Name: Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 학습하세요 Drosophila 유충의 감각 신경 세포 수상돌기에서 미세소관을 면역형광으로 라벨링하는 방법을. 이 기법은 신경 발달 연구에 필수적인 미세소관 조직화를 시각화합니다.

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우리는 자금에 대한 RIKEN 주셔서 감사합니다. P10 - Gal4은 알랭 빈센트 (Université 폴 Sabatier, 툴루즈, 프랑스)의 일종 선물했다.

1. 시약의 준비 시작하기 전에주의 사항 : 해부 및 immunohistochemical 얼룩은 자기 챔버에서 수행되고 유충은 특별히 모양의 곤충 핀을 사용하여 넘어뜨린 것입니다. 자기 챔버 건설, 이들 핀의 준비에 대한 자세한 지침은 관련 참고 문헌 14,15에서 찾을 수 있습니다. 간단히, 1x1cm의 사각형 구멍은 자성 시트 및 소형 챔버를 만들기 위해 시트의 뒤쪽에 부착된 coverslip으로 절단됩니다. 챔버의 측면은 에폭시 접착제로 봉인되며이 접착제는 챔버가 사용하기 전에 70 % 에탄올로 여러 번 씻어입니다 설정한 후. 해부의 곤충 핀은 필요한 모양 벤딩하여 준비하고 금속 탭을 14,15에 붙어 있습니다. 또는 금속 탭을 우리는 컷오프 노란색 팁 만든 핸들 거꾸로 플랫 헤드 스틸 그리기 핀을 사용합니다. 이 자기 ​​챔버 배열의 사용이 가까이 제어 ove 수 있습니다R 핀 위치와 조직 해부 동안 스트레칭. DA 뉴런의 조사관의 다른 하위 집합에 리포터 유전자 발현을 유발하기 위해서는 몇 가지 Gal4 행 (시모노 및 동료 16 요약)를 사용할 수 있습니다. 이 라인의 대부분은 공공 주식 센터에서 사용할 수 있습니다. 이 대표 프로토콜에서는, 우리는 DA 신경 세포의 대조되는 두 클래스가 공동으로 표시되는 라인의 immunostaining 수행 : 가장 간단한 클래스 I 및 가장 복잡한 수준의 IV (P10 - Gal4 17,18, UAS - mCD8 : : Kusabira - 오렌지 (KO)). <ol><li> 칼슘 + + 무료 HL3.1 염분 준비 <ol><li> MM 년 : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 자당, 5 trehalose, 산도 7.2 19. 필터 소독 및 저장 4 ° C. 참고 : 칼슘 + + 무료 솔루션 해부하는 동안 근육 수축을 방지합니다. </li></ol></li><li> 2X PHEM 버퍼를 준비 <ol><li> MM 년 : 130 파이프, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; 산도 7.0. 필터 소독 및 저장 4 ° C. 참고 : 산도가 7.0 접근 때까지이 자료는 용해되지 않습니다. </li></ol></li><li> 고정 바로 앞에 갓 정착액을 준비합니다. <ol><li> 50ml 팔콘 튜브에 25ml 솔루션을 먼저 믹스 2g의 paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH와 10ml의 물을 준비하기 위해서. </li><li> 솔루션 분명히 때까지 흔드는와 55 ° C의 물을 욕조에 정착액 흔들어. (총 부피는 11.5에 대한 ML됩니다.) </li><li> 얼음 쿨 정착액. </li><li> 12.5ml 2X PHEM 버퍼를 추가합니다. </li><li> 1M HCL과 7.0 산도를 조정합니다. </li><li> 볼륨이 25ml가 될 때까지 물로 솔루션을 채우십시오. </li><li> 워트 먼지 종이를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li></ol></li></ol> 2. 애벌레 해부 시작하기 전에 참고 : 감각 dendrites 이들 특히 미세 소관 네트워크를, 그리고 신경 쇠약 증세는 절개의 개시 이후 급속하게됩니다. 교류즉각적인 고정 다음 채 5 분 빠른 절개를 hieving하면이 프로토콜의 성공의 핵심 요인입니다. <ol><li> 물에 유충을 씻고 빠르게 머리카락 루프를 사용하여이 드롭으로 그들을 이동합니다. </li><li> 유리에 동양의 유충 등의 측면까지와 복부 쪽. 참고 :이 방향은 복부 클러스터 신경을 검사하는 것입니다. 지느러미 클러스터 신경을 검사하려면 방향을 반전. </li><li> 입 후크 근처 앞쪽에 끝을 핀에 가운데 곤충 핀을 사용합니다. 최상의 결과를 얻으려면 끝에 가까운 핀을 삽입합니다. </li><li> 해부 실에서 HL3.1 식염수 한 방울을 넣으십시오. </li><li> microscissors와 유충의 가장 뒷부분 팁을 잘라. 참고 :이 단계는 microscissors (2.7 단계)에 대한 액세스를 허용합니다 유충의 사후 끝에 구멍을 엽니다. </li><li> 포셉 지금 유충의 사후 끝에 구멍 밖으로 삐져는 창자의 영역과 함께 잡아. 