 디에틸 pyrocarbonate (DEPC)의 0.1 % 용액 400 μL를 준비합니다. DEPC 용액은 DEPC 주식 신선한 준비되어야합니다. DEPC 처리는 carbethoxylation로 RNases을 inactivates하고을 감소배경 신호. </li><li> 각 고정 세균 세포 샘플에 0.1 % DEPC 용액 400 μL를 추가하고 pipetting으로 잘 섞는다. 십이분 25 ° C에서이 혼합물을 품어. 400 μL 1X PBS, 펠렛 세포 (7K, 2 분)와 두 번 세포를 세척 뜨는을 제거하십시오. </li></ol> 4. Permeabilization <ol><li> 1.0 MG / ML 솔루션 1 ML - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 트리스 버퍼 (10 MM 트리스, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)에 라이 소 자임 1.0 MG를 추가합니다. 이 솔루션은 신선 준비하여야한다. 25 800 세포에 MG 1 / ML 라이 소 자임 솔루션 μL, pipetting에 의해 철저하게 믹스와 부화를 추가 ° 가끔 믹싱과 30 분 C. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 라이 소 자임은 세균 세포 벽의 peptidoglycan 선물 hydrolyzing하여 permeabilization 시약의 역할을합니다. </li><li> TE 버퍼에 proteinase K의 3.0 μg / ML 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 -20 ° C.에 저장된 20 밀리그램 / ML proteinase K 주식 신선한 준비한다Proteinase K는 단백질의 다양한 소화하고 RNA에 프로브 및 시약의 접근을 도와주는 세린 프로 테아제이다. </li><li> 3.0 μg / 세포 펠렛에 ML proteinase K 용액 800 μL를 추가하고 pipetting에 의해 철저히 섞는다. 부화를 통해 중간 vortexing와 함께 15 분 동안 25 ° C에서 품어. </li><li> 펠렛 전지 (7K, 2 분), 뜨는을 제거하고 400 μL 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 세차 뜨는을 제거한 후, 400 μL 1X PBS에서 세포를 resuspend과 네 개의 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 resuspension 100 μL를 추가합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. </li></ol> 5. 이종 교잡 <ol><li> 각 샘플에 대한 하이브 리다이 제이션 버퍼 (HB) 100 μL를 준비합니다. HB는, 부피, 질량 10 % dextran 황산 (매 100 μL에 대한 60% dextran 황산 솔루션의 16.7 μL 추가), 1X Denhardt의 솔루션, 50 MM 나트륨 인산 산도 7.0에서 50 %의 포름 아미드로 구성됩니다2X 나트륨 구연산 (SSC), 가지각색 연어 정자 DNA (SSSD) 및 20 μg의 효모 tRNA 20 μg. </li><li> HB의 각각의 구성 요소는 서로 다른 목적을 가지고 있습니다. 포름 아미드가함으로써 RNA의 변성 및 세포 손상을 최소화 도와주는 핵산 duplexes의 녹는 온도를 낮춰줍니다. Dextran 황산은 볼륨 제외 폴리머는 프로브를 집중하고 하이브 리다이 제이션 속도를 높일 수로 사용됩니다. Denhardts 솔루션은 효모 tRNA와 SSSD가 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 차단 대리인 역할을합니다. </li><li> 세포의 각 resuspension 함유 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를, 95 μL HB 및 sRNA /의 5.0 μL 추가 mRNA를 특정 LNA 또는 물 (LNA 대조군을위한) [특정 LNA 최종 농도 20 pmol]. 