옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 개별 박테리아 세포 내에서 박테리아 RNA의 발현을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 5' 말단에 biotin TEG 변형이 포함된 locked nucleic acid 또는 LNA 프로브를 설계함으로써 수행됩니다. 이후 박테리아 세포를 고정하고 dathyl, percarbonate 또는 dsy로 처리한 다음 투과화하면, RNA가 변성되고 LNA 프로브가 하이브리드화됩니다.

셋째로, 세포를 세척하고 블로킹한 후 염색합니다. 마지막으로, 유세포 분석법을 통해 세포 형광을 측정합니다. 결과적으로 시간 경과에 따른 RNA 발현의 변화와 개별 집단 내의 변화를 평가할 수 있습니다.

이 방법은 단일 세포 내 RNA 종의 상대적인 존재 및 풍부도와, 균질하거나 이질적인 집단 내에서 이러한 발현이 변화하는 정도에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 이 방법은 박테리아 소형 RNA 발현을 모니터링하는 데 사용되고 있지만, 이론적으로는 잠재적으로 모든 세포 유형의 RNA를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. LNA 프로브 서열을 설계한 후, blast를 사용하여 프로브가 목적하는 SRNA 또는 mRNA에만 특이적인지 확인하십시오.

프로브를 주문할 때, LNA 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 biotin TEG 수식어를 추가하십시오. 비오틴 수식은 stripped avid 및 di 접합물을 이용한 하이브리드화 후 염색에 필요합니다. 해당 방법에는 세 가지 음성 대조군이 포함되어야 하며, 그중 하나는 하이브리드화 과정에서 LNA 프로브를 첨가하지 않는 LNA 미첨가 대조군입니다.

두 번째 단계는 LNA 프로브가 표적 sRNA에 하이브리드화되지만, 형광 염색제가 없어 하이브리드화 사건이 검출되지 않는 No-dye 대조군입니다. 세 번째는 비특이적 하이브리드화를 모니터링하기 위해 존재하지 않거나 발현되지 않는 sRNA를 표적으로 하는 LNA 프로브를 사용하는 비발현 sRNA 또는 mRNA 대조군입니다. 먼저 목적 균주 1×10⁸ cells를 수확하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 2300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 펠렛화합니다.

디캔팅하지 말고 피펫팅을 통해 상층액을 제거합니다. 다음으로 펠렛을 400 µL의 PBS에 재현탁하고, 400 µL의 A PFA acetic acid PBS 고정액을 첨가하여 세포를 잘 섞어줍니다. 이제 이 현탁액을 25 °C에서 10분 동안 배양합니다.

세포를 다시 원심분리한 후 5분 뒤에 한 번 더 볼텍싱합니다. 이때 원심분리 조건은 4,500 ×g에서 2분간으로 합니다. 펠렛을 400 µL의 PBS로 2회 세척합니다.

마지막으로 펠렛을 400 µL의 PBS에 다시 현탁하고, 고정된 세포를 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하십시오. 먼저 신선하게 제조된 1% dsy 용액 400 µL를 각 고정된 박테리아 세포 샘플에 첨가합니다. 그런 다음 피펫팅을 통해 세포 용액을 잘 혼합합니다.

이 혼합물을 25 °C에서 12분 동안 배양한 후, 400 µL의 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 갓 조제한 lysozyme 용액 800 µL를 세포에 첨가합니다. vortexing을 통해 세포 lysozyme 용액을 충분히 혼합하고, 가끔씩 섞어주면서 25 °C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠렛에 갓 조제한 proteinase K 용액 800 µL를 첨가하고 파이펫팅을 통해 재현탁된 세포 용액을 충분히 혼합합니다.

세포를 25 °C에서 15분 동안 배양하며, 배양 기간의 중간 지점에서 볼텍싱을 수행합니다. 원심 분리 후 400 µL의 PBS로 세포를 세척하고, 다시 400 µL의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 현탁액 100 µL씩을 4개의 개별 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣은 다음, 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 이제 4개의 샘플 모두에 100 µL의 하이브리다이제이션 버퍼를 넣고 60 °C에서 60분 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션 후, 점성이 있는 하이브리다이제이션 용액에서 세포를 분리할 수 있도록 하이브리다이제이션 혼합물에 1 mL의 SSC plus tween 20 또는 SSCT를 첨가합니다.

