Name: 예 생체내 절연 골격 Microvessel 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 저항성 세동맥의 외과적 절연 및 이중 관류 기법을 통해 혈관 반응성을 평가하는 방법을. 이 실험은 심혈관 질환 연구에 필수적인 혈관 기능 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 (EIA 0740129N)와 NIH T32 HL90610에 의해 지원되었다.

<ol><li>Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Chronic+Anticholesterol+Therapy+on+Development+of+Microvascular+Rarefaction+in+the+Metabolic+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome.</a> Microcirculation. , 1-18 (2009).</li>
<li>Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascular+thromboxane+generation+impairs+dilation+of+skeletal+muscle+arterioles+of+obese+Zucker+rats+with+reduced+oxygen+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-dependent+changes+in+endothelial+factors+regulating+arteriolar+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+emerges+as+a+regulator+of+tone+in+skeletal+muscle+arterioles+during+juvenile+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth.</a> Microcirculation. 15, 151-161 (2008).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+myogenic+responsiveness+of+skeletal+muscle+arterioles+with+juvenile+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).</li>
<li>Dacey, R. G., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+rat+intracerebral+arterioles%3A+methods%2C+morphology%2C+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).</li>
<li>Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+extraparenchymal+resistance+arteries+of+rat+skeletal+muscle+to+reduce+PO2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2.</a> Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).</li>
<li>Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-%281-7%29+and+low-dose+angiotensin+II+infusion+reverse+salt-induced+endothelial+dysfunction+via+different+mechanisms+in+rat+middle+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).</li>
<li>LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+inhalation+impairs+endothelium-dependent+vasodilation+in+subepicardial+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+A%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles.</a> J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).</li>
<li>Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+salt+enhances+benzamil-sensitive+component+of+myogenic+constriction+in+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).</li>
<li>Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mechanisms+of+endothelium-dependent+dilation+in+skeletal+muscle+arterioles+with+genetic+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).</li>
<li>Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d'Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+arachidonic+acid-induced+thromboxane+generation+impairs+skeletal+muscle+arteriolar+dilation+with+genetic+dyslipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia.</a> Microcirculation. 15, 621-631 (2008).</li>
<li>Baumbach, G. L., Hadju, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+composition+of+cerebral+arterioles+in+renal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats.</a> Hypertension. 21, 816-826 (1993).</li>
<li>Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+studying+isolated+resistance+vessel+from+rabbit+mesentery+and+brain+and+their+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs.</a> Circ. Res. 4, 525-536 (1967).</li>
<li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. solated Chapter 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+MJ+%22Isolated%2C+perfused+microvessels.+In%3A+Clinically+Applied+Microcirculation+Research%22">Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research</a>. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. 32, CRC Press, Inc. 435-456 (1995).</li>