예를 들면 다음과 같습니다 <ol class="lalpha"><li> 튜브 1-95 μL HB + 5.0 μL sRNA / mRNA 특정 프로브 </li><li> 튜브 2-95 μL HB + 5.0 μL sRNA / mRNA 특정 프로브 ( &#39;없음 염색&#39;부정적인 제어) </li><li> 튜브 3-95 μL HB + 5.0 μL sRNA/ mRNA 프로브 ( &#39;비 표현 sRNA / mRNA&#39;부정적인 제어) </li><li> 튜브 4-95 μL HB + 5.0 μL 물 ( &#39;없음 LNA&#39;부정적인 제어) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> 60 분 60 ° C에서 네 명 모두 샘플을 품어. 하이브 리다이 제이션 온도는 LNA 프로브 (S) T m에 따라 차이가 있으며, 약 30 설정해야합니다 ° C 어닐링 RNA에 대한 T m을 예측 아래. HB의 상승 하이브 리다이 제이션 온도와 포름 아미드 모두 sRNA이나 관심 mRNA의 이차 구조의 변성을 보장합니다. </li></ol> 6. 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다 <ol><li> 하이브 리다이 제이션 다음, 하이브 리다이 제이션 혼합물에 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 (SSCT)와 1.0 ML 0.1X SSC를 추가합니다. 이것은 세포가 점성 하이브 리다이 제이션 용액에서 제거 수 있도록하는 것이 필요합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 50 %의 포름 아미드 200 μL, 2X SSC, 0.1 %를 추가 십대 초반 - 2​​0 세포 산탄으로, 철저하게 혼합 incub65 ° C 가열 블록에 30 분 먹었다. </li><li> 혼합물, 펠렛 세포 (7K, 2 분) 1 ML 0.1X SSCT를 추가하고 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 세포를 resuspend하고 열 블록 65 40 분 ° C에 대해 품어 500 μL 0.1X SSCT을 추가합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. </li></ol> 7. 차단 및 염색법 <ol><li> 차단 버퍼 (BB)와 streptavidin 염색 얼룩 솔루션을 준비합니다. 5 배 주식 (상용, 시약 참조)에서 1X BB 솔루션을 준비합니다. 네 튜브의 모든 집합에 대해, 1.2 ML 1X BB를 준비합니다. </li><li> 세포 펠렛, resuspend 200 μL 1X BB를 추가하고 25 30 분 품어 ° C. </li><li> streptavidin - 복합 염료는 biotinylated LNA 프로브를 감지하는 데 사용됩니다. 차단하는 동안, 2 μg / ML DyLight 488 streptavidin 또는 30 분 (세명 샘플, 300 μL을)에 대한 1X BB에서 원하는 염료 streptavidin 활용의 솔루션을 준비합니다. </li><li> incub 후1X BB, 펠렛 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거와 함께 ation. , 셀 알약에 streptavidin - 염료 용액의 50 μL를 추가 철저하게 혼합, 25 12 분 동안 품어 ° C 소용돌이 또는 thermomixer에 지속적인 혼합과 함께. &#39;아니오 염료&#39;제어를위한, 50 μL 1X 차단 버퍼를 추가합니다. 프로토콜의 나머지 들어, 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 튜브를 보호합니다. </li><li> 500 μL 0.1X SSCT 버퍼와 한번 세포를 씻고 한 번 400 μL 1X PBS와 함께 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 (PBST). 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 초기 streptavidin - 공액 얼룩 다음, 신호가 streptavidin 염색 활용에 biotinylated 방지 streptavidin 항체를 소개하고 (그림 2) hybridized LNA 프로브 당 신호 출력을 증가 따라서 streptavidin 염색과 두 번째 시간을 얼룩에 의해 증폭됩니다 . </li><li> 1 μg / ML 100 μL를 추가 1X PBS, resuspen에 방지 streptavidin 항체를 biotinylated25 D는 세포, 그리고 품어 ° C를 가끔 믹싱과 함께 30 분. 