부드럽게 전체 창자를 꺼내. </li><li> 을 장소앞쪽에 향해 배면의 중간선에 따라 조리개와 컷을 통해 microscissors 중 하나 블레이드의 팁. </li><li> 코너 핀 사용하여 다음 앞쪽에 첫번째 사후 지금 무료로 모서리를, 핀. 동시에 부드럽게 애벌레 등심을 열고 스트레칭. </li></ol> 3. 고정, 차단 얼룩, 그리고 애벌레 필레의 장착 시작하기 전에주의 사항 : 모든 고정 및 얼룩 단계는 절개 챔버에서 수행됩니다. 이 과정에서,이 조직의 손상을 초래할 수 있으므로 유충을 잡고 곤충 핀을 노크하지 않도록주의합니다. 밖으로 건조에서 실험을 방지하기 위해 moistened 조직으로 둘러싸인 작은 파티 간다 구 컨테이너의 모든 얼룩 단계를 않습니다. <ol><li> 노란 팁을 사용하여 칼슘 + + 무료 HL3.1 버퍼를 기음. 즉시 다른 pipetteman을 사용하여 정착액을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 칼슘 + + 무료 HL3.1 버퍼의 남은 흔적과 정착액를 섞어 아래 피펫과챔버 인치 즉시 대기음 후 챔버에 신선한 정착액을 추가합니다. </li><li> 20 분 상온에서 부화. </li><li> PBST에서 배의 상업 중심지 (0.1 %를 튼과 PBS에서 X - 100) 씻으십시오. </li><li> RT에서 20 분 대한 PBST로 5 % 염소 혈청과 차단. </li><li> PBST로 5 % 염소 혈청으로 희석 주 항체와 차단 솔루션을 교체합니다. 사용하는 기본 항체는 마우스 방지 α - Tubulin (DM1A)와 쥐 안티 CD8 (5H10) 모두 희석 1천분의 1입니다. 참고 : 조사는 (토론 참조) 마우스 방지 Futsch (22C10) 일부 상황에서는 20,21 희석 1,000분의 1과 마우스 방지 α - Tubulin (DM1A)를 대체하실 수 있습니다. </li><li> 4 (적어도 16h)을 밤새 품어 ° C. </li><li> PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오. </li><li> PBST로 5 % 염소 혈청의 희석 보조 항체 솔루션을 추가합니다. 사용되는 이차 항체는 알렉사 형석 488 염소 안티 - 마우스 IgG와 Cy3 당나귀 안티 쥐 IgG 수 있습니다. 형광단을 방지하기 위해 적용 샘플을 유지22 사진 표백. </li><li> 두 시간 동안 RT에서 부화하거나, 또는 야간 4 ° C 상온에서 한 시간 따라갔다. </li><li> PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오. </li><li> 슬라이드 아래 표피 사이드에있는 애벌레 필릿를 놓고, 80 % 글리세롤에 마운트하고, &#39;빠른&#39;마운트를 위해 매니큐어로 coverslip의 측면을 봉쇄. 참고 : 조직 개선 삭제하고 영구적으로 안정적인 예제, DPX에 마운트 이전 23 설명된대로. </li></ol> 4. 대표 결과 : 형광 염색법은 공촛점 현미경으로 조사되었다. 그림에서는 dendrite 아버 이내에 1-2, 다른 지점 다른 cytoskeletal 조직을했습니다. 그림 1은 1 일 instar 애벌레 단계에서 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. KO는 및 보조 안티 CD8 항체 및 형광 (Cy3)을 사용하여 검색 : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다. Tubulin은 안티 α - Tubulin 항체 및 형석을 사용하여 감지escent 보조 (알렉사 형석 488). 주요 지점은 Tubulin 양성 반응이 일부 얇은 사이드 가지 Tubulin - 아무것도 없습니다. 영화 1 클래스 I DA 뉴런과 비슷한 얼룩을 통해 시리얼 섹션의 집합입니다. 그림 2는 1 일 instar 애벌레 단계에서 Futsch와 CD8에 대한 항체 물들일 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. 주요 지점 Futsch - 긍정, 일부 얇은 사이드 가지 Futsch - 아무것도 없습니다. 그림 3. 애벌레 바디 벽 Tracheae은 복잡한 미세 소관 조직을 보여줍니다. 영화 2, 3 바디 벽의 근육과 기관을 통해 얼룩의 시리얼 섹션을 표시합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" /> 그림 1. 그림. 1 1 일 instar 애벌레 단계에서 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다 : KO 및 안티 - CD8 항체 및 형광 보조 (Cy3)을 사용하여 발견했습니다. Tubulin은 안티 - &amp; - Tubuli를 사용하여 감지N 항체 및 형광 보조 (알렉사 488). 기본에 패널 AC 순차적 공촛점 Z - 섹션 (0.5μm), C&#39; - C &quot;와 (과 노란색 화살촉) 또는 microtubules가 강조 표시됩니다 (보라색 화살촉)가없는 지점의 패널 C. 