<li>Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+rat+middle+cerebral+arterieal+to+reduced+PO2+and+prostacyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin.</a> Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이러한 일반적인 기술은 쉽게 대부분의 조직에 적용할 수 있지만 제시 프로토콜, 골격 근육 microvessel의 분리, 제거 및 이중 cannulation을 설명합니다. 현재 원고 내용은 용어 &quot;arteriole&quot;도 주요 장기에 재관류 저항의 규정에 기여 아니면 휴식 활성 톤 미만의 직경 70-120 μm의 사이에 이르기까지 저항 혈관을 설명하기 위해 저자가 사용되었습니다 조직. 일부 수정이 시스템은 특정 탐정 여러 응용 프로그램에 장착할 수 있으며, 쉽게 (예 : 멤브레인 가능성 17 결정에 대한 transmembrane 전극의 사용) 깊이있는 실험에 더 많은를 제공하기 위해 추가적인 기술의 결합을 허용합니다. 기본적인 준비에 중요한 단계는 항상 선박 cannulate하는 데 사용되는 유입과 유출 pipettes이 잘 일치하는 할려고 명확 유지하고, 허용되는흐름과 압력이 쉽게 이해되는 방식으로 유지되어야합니다. pipettes 조각이 분...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비 </td><td> 회사 </td><td> 덧글 / 카탈로그 # </td></tr><tr><td> 선박 상공 회의소 </td><td> 사용자 정의 </td><td> 데이브 Eick (MCW) </td></tr><tr><td> 온수 순환 물 목욕 </td><td> PolyScience 및 Haake </td><td> Haake DC 10 </td></tr><tr><td> Pipets </td><td> 프레데릭 Haer &amp; (주) </td><td> 모세관 튜브 2.0 mm OD X 1.0 mm ID (27-33-1) </td></tr><tr><td> 압력 모니터 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td></td></tr><tr><td> 물의 외피 저수지 </td><td> 사용자 정의 </td><td></td></tr><tr><td> 외부 광원 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> Novaflex </td></tr><tr><td> Pipet의 풀러 </td><td> MicroData 인 스트 루먼트 </td><td> PMP102 Micropipet 풀러 </td></tr><tr><td> 전체 결점수술 도구, 표준 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 뒤몽 </td></tr><tr><td> 울트라 파인 집게 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> Inox # 5 </td></tr><tr><td> 실크 봉합사 스레드 </td><td> Ethilon </td><td> # 10-0 또는 9-0 </td></tr><tr><td> 스테레오 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 올림푸스 SZ-11 </td></tr><tr><td> 아날로그 비디오 캘리퍼스 </td><td> Boeckeler </td><td> 비아 컨트롤러 (비아-100) </td></tr><tr><td> 고해상도 아날로그 카메라 </td><td> 파나소닉 </td><td> GP-MF 602 </td></tr><tr><td> 산소 탱크 </td><td> 지역 </td><td> 21 % 밸런스 질소와 5 %는이 밸런스 질소를 공동 </td></tr><tr><td> 관류 </td><td> Tygon </td><td></td></tr><tr><td> 펌프 배수 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td></td></tr><tr><td> 수정된 생쥐 PSS </td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> 반 Breemen의 이완 PSS </td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 수치로 표시 절연 microvessel 스테이션 설정의 주요 구성 요소의 목록입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 수정된 생쥐 PSS 제조법 </td><td> PSS 2 리터를 만들려면 </td><td> 20X 소금 증권 (2L) </td><td> 20X 버퍼 증권 (2L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 278.0 g </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 14.0 g </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td></td><td> 11.5 g </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2-H 2 O </td><td></td><td> 9.4 g </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; NaHCO 3 </td><td></td><td></td><td> 80.8 g </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td></td><td></td><td> 0.4 g </td></tr><tr><td> 아뇨 2 PO 4 </td><td> 0.28 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 1.98 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x 소금 증권 </td><td> 100 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x 버퍼 증권 </td><td> 100 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> 1800 ML </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 격리된 microvessel 프로토콜에서 사용되는 표준 생리 식염수 (PSS)를위한 레시피. 레시피에 대한 의견 : 소금 주식 2 패와 버퍼 증권 2 패하십시오. 이 C사용하지 않는 경우 냉장 있겠지만 잘 종종 PSS를 준비하기 전에 그들을 흔들어. 추가 재료는 최종 PSS의 준비 시점에 추가됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 반 Breemen의 이완 PSS </td><td> PSS 2 리터를 만들려면 </td><td> 20X 소금 증권 (1L) </td><td> 20X 버퍼 증권 (1L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 107.4 g </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 7.0 g </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td></td><td> 5.76 g </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td></td><td> 81.32 g </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td></td><td></td><td> 40.4 g </td></tr><tr><td> 동부 서머 타임</td><td></td><td></td><td> 0.2 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 15.22 </td></tr><tr><td> 아뇨 2 PO 4 </td><td> 0.28 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 1.98 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x 소금 증권 </td><td> 100 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x 버퍼 증권 </td><td> 100 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> 1800 ML </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 제로 활성 톤의 조건 하에서 절연 microvessel 프로토콜에 사용되는 반 Breemen의 이완 생리 식염수 (PSS)를위한 레시피. 레시피에 대한 의견 : 소금 증권 1 패 만들기버퍼 증권의 ND 1 패. 이들은 사용하지 않는 경우 냉장 있겠지만 잘 종종 PSS를 준비하기 전에 그들을 흔들 수있다. 추가 재료는 최종 이완 PSS의 준비 시점에 추가됩니다.