펠렛 전지 (7K, 2 분), 뜨는을 제거하고 400 μL 1X PBST로 두 번 씻는다. </li><li> 2 μg / 세포 ML streptavidin 염색 용액의 50 μL를 추가, 철저하게 혼합, 25 12 분 동안 품어 ° 소용돌이 또는 thermomixer에 지속적인 혼합과 C. &#39;아니오 염료&#39;제어를위한, 50 μL 1X 차단 버퍼를 추가합니다. </li><li> 500 μL 0.1X SSCT 버퍼와 한번 세포를 씻어 한번와 400 μL 1X PBST. </li><li> 4 200 μL 1X PBST와 저장소의 세포를 Resuspend ° C 유동세포계측법 분석 준비까지. 작은 박테리아 세포의 핵심 크기를 감소 느린 흐름 속도가 설정할 수 있습니다. 또한, 앞으로 산란 임계값 cutoffs와 흐름 cytometers위한 컷오프가 작은 세균의 세포가 감지되도록 가능한 낮은 설정해야합니다. </li><li> DyLight 488 감지, 흐름 cytometer은 488 nm의 레이저 및 표준 방출을 갖추고 있어야FITC를위한 필터. 최소한 2x10 4 이벤트가 수집되어야합니다. 다른 레이저가 장착된 흐름 cytometers과의 호환성을 위해 다른 streptavidin - 복합 fluorophores이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 고정하고 효과적으로 permeabilized 아르 세포의 예제는 그림 3A에서 유동세포계측법의 도트 음모에 표시됩니다. permeabilization에 대해 위에서 설명한 조건을 사용하는 경우, 세포 인구가 작고 동질적인 나타내는 몇 가지 세포 집계입니다. 라이 소 자임 높은 (5 밀리그램 / ML) 농도를 사용하는 경우 전지 집계 가능성이 더 높습니다 그리고 큰 입자 (그림 3B)을 나타내는 전방 산란 증가 값을 보여줍니다. 성공적인 LNA 흐름 물고기 실험에서 유동세포계측법 데이터의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 히스토그램 세 부정적인 컨트롤과 함께 대상 sRNA의 특정 감지를 보여줍니다.&#39;아니오 염료&#39;부정적인 통제는 &#39;노 LNA&#39;과 &#39;비 표현 sRNA&#39;부정적인 컨트롤 다음에 적어도 형광을 생산하고 있습니다. 마지막으로, sRNA 특정 LNA 프로브와 샘플이 최고의 형광을 생산하고 있습니다. 방법과 LNA 프로브가 이러한 방식으로 확인되면, 추가적인 실험은 돌연변이나 다양한 문화 환경 등에 대한 응답으로, 시간이 지남에 따라 sRNA 신호의 변화를 모니터링하기위한 수 <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> 그림 1. 박테리아 sRNA의 검출을위한 LNA 흐름 물고기 실험의 전반적인 계획의 묘사. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> 그림 2. LNA 흐름 생선 신호의 얼룩 및 증폭. biotinylated LNA 프로브의) 하이브 리다이 제이션. 형광 DyLight 488 streptavidin의 활용과 함께 B) 염색법. C) biotinylated 방지 s의 바인딩DyLight 488 streptavidin에 treptavidin 항체. 항체는 항원 결합 사이트를 통해 streptavidin을 바인딩할 수 또는 비오틴 잔류물을 통해 streptavidin 구속 수 있습니다. 형광 DyLight 488 streptavidin의 활용과 함께 추가로 얼룩에 의해 신호의 D) 증폭. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> 그림 3.) 1 MG / ML 라이 소 자임, 3 μg / ML proteinase K permeabilization와 B) 5 밀리그램 / ML 라이 소 자임, 3 μg / ML proteinase K에 permeabilization에 대한 측면 산란 결과 비교 전달 보여주 유동세포계측법의 도트 플롯. <img alt="그림 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> 그림 4. LNA 흐름 생선 결과의 히스토그램 분석. 각 샘플에서 생성된 형광 신호가 네 가지 성분에 의해 표시됩니다 : 블랙 - sRNA 특정 LNA 프로브, 빨간색 - &#39;비 표현 sRNA&#39;부정적인 제어, 파랑 - &#39;없이 LNA&#39;부정적인 제어, 보라색 -&#39;아니오 염색&#39;부정 제어할 수 있습니다.