예제에서 단일 항체 얼룩. 레드 화살촉 하이라이트 microtubules 상피 세포. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" /> 그림 2. 그림. 2 1 일 instar 애벌레 단계에서 Futsch와 CD8에 대한 항체 물들일 클래스 IV 다 신경 세포의 아버과 비슷한 영역을 보여줍니다. : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다 : KO 및 안티 - CD8 항체 및 형광 보조 (Cy3)을 사용하여 발견했습니다. Futsch는 안티 Futsch 항체 및 형광 보조 (알렉사 488)를 사용하여 감지됩니다. 주요 지점 Futsch - 긍정, 일부 얇은 사이드 가지 Futsch - 아무것도 없습니다. 와 (과 노란색 화살촉) 또는 (보라색 화살촉) Futsch하지 않고 가지의 예제가 강조 표시됩니다. 그림 3. 기관은 위에서 설명한 안티 Tubulin 프로토콜을 사용하여 얼룩. 이 유충은 셋째 instar하고 이전에 23,24을 설명한대로 해부 했어요. 영화 3 사각형으로 표시된 필드에서 확대 시리얼 섹션을 보여줍니다. 영화 1. 직렬 부분은 내가 신경 클래스의 돌기 아버 걸쳐 Tubulin의 얼룩을 추적. KO (마젠타) 및 보조 안티 CD8 항체 및 형광 (Cy3)을 사용하여 검색 : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다. Tubulin은 (녹색) 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 몸매에 Tubulin의 얼룩을 추적 영화 2. 직렬 섹션삼분의 일 instar의 유충의 Y 벽의 근육. Tubulin은 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 동영상 3. Figure.3에 사각형으로 표시된 삼분의 일 instar의 유충의 시체가 벽에 기관에서 Tubulin의 얼룩을 추적 시리얼 섹션. Tubulin은 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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그것을 달성하는 방법 복잡한 세포 모양 이해하기 위해서는 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 분석 미세 소관 기관에 대한 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명합니다. 얼룩 감각 신경뿐만 아니라,이 방법은 기관, 근육 및 다른 신체 벽면 조직의 강력한 immunohistological 얼룩을 구현합니다. 우리는 DA의 뉴런의 개발 감각 dendrites의 미세 소관 조직을 검사하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. 이러한 dendrites가 부상을 입거나 스트레스 25에 민감하고, 해부 23 시작 이후 빠른 속도로 다운 휴식. 해부 다섯 분 이내에 실시하여야한다. 기관 및 기타 바디 벽의 조직에 Microtubules 더 안정됩니다. 이 프로토콜은 신경근육학 접합 14,15의 분석을 위해 애벌레 필레 준비를 사용하는 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 수 </th><th> 댓글 (선택 사항) </th></tr><tr><td> 집게 </td><td> 뒤몽 </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Microscissors </td><td> FST </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 α - tubulin (복제 : DM1A) </td><td> 시그마 </td><td> T9026 </td><td> 희석 1,000분의 1 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 Futsch (복제 : 22C10) 표면에 뜨는 </td><td> 발달 연구 하이 브리 도마 은행 </td><td> 22C10 </td><td> 희석 1,000분의 1 </td></tr><tr><td> 쥐 방지 CD8 (복제 : 5H10) </td><td> Caltag </td><td> MCD0800 </td><td> 희석 1,000분의 1 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 안티 - 마우스 IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11001 </td><td> 희석 5백분의 1 </td></tr><tr><td> Cy3 안티 쥐 IgG </td><td> 잭슨 Immunoresearch </td><td> 712-166-150 </td><td> 희석 200분의 1 </td></tr></tbody></table>