예 생체내</em혈관 반응성 조사를위한> 절연 골격 microvessel 준비

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

절연 microvessel 준비는, 따라서 관류 저항 1-5 여러 요인 공헌 제어하는 혈관 직경의 전형을 허용 전직 생체내 준비이며. 이것은 처음. 15 몇 년 전 우치다 외 의해 설명, 대형 측정에서였다 고전 실험 준비입니다. 이것은 초기 설명은 광범위 주로 버지니아 6-8의 대학에서 박사 브라이언 Duling의 실험실에서 수정되고 향상되었습니다 기법에 대한 기초를 제공하고, 우리는 다음 페이지에서 현재의 접근 방식을 제시. 이러한 준비는 특히 선택의 microvessel 같은 시궁창에서 gracilis의 arteriole을 참조되지만, 기본적인 준비가 쉽게 종의 9-13 전역의 거의 모든 다른 조직이나 기관으로부터 격리 선박에 적용할 수 있습니다. 고립된 microvessels의 기계식 (즉, 차원) 변경 사항을 쉽게 평가할 수생리학 (예 : hypoxia, intravascular 압력, 또는 전단) 또는 pharmacological 도전, 그리고 손상에 통합 반응 구성된 기계론의 요소로 통찰력을 제공할 수 있지만 예전의 생체내, 조직의 광범위한 배열에 대응 인치 이 방법의 중요성 또한 intravascular 압력 (myogenic), 자율 innervation, hemodynamic 포함한 기타 출처로부터 기부금의 많은 컨트롤을 허용하는 동시에 그것이, microvessel 직경의 통합 규제에 영향 손쉬운 조작을 허용하는 것입니다 ( 예를 들어, 전단 응력), 내피 의존하거나 독립적인 자극, 호르몬, 그리고 parenchymal 영향, 부분적인 목록을 제공합니다. 적절한 실험 조건에서하고 적절한 목표, 이것은 생체내 또는 쉽게 광범위한 체계적인 변수의 손쉬운 제어를 허용하지 않는 현장 조직 / 기관의 준비에서 이상의 장점이 될 수 있습니다. mA이 준비의 조 제한은 본질적으로 그 강점의 결과입니다. 정의함으로써, 이들 선박의 동작이 혈관 저항의 규정에 가장 중요한 참여자의 많은과 같은 신경 체액, 신진 대사 등을 포함하여 제거된 조건에서 연구되고 수사관들은 피하기 위해 오버 경고합니다 통역이 준비를 활용 수집되는 데이터의 추정. 이러한 준비에 관해서는 관심의 또 다른 중요한 영역이 같은 내피 안감이나 혈관 평활근 세포와 같은 구성 요소를 손상하는 것은 매우 쉬울 수있다는 것입니다, 오류 등 그 변수 소스를 소개하실 수 있습니다. 그것은 강력하게 개인 조사는 실험 시작시와 정기적으로 프로토콜의 과정에 걸쳐 모두, 준비의 품질을 보장​​하기위한 적절한 측정을 활용하는 것이 좋습니다.

<em&gt; 예 생체내</em&gt; 준비는 혈관 vasoactive 자극에 반응하며 수동 벽 기계를 통해 기본적인 구조적 특성의 평가 모두의 심문에 대한 가장 큰 gracilis 근육 저항 arterioles의 분리에 대해 설명되어 있습니다.

예 생체내</em혈관 반응성 조사를위한> 절연 골격 Microvessel 준비

분리된 미세혈관 표본은 혈관을 조절하는 다양한 인자들의 기여도를 조사할 수 있는 엑스 비보(ex vivo) 표본입니다...