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 제시 LNA 흐름 생선 방법은 그의 표현 이전에 microarray 기반 표현 프로 파일링 및 역방향 전사 중합 효소 사슬 반응 16을 통해 확인되었습니다 그람 음성 해양 박테리아 비브리오 campbellii에서 sRNA의 표현을 감지하는 데 사용되었다. 지금까지, 우리는 RNAs (단백질 활동 riboswitches, 그리고 mRNA를 조절 예를 들어 횡단 인코딩 sRNA, sRNA)의 다양한 표현을 모니터하기 위해이 방법을 사용했습니다. 따라서, 우리는 방법을 적용할 수 있으며 모든 sRNA 또는 mRNA 대상을 감지하고 어떤 세균 종 또는 셀 타입에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다 사용될 수 있다고 확신하고 있습니다. 이 프로토콜의 수정이 다른 세포 유형에 필요한 경우 조작 고려하는 가장 중요한 변수는 permeabilization 단계입니다. 예를 들어, 여기에서 설명한 permeabilization 조건을 수정할 때, 라이 소 자임하고 proteinase K의 농도 변화는 테스트를해야합니다. 우리는 또는 배로 증가를 발견라이 소 자임하고 proteinase K의 양을 tripling하면 LNA 흐름 생선 결과의 주요 변경 결과. 또한, 추가 permeabilization 조건을 테스트를 할 때, 세포는 세포 손실, 및 배경 형광 비율에 최고의 신호를 얻을 수 clumping에 대해 분석한다. 세포 clumping의 범위는 현미경 및 / 또는 유동세포계측법에 의해 테스트할 수 있습니다. 앞으로 대 측면 분산형 점 플롯과 올바른 permeabilization 방법에 꼬리이 붙었다 영향을 최소화하므로 유동세포계측법으로 세포 대단히 짧은 시간이 흐릅니다. 같은 digoxigenin 다른 haptens으로 표시 추가 LNA 프로브는 하이브 리다이 제이션 단계에서 추가한 후 안티 digoxigenin 항체 및 보조 항체 - 형광단의 활용과 포착할 수로이 방법도 설명 프로토콜에 대대적인 개조없이 멀티 플렉스 sRNA 검색 의무가 있습니다. 현재 우리가이 방법으로 발생하는 유일한 한계는 약하게 전에서 충분한 신호를 생성하기 위해 무능력이다누르면 sRNA 종 (种)과 노력 (셀 당 절대 사본 번호)를 탐지 임계값을 결정하기 위해 진행되고 있습니다. 전반적으로, LNA 흐름 물고기 방법은 존재 sRNA 종의 상대적 풍부하고 표현이 다양 정도에 대한 통찰력을 제공하는 높은 처리량 방식으로 단일 세포 수준에서 세균 sRNA 또는 mRNA 발현을 측정하는 기회를 제공 인구 인치

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 10X 인산은 식염수 (PBS), pH를 7.4 버퍼 </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease없는 물 </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (DEPC가 치료되지 않음) </td></tr><tr><td> 32 % paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> RT 15,714 </td><td> 에탄올 무료 </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 327,290,010 </td><td></td></tr><tr><td> 디에틸 pyrocarbonate (DEPC) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D5758 </td><tD&gt; 계속 desiccated </td></tr><tr><td> 라이 소 자임 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 MG / ML) </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Deionized, 나누어지는 및 동결 </td></tr><tr><td> Dextran 황산 MW&gt; 500,000 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D8906 </td><td> 나누어지는 60 % 솔루션과 동결 </td></tr><tr><td> Denhardt의 솔루션 50X 농축물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D2532 </td><td> 나누어지는 및 냉동 </td></tr><tr><td> 나트륨 구연산 버퍼 20X </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; 연어 정자 DNA (빠졌어) 10 밀리그램 / ML </td><td> 응용 Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> 나누어지는 및 냉동 </td></tr><tr><td> 효모 tRNA (10 MG / ML) </td><td> 생명 기술 / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> 나누어지는 및 냉동 </td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 원위치 하이브리드화 차단 용액에 5 배 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> 메가바이트 - 1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SA - 5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated 방지 streptavidin </td><td> 벡터 연구소 </td><td> BA - 0500 </td><td> 나누어지는 및 냉동 </td></tr></tbody></table>

옥내 핵산 흐름 cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (lna 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 rna 감지하는 방법

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광은 세포 환경에서 특정 핵산 시퀀스를 감지하고 집중하는 데 사용하는 강력한 기술입니다. 처리량을 향상시키기 위해, 생선은 개별 세포의 수천 대상 핵산 시퀀스의 감지를 활성화 유동세포계측법 (흐름 - 물고기)와 함께하실 수 있습니다. 각 셀을함으로써 강력한 통계와 분산 분석을 허용, 독립적인 관찰로 취급되기 때문에 그 결과, 흐름 - 물고기 lysate / 앙상블 기반의 핵산 검출 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 이러한 특성은 다른 응용 프로그램의 여러 물고기와 흐름 - 물고기 방법의 사용을하라는 메시지가 표시하고 이러한 방법의 유틸리티는 성공적으로 바이러스 증식을 모니터링, telomere 길이 결정 1,2, 휴대폰 식별 및 유전자 발현 3,4에서 보여준되었습니다 감염된 세포 5, 세균성 지역 사회의 분석 및 열거6. 전통적으로, 물고기와 흐름 - 물고기 방법의 특이성은 DNA의 oligonucleotide 프로브에 의해 이수했습니다. 최근 그러나 물고기와 흐름 - 물고기 프로브와 같은 핵산 analogs로의 DNA oligonucleotide 프로브의 교체로 인해 자연적인 핵산 7,8 이러한 analogs의 높은 용융 온도 (T m) 각 기법의 감도와 특이성을 모두 증가 . 옥내 핵산 (LNA) 프로브는 DNA 또는 RNA 시퀀스 9,10에 걸쳐 마약을 LNA 세포핵을 포함 핵산 아날로그의 유형입니다. 흐름 - 물고기와 결합하면, LNA 프로브는 이전에 기존의 DNA 프로브 7,11 들보다 뛰어난 실력을 보이고 표시되었습니다 성공적으로 오 포유 동물 세포의 진핵세포 mRNA 12 바이러스 RNA를 감지하는 데 사용되었습니다. 여기 우리는이 능력을 확장하고 세균 세포에서 RNA의 특정 감지를 허용 LNA 흐름 생선 방법을 설명의 (그림 1). 특히, 우리의 검색에 관심이있는 작은 비 코딩 그들은 많은 중요한 세포 과정 13 주요 규제 요소 역할을하는 것으로 확인되었습니다대로 지난 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고있다 규제 RNA (sRNA을). 그러나, sRNAs 및 박테리아 세포에 sRNA을 감지의 도전 연구에 국한 도구 부분에 상대적으로 작은 크기 (일반적으로 길이 50​​-300 세포핵)와 sRNA 분자의 낮은 풍부한뿐만 아니라 작업의 일반적인 어려움으로 인해 없습니다 세포 세포막을 변화와 함께 작은 생물 학적 세포와 함께. 이 방법에서는, 우리는 세균 세포의 구조를 보존하고 LNA 프로브의 침투뿐만 아니라 낮은 풍부한 sRNA의 특정 검출 (그림 2)를 활성화 신호 증폭 단계를 허용 고정하고 permeabilzation 조건을 설명합니다.

소설 높은 처리량 방법은 고정 핵산 프로브 및 흐름 cytometry - 형광을 사용하여 하나의 세균 세포의 발견과 작은 RNA와 mRNA의 표현의 상대 quantitation 수있게되는 설명<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션.