immunohistological 감각 신경 세포의 dendrites에 microtubules의 라벨링, tracheae, 그리고 근육에 drosophila 유충 바디 벽

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

복잡한 세포 형태의 차이가 달성되는 방법을 이해하기 위하여, 정확하게 미세 소관 조직을 수행하는 것이 중요합니다. Drosophila 애벌레 바디 벽이 세포와 조직 morphogenesis을 연구하는 모델 몇 가지 세포 유형이 포함되어 있습니다. 예를 들어 tracheae는 튜브 morphogenesis 1, Drosophila의 유충의 감각 뉴런은 일반의 해설과 모수 석의 차별화 2-5와 퇴보 6 신경 세포 수준의 특정 메커니즘에 대한 기본 시스템이되고있는 돌기 arborization (DA)를 검사하는 데 사용됩니다 . dendrite 가지의 모양은 신경 세포 클래스 사이에 크게 다릅니다, 심지어는 하나의 신경 세포 7,8의 다른 지점 사이에 있습니다. DA의 뉴런의 유전자 연구는 차동 cytoskeletal 조직이 돌기 지점 모양 4,9-11의 형태학의 차이를 기초 수있는 것이 좋습니다. 우리에게 강력한 면역 라벨 방법을 제공DA 감각 신경 dendrite 아버의 생체내의 미세 소관 기관 (그림 1, 2, 영화 1) ssay. 이 프로토콜은 먼저 instar의 유충의 해부와 immunostaining, 활성 감각 신경 세포의 dendrite의 파생물 및 분기 조직 12,13을 발생하는 단계를 보여줍니다. 감각 뉴런을 얼룩뿐만 아니라,이 방법은 강력한 근육의 미세 소관 조직의 라벨 (영화 2, 3),기도 (그림 3, 영화 3), 기타 신체 벽의 조직을 실현하고 있습니다. 그런 메커니즘을 조사하면 신체 벽에 현장에서 미세 소관 조직을 분석하고자 조사에 대한 가치가 컨트롤 조직 및 세포 모양.

등의 연결을 dendrites 같은 복잡한 세포 모양은, 개발하는 동안 달성하는 방법 이해하기 위하여, 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 미세 소관 조직, 기관, 근육을 검토하는 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명 및 기타<em&gt; Drosophila</em&gt; 유충 바디 벽 조직.

Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽

복잡한 세포 형태의 차이가 어떻게 형성되는지 이해하기 위해서는 미세소관 조직화를 정확하게 추적하는 것이 중요합니다. 초파리 유충의...