이 절차의 전반적인 목적은 개별 저항 동맥을 외과적으로 분리, 제거하고 이중 캐뉼라 삽입을 수행하는 것입니다. ex vivo 환경에서의 연구를 위해, 먼저 마취된 동물에서 미세 혈관을 식별하고 외과적으로 분리합니다. 미세 혈관을 혈관 챔버로 옮긴 후, 미세 혈관의 근위단과 원위단 모두에 캐뉼라를 삽입합니다.마지막으로, 혈관 자체에 내재된 기능 또는 기능 장애의 기저 메커니즘을 평가하기 위해 미세 혈관을 약리학적 또는 생리학적 챌린지와 실험적 중재에 노출시킵니다. 궁극적으로, 적절하게 표적화된 자극과 중재를 통해 격리된 환경에서 혈관 반응성의 패턴과 기여 메커니즘을 결과로 보여줍니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 현미경 하에서 수행되는 우수한 수술 기술뿐만 아니라, 흔히 100 µm보다 훨씬 작은 직경의 격리된 미세 혈관을 이중 캐뉼라화하는 데 필요한 인내심과 정밀한 운동 제어 능력이 모두 요구되는 준비 과정이기 때문입니다.혈관에 가해지는 손상을 절대적으로 최소화해야 하며, 그렇지 않으면 전체 과정의 결과로 반응하지 않는 혈관만 얻게 되어 실험 절차의 유효성을 입증할 수 없게 됩니다. 본 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생인 Joshua Butcher가 수행합니다. 분리된 미세혈관 실험을 수행하기 전, 준비 단계입니다. 먼저 부탄 불꽃 위에서 가열하여 이전에 준비한 유리 마이크로 피펫을 적절한 구성으로 구부립니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 팁을 적절한 직경으로 부러뜨려 조절합니다.두 개의 마이크로 피펫을 마이크로 혈관 챔버의 피펫 홀더에 서로 마주 보게 배치하며, 피펫 팁들이 혈관 챔버 내에서 동일한 수직 및 수평 평면에 오도록 조정합니다. 다음으로, 생리적 식염수(physiological salt solution, PSS)를 준비하고 pH가 특정 실험 조건에 적합한 수준으로 설정되었는지 확인합니다. 헤모사이토미터(hemocytometer) 또는 현미경 스테이지 마이크로미터를 사용하여 혈관 직경 측정에 사용할 디지털 비디오 캘리퍼를 교정합니다.8-0 또는 그보다 작은 안과용 봉합사를 사용하여 미세 혈관을 피펫에 부착하기 위한 단일 팁 루프를 준비합니다. 실험 당일, 루프를 현미경 슬라이드에 감은 작은 테이프 조각 위에 올려 페트리 접시에 보관하십시오. 혈관 챔버와 PERFUSE 8 및 SUSE 8 저장조의 평형 가스를 켭니다.모든 저장조, 튜브 및 챔버를 PSS 용액으로 채웁니다. 필요한 경우, 시린지를 사용하여 PSS를 피펫 끝까지 조심스럽게 밀어 넣어 막힌 곳이 없는지 확인하고 완전히 채워지도록 합니다. 압력 트랜스듀서의 손상을 방지하기 위해 유입 압력을 적절한 범위 내로 유지하십시오.동물을 마취하고 미세혈관을 노출시킨 후, 미세 핀셋으로 혈관 외측을 잡고 혈관 길이를 따라 절개하여 미세혈관을 적출합니다. 이때 혈관을 잡아당기거나 끌지 않도록 각별히 주의하십시오. 다음으로, 혈관을 물이 채워진 수조에 넣고 미세 핀셋 한 쌍을 사용하여 적절한 관류 속도로 근위부 혈관 내강 벽의 양측을 잡은 뒤, 유입 피펫에 근위단 끝을 삽입하여 캐뉼라를 장착합니다.그 다음 혈관을 캐뉼라 팁에 끼우고, T 루프가 혈관을 고정할 수 있는 지점까지 팁 위로 혈관을 밀어 넣습니다. 혈관의 원위단에 T 루프를 배치하고 유출 피펫에 캐뉼라를 삽입한 뒤, T 루프로 고정합니다. 