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

형광 인시튜 하이브리다이제이션(Fluorescence in situ hybridization, FISH)은 세포 내의 특정 핵산 서열을 검출하고 국소화하는 데 사용되는 강력한 기술입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 개별 박테리아 세포 내에서 박테리아 RNA의 발현을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 5' 말단에 biotin TEG 변형이 포함된 locked nucleic acid 또는 LNA 프로브를 설계함으로써 수행됩니다. 이후 박테리아 세포를 고정하고 dathyl, percarbonate 또는 dsy로 처리한 다음 투과화하면, RNA가 변성되고 LNA 프로브가 하이브리드화됩니다.셋째로, 세포를 세척하고 블로킹한 후 염색합니다. 마지막으로, 유세포 분석법을 통해 세포 형광을 측정합니다. 결과적으로 시간 경과에 따른 RNA 발현의 변화와 개별 집단 내의 변화를 평가할 수 있습니다.이 방법은 단일 세포 내 RNA 종의 상대적인 존재 및 풍부도와, 균질하거나 이질적인 집단 내에서 이러한 발현이 변화하는 정도에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 이 방법은 박테리아 소형 RNA 발현을 모니터링하는 데 사용되고 있지만, 이론적으로는 잠재적으로 모든 세포 유형의 RNA를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. LNA 프로브 서열을 설계한 후, blast를 사용하여 프로브가 목적하는 SRNA 또는 mRNA에만 특이적인지 확인하십시오.프로브를 주문할 때, LNA 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 biotin TEG 수식어를 추가하십시오. 비오틴 수식은 stripped avid 및 di 접합물을 이용한 하이브리드화 후 염색에 필요합니다. 해당 방법에는 세 가지 음성 대조군이 포함되어야 하며, 그중 하나는 하이브리드화 과정에서 LNA 프로브를 첨가하지 않는 LNA 미첨가 대조군입니다.두 번째 단계는 LNA 프로브가 표적 sRNA에 하이브리드화되지만, 형광 염색제가 없어 하이브리드화 사건이 검출되지 않는 No-dye 대조군입니다. 세 번째는 비특이적 하이브리드화를 모니터링하기 위해 존재하지 않거나 발현되지 않는 sRNA를 표적으로 하는 LNA 프로브를 사용하는 비발현 sRNA 또는 mRNA 대조군입니다. 먼저 목적 균주 1×10⁸ cells를 수확하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 2300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 펠렛화합니다.디캔팅하지 말고 피펫팅을 통해 상층액을 제거합니다. 다음으로 펠렛을 400 µL의 PBS에 재현탁하고, 400 µL의 A PFA acetic acid PBS 고정액을 첨가하여 세포를 잘 섞어줍니다. 이제 이 현탁액을 25 °C에서 10분 동안 배양합니다.세포를 다시 원심분리한 후 5분 뒤에 한 번 더 볼텍싱합니다. 이때 원심분리 조건은 4,500 ×g에서 2분간으로 합니다. 펠렛을 400 µL의 PBS로 2회 세척합니다.마지막으로 펠렛을 400 µL의 PBS에 다시 현탁하고, 고정된 세포를 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하십시오. 먼저 신선하게 제조된 1% dsy 용액 400 µL를 각 고정된 박테리아 세포 샘플에 첨가합니다. 그런 다음 피펫팅을 통해 세포 용액을 잘 혼합합니다.이 혼합물을 25 °C에서 12분 동안 배양한 후, 400 µL의 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 갓 조제한 lysozyme 용액 800 µL를 세포에 첨가합니다. vortexing을 통해 세포 lysozyme 용액을 충분히 혼합하고, 가끔씩 섞어주면서 25 °C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠렛에 갓 조제한 proteinase K 용액 800 µL를 첨가하고 파이펫팅을 통해 재현탁된 세포 용액을 충분히 혼합합니다.세포를 25 °C에서 15분 동안 배양하며, 배양 기간의 중간 지점에서 볼텍싱을 수행합니다. 원심 분리 후 400 µL의 PBS로 세포를 세척하고, 다시 400 µL의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 현탁액 100 µL씩을 4개의 개별 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣은 다음, 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 이제 4개의 샘플 모두에 100 µL의 하이브리다이제이션 버퍼를 넣고 60 °C에서 60분 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션 후, 점성이 있는 하이브리다이제이션 용액에서 세포를 분리할 수 있도록 하이브리다이제이션 혼합물에 1 mL의 SSC plus tween 20 또는 SSCT를 첨가합니다.