본 절차의 전반적인 목표는 초기 단계 초파리 유충의 감각 뉴런 수상돌기 내 미세소관을 표지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 자성 해부 챔버에 유충을 고정한 다음, 빠르게 해부하여 유충 필렛(filet) 상태로 만듭니다. 그 후 자성 챔버 내에서 필렛을 즉시 고정하고 면역 염색을 진행합니다.마지막 단계는 조직을 고정하는 것이며, 이후 공초점 면역형광 현미경을 통해 도파민성 감각 뉴런의 돌기 내 미세소관 분포를 확인할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Ol Kareem입니다. 오늘은 유충 체벽의 감각 뉴런 돌기, 기관 및 근육 내 미세소관의 면역 조직 화학적 표지에 대한 프로토콜을 시연하겠습니다.이 방법은 말초 감각 뉴런 내 Myco TL 조직에 대한 통찰을 제공하도록 설계되었습니다. 또한, 이는 유충 체벽의 Myco TL 네트워크 및 기타 세포 유형과 조직 연구에 적용될 수 있습니다. 시작하기에 앞서, 이 프로토콜의 성공을 위해서는 고정액을 프로토콜 시작 직전에 신선하게 제조하는 것이 매우 중요합니다.계통의 유전적 배경 또한 매우 중요합니다. 예를 들어, 신경세포의 수지상 돌기 분지화를 조사하려면 MCDA cherry 또는 MCDA, RA orange와 같이 해당 신경세포의 세포막에 표지자가 발현되는 개체를 선택하십시오. 헤어 루프를 사용하여 1령 유충을 빠르게 물로 세척한 후 해부 챔버로 옮깁니다.이제 복측 군집 뉴런을 관찰하려면, 유충의 등쪽이 위로 향하고 배쪽이 유리에 닿도록 배치하십시오. 등측 군집 뉴런을 관찰하려면 곤충 핀을 사용하여 방향을 반전시키고, 입 갈고리 근처의 앞쪽 끝부분을 고정하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 핀을 끝부분에 가깝게 배치하십시오.미세 및 삼중 네트워크, 특히 센서가 장착된 DDR의 네트워크는 해부 시작 후 빠르게 분해됩니다. 첫 해부를 성공적으로 수행하고 빠르게 고정하는 것이 이 프로토콜의 성공을 결정짓는 핵심 요소입니다. 핀셋을 사용하여 마이크로 가위로 유충의 최후단부를 절단하십시오.새로 만든 절개창 밖으로 돌출된 장 조직을 잡고 전체 장을 조심스럽게 끌어냅니다. 이제 미세 가위의 날 하나를 동일한 절개창에 삽입하고 복측 정중선을 따라 전방으로 절개합니다. 이제 자유로워진 후방 모서리들을 핀으로 고정하고, 필요한 경우 유충 필렛을 조심스럽게 펼쳐줍니다.남은 내부 장기를 빠르게 제거합니다. 그 후, 취약한 미세소관을 보존하기 위해 즉시 고정 단계로 진행합니다.피펫을 사용하여 칼슘이 제거된 HL 3.1 버퍼를 흡입함과 동시에 챔버를 갓 준비한 고정액으로 즉시 채웁니다. 다른 피펫을 사용하여 희석된 고정액을 즉시 교체합니다. 모든 고정 및 방치 단계는 해부 챔버 내에서 신선한 고정액을 사용하여 수행합니다.이 과정 동안, 유충을 고정하고 있는 곤충 핀을 건드리지 않도록 주의하십시오. 이는 조직 손상을 유발할 수 있습니다. 이제 실온에서 20분 동안 방해 없이 고정을 진행하여 고정 단계를 마무리하십시오. PBST로 10분씩 6회 세척하여 유충 필렛을 깨끗하게 씻어내십시오.따라서, 유충을 실온에서 총 1시간 동안 고정액이 제거될 때까지 깨끗이 세척합니다. 배양 중 교반은 불필요하며, 이는 의도치 않은 조직 손상을 유발할 가능성이 높습니다. 염색 준비를 위해 마지막 PBST 세척액을 제거하고, 챔버를 5% Goat serum 함유 PBST로 채워 고정된 필렛을 블로킹한 후, 블로킹 용액을 5% goat serum 함유 PBST에 희석한 1차 항체로 교체합니다.사용된 1차 항체는 mouse anti-α-tubulin과 rat anti-CD8로, 실험 중 시료가 마르는 것을 방지하기 위해 두 항체 모두 1:1000으로 희석하여 사용합니다. 챔버를 젖은 티슈가 들어있는 플라스틱 용기에 넣습니다. 필렛을 항체 용액 내에서 4°C로 최소 16시간 동안 배양합니다.