세포를 펠렛화한 후, 펠렛에 200 µL의 form amide SSCT 용액을 첨가하고 충분히 혼합합니다. 그런 다음 가열 블록을 사용하여 샘플을 65 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 혼합물에 1 mL의 SSCT를 첨가하고 세포를 다시 한번 펠렛화한 후, 세포를 500 µL의 SSCT에 재현탁시키고 가열 블록 위에서 세포 용액을 40분 동안 배양합니다.

펠렛팅 후, 하이브리드화된 세포 펠렛에 블로킹 버퍼 200 µL를 첨가하고 25 °C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 펠렛팅 후, 염료 무첨가 대조군(no dye control)을 위해 세포 펠렛에 stripped avid 및 염료 용액 50 µL를 다시 첨가하고 세포를 충분히 혼합합니다. 블로킹 버퍼 50 µL를 첨가합니다.

모든 샘플을 알루미늄 호일로 빛이 차단되도록 감싼 뒤, 써모 믹서(thermo mixer)를 사용하여 25 °C에서 계속 혼합하며 12분 동안 추가로 배양합니다. 그다음, 500 µL의 SSCT 버퍼로 한 번, 400 µL의 PBS plus tween 20(또는 PBST)로 한 번 세포를 세척합니다. 상층액을 제거한 후, biotinylated antis, strippin 및 PBS 100 µL를 첨가하고 25 °C에서 가끔씩 혼합하며 30분 동안 배양합니다. 이 항체는 이전 단계에서 도입된 strippin DI 접합체에 결합하게 됩니다.

그 후 세포를 펠렛팅하고 400 µL의 PBST로 두 번 세척한 다음, stripping된 avid 및 염료 용액 50 µL를 세포에 첨가하고 충분히 혼합하여 두 번째 염색을 수행합니다. 이 단계는 염료 미첨가 대조군(no dye control)의 하이브리드화된 LNA 프로브당 신호 출력을 증가시킵니다. 다시 블로킹 버퍼만 50 µL 첨가한 후, 모든 튜브를 서모믹서(thermo mixer)에서 25 °C로 12분 동안 지속적으로 혼합하며 배양합니다.

염색 용액으로 배양한 후, 세포를 500 µL의 SSCT 버퍼로 다시 한 번 세척하고, 두 번째 세척 후에는 400 µL의 PBST로 한 번 더 세척합니다. 펠렛을 200 µL의 PBST에 다시 현탁하고, 유세포 분석을 수행할 때까지 세포를 4 °C에서 보관합니다. 크기가 작은 박테리아 세포의 경우, 코어 크기를 줄이기 위해 유세포 분석기의 유속을 느리게 설정하십시오. 또한, 전방 산란 임계값(forward scatter threshold cutoffs)이 있는 유세포 분석기의 경우, 작은 박테리아 세포가 확실히 검출될 수 있도록 임계값을 최대한 낮게 설정하십시오.

앞서 설명한 조건을 사용했을 때 세포가 효과적으로 고정 및 투과화된 예가 여기 유세포 분석 도트 플롯에 나타나 있습니다. 투과화 단계에서 세포군은 작고 균일하며, 이는 세포 응집체가 거의 없음을 나타냅니다. 그러나 더 높은 농도의 lysozyme을 사용할 경우, 세포가 응집될 가능성이 더 높아지며, 이 도트 플롯에서 볼 수 있듯이 더 큰 입자를 나타내는 전방 산란(forward scatter) 값이 증가합니다.

성공적인 LNA flow fish 실험에서 얻은 유세포 분석 데이터의 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 히스토그램은 세 가지 음성 대조군과 함께 타겟 SRNA의 특이적 검출을 보여줍니다. 보라색으로 표시된 다이(dye) 미첨가 음성 대조군에서 형광이 가장 낮게 나타났으며, 이어서 파란색의 LNA 미첨가 및 빨간색의 비발현 SRNA 음성 대조군 순으로 나타났습니다.

마지막으로, SRNA 특이적 LNA 프로브를 포함한 샘플이 검은색 배경에서 가장 강한 형광을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 정확하게 수행했을 때 약 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 R-T-P-C-R보다 더 많은 정보를 제공하며 비용 효율적입니다.

이 절차에 따라 다른 HAPS로 추가 프로브를 표지하고 하이브리다이제이션 단계에서 첨가함으로써 다중 RNA 검출이 가능합니다.I.