세포를 펠렛화한 후, 펠렛에 200 µL의 form amide SSCT 용액을 첨가하고 충분히 혼합합니다. 그런 다음 가열 블록을 사용하여 샘플을 65 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 혼합물에 1 mL의 SSCT를 첨가하고 세포를 다시 한번 펠렛화한 후, 세포를 500 µL의 SSCT에 재현탁시키고 가열 블록 위에서 세포 용액을 40분 동안 배양합니다.펠렛팅 후, 하이브리드화된 세포 펠렛에 블로킹 버퍼 200 µL를 첨가하고 25 °C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 펠렛팅 후, 염료 무첨가 대조군(no dye control)을 위해 세포 펠렛에 stripped avid 및 염료 용액 50 µL를 다시 첨가하고 세포를 충분히 혼합합니다. 블로킹 버퍼 50 µL를 첨가합니다.모든 샘플을 알루미늄 호일로 빛이 차단되도록 감싼 뒤, 써모 믹서(thermo mixer)를 사용하여 25 °C에서 계속 혼합하며 12분 동안 추가로 배양합니다. 그다음, 500 µL의 SSCT 버퍼로 한 번, 400 µL의 PBS plus tween 20(또는 PBST)로 한 번 세포를 세척합니다. 상층액을 제거한 후, biotinylated antis, strippin 및 PBS 100 µL를 첨가하고 25 °C에서 가끔씩 혼합하며 30분 동안 배양합니다. 이 항체는 이전 단계에서 도입된 strippin DI 접합체에 결합하게 됩니다.그 후 세포를 펠렛팅하고 400 µL의 PBST로 두 번 세척한 다음, stripping된 avid 및 염료 용액 50 µL를 세포에 첨가하고 충분히 혼합하여 두 번째 염색을 수행합니다. 이 단계는 염료 미첨가 대조군(no dye control)의 하이브리드화된 LNA 프로브당 신호 출력을 증가시킵니다. 다시 블로킹 버퍼만 50 µL 첨가한 후, 모든 튜브를 서모믹서(thermo mixer)에서 25 °C로 12분 동안 지속적으로 혼합하며 배양합니다.염색 용액으로 배양한 후, 세포를 500 µL의 SSCT 버퍼로 다시 한 번 세척하고, 두 번째 세척 후에는 400 µL의 PBST로 한 번 더 세척합니다. 펠렛을 200 µL의 PBST에 다시 현탁하고, 유세포 분석을 수행할 때까지 세포를 4 °C에서 보관합니다. 크기가 작은 박테리아 세포의 경우, 코어 크기를 줄이기 위해 유세포 분석기의 유속을 느리게 설정하십시오. 또한, 전방 산란 임계값(forward scatter threshold cutoffs)이 있는 유세포 분석기의 경우, 작은 박테리아 세포가 확실히 검출될 수 있도록 임계값을 최대한 낮게 설정하십시오.앞서 설명한 조건을 사용했을 때 세포가 효과적으로 고정 및 투과화된 예가 여기 유세포 분석 도트 플롯에 나타나 있습니다. 투과화 단계에서 세포군은 작고 균일하며, 이는 세포 응집체가 거의 없음을 나타냅니다. 그러나 더 높은 농도의 lysozyme을 사용할 경우, 세포가 응집될 가능성이 더 높아지며, 이 도트 플롯에서 볼 수 있듯이 더 큰 입자를 나타내는 전방 산란(forward scatter) 값이 증가합니다.성공적인 LNA flow fish 실험에서 얻은 유세포 분석 데이터의 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 히스토그램은 세 가지 음성 대조군과 함께 타겟 SRNA의 특이적 검출을 보여줍니다. 보라색으로 표시된 다이(dye) 미첨가 음성 대조군에서 형광이 가장 낮게 나타났으며, 이어서 파란색의 LNA 미첨가 및 빨간색의 비발현 SRNA 음성 대조군 순으로 나타났습니다.마지막으로, SRNA 특이적 LNA 프로브를 포함한 샘플이 검은색 배경에서 가장 강한 형광을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 정확하게 수행했을 때 약 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 R-T-P-C-R보다 더 많은 정보를 제공하며 비용 효율적입니다.이 절차에 따라 다른 HAPS로 추가 프로브를 표지하고 하이브리다이제이션 단계에서 첨가함으로써 다중 RNA 검출이 가능합니다.I.

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

본 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하기 위한 RNA 형광 in situ 교잡의 방법을 기술한다.

인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 LNA-FISH와 유세포 분석을 이용한 단일 세균 세포 내 소형 RNA 검출 방법을. 생물학적 연구에서 RNA 발현 변화를 정량적으로 분석할 수 있는 고효율 기술입니다.

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

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