다음 날, 고정액을 제거할 때와 마찬가지로 PBST로 10분씩 6회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다. 1시간 동안 PBST 세척을 마친 후, 5% goat serum이 포함된 PBST에 희석한 2차 항체 용액을 첨가합니다. 본 예시에서는 항체로 LOR 4 88, anti mouse IgG 및 P SI three anti rat IgG를 사용합니다. 이 시점부터 Fluor four의 광퇴색을 방지하기 위해 챔버를 덮어준 다음, 필렛을 2차 항체 용액에서 실온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 둡니다.2차 항체 배양 후, PBST를 사용하여 회당 10분씩 총 6회 세척하는 동일한 엄격한 일정으로 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 이제 필렛을 마운팅할 준비가 되었습니다. 신속한 마운팅을 위해 핀셋을 사용하여 조직을 소량의 80% glycerol 방울에 담급니다. 입 갈고리 근처 앞쪽 끝의 맨 끝부분을 잡고 큐티클 면이 아래로 향하도록 슬라이드로 옮깁니다. 조직 투명화를 개선하고 시료를 영구적이고 안정적으로 보존하기 위해 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다.이전에 설명한 Mountain DPX 처리 후 형광 염색을 통해, 1령 유충의 class four DA 뉴런 수지상 돌기 분지 내에서 각 가지마다 서로 다른 세포골격 구조를 가지고 있음이 밝혀졌습니다. 주 가지들은 tubulin 양성 반응을 보입니다. 반면 일부 가느다란 측분지들은 그렇지 않습니다. 유사한 염색을 거친 class one DA 뉴런의 연속 절편을 영상으로 제작하여 관찰하면 더욱 명확히 드러나지만, 주변 조직의 tubulin 면역 염색으로 인해 뉴런 내 미세소관 구조 분석이 어려울 수 있습니다. mouse anti-fat tubulin 대신 neuron specific mouse anti-ch를 1:1000으로 희석하여 사용할 수 있습니다.4급 뉴런의 주요 분지들은 fch 양성을 보입니다. 반면, 일부 얇은 측분지들은 fch 음성을 보입니다. 체벽 근육의 연속 절편 집합을 통해 이 조직 내의 미세소관 네트워크를 확인하였습니다.체벽 근육과 기관을 통해 절단한 여러 공초점 단면들의 투영 결과, 이들 조직 내의 복잡한 미세소관 네트워크가 관찰되었습니다. 체벽 내 기관 말단을 가로지르는 연속 단면들의 집합을 확대해 보면, 근육 내 미세소관 조직의 복잡성이 드러납니다. 따라서 이 절차를 유충 말초 감각 뉴런의 유전적 MXs 생성과 같은 다른 방법들과 결합함으로써, 수지상 돌기에서 미세소관 조직을 조절하는 메커니즘은 무엇인가와 같은 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을...

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

이 비디오는 돌연변이 초파리 뇌의 버섯체에서 표현형 결함을 시각화하기 위한 상세한 면역염색 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 버섯 몸체의 적절한 형태학적, 기능적 발달을 촉진하는 축삭 유도에 관여하는 단백질인 Fas2에 대한 항체를 사용하는 것입니다.

Immunostaining을 통한 초파리 뇌의 버섯체 뉴런 시각화

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의...

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

학습하세요 Drosophila 유충의 감각 신경 세포 수상돌기에서 미세소관을 면역형광으로 라벨링하는 방법을. 이 기법은 신경 발달 연구에 필수적인 미세소관 조직화를 시각화합니다.

Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽

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