혈관의 왜곡이 최소화되고 혈관의 길이가 생체 내 길이와 유사해질 때까지 캐뉼라를 조정합니다.적절한 혼합 가스를 공급하는 작은 버블링 스톤을 배스(bath)에 넣습니다. 현미경 렌즈에 액체가 튀는 것을 방지하기 위해 챔버 위에 플라스틱 랩이나 유리 덮개를 덮습니다. 주기적으로 유출 튜브를 클램프로 잠가 용기 내부에 압력이 형성되는지 확인합니다.혈관 내 압력을 높이고 유출 라인에 이어 유입 라인을 클램핑하여 혈관의 누출 여부를 확인합니다. 관강 내 압력이 일정하게 유지되면 식별 가능한 누출이 없는 것입니다. 혈관에 누출이 발생하는 작은 측가지가 있는 경우, 10-0 ophthalmic suture를 한 바퀴 감아 묶어줍니다. 미세혈관 캐뉼라 삽입, 평형화 및 검증을 마친 후, 초기 대조군 반응을 결정하기 위한 실험을 시작합니다.예를 들어, 근원성 활성화 또는 압력 유도 수축과 같은 생리학적 자극의 경우, 원하는 범위 내에서 혈관 내압을 무작위로 변경하고 혈관이 이에 반응할 시간을 줍니다. 그다음 다양한 농도의 phenylephrine을 무작위 순서로 투여하여 자극에 대한 반응을 확인합니다. 적절한 중재 시간이 지난 후, 추가적인 중재를 수행하거나 초기 용액을 세척하거나 생리학적 자극을 제거하여 혈관이 평형 상태로 돌아왔음을 확인한 뒤 두 번째 데이터 수집을 시작합니다. 혈관의 능동적 긴장도가 소실되면 실험을 종료하거나, 필요에 따라 혈관벽의 역학에 대한 데이터를 수집합니다.실험이 완료되면 모든 라인과 챔버를 PSS와 충분한 양의 증류수 또는 탈이온수로 세척한 후 완전히 건조시킵니다. 여기에는 유입 및 유출 피펫과 루프가 포함된 캐뉼라 삽입 미세혈관이 고배율로 나타나 있습니다. 디지털 캘리퍼스로 측정한 결과 12 µm인 내경을 여기에서 확인할 수 있습니다.평형 도달 후 캐뉼레이션된 미세 혈관이 나타나 있습니다. 여기서는 아세틸콜린 자극에 반응하여 확장된 동일한 혈관을 보여줍니다. 마지막으로, 페닐레프린 자극 후 수축된 혈관의 모습입니다.이 그래프들은 대조군 조건에서 저산소증, 아세틸콜린 농도 증가 또는 혈관 내 압력 변화에 대한 단리된 미세혈관의 반응을 요약한 것입니다. 그 다음으로는 칼슘이 없는 PSS가 존재하는 상황에서의 반응을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 적절한 온도, 가스 및 SUSE eight 또는 perfuse eight 조건을 유지하면 챔버 내에서 혈관의 생존력을 수 시간 동안 쉽게 유지할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

소장은 자주 혈액 흐름에 부정적인 영향을주고 영양분 흡수에 영향을 미칠 수있는 독소에 노출된다. , 화합물 또는 관심의 독소를 multimyograph 및 장간막 동맥을 사용하고 정맥 분리하는 vasoactivity에 대한 검사를 할 수 있습니다.

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

배우세요 저항성 세동맥의 외과적 절연 및 이중 관류 기법을 통해 혈관 반응성을 평가하는 방법을. 이 실험은 심혈관 질환 연구에 필수적인 혈관 기능 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

예 생체내 절연 골격 Microvessel 준비

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