세분화 및 Murine 비만 모델에서 지방 볼륨 측정 X 선 계산된 Tomography를 사용하여

이 절차의 전반적인 목적은 살아있는 마우스의 지방 함량을 비침습적으로 영상화하여 정량화하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 X-ray CT 스캔을 수행함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 방사선 밀도를 기반으로 마우스 내의 지방 부피를 분할하고 정량화하는 것입니다.

세 번째 단계는 CT 데이터를 3차원으로 시각화하여 지방 부피를 빨간색으로 강조하는 것입니다. 최종적으로, 이 결과는 albia X-ray ct와 PMOD 및 vol view 소프트웨어 패키지를 결합하여 종단적 in vivo 연구 동안 지방 함량을 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다. X vivo 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점 중 하나는 소동물 질환 모델에서 지방을 비침습적이고 종단적으로 평가할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 분할 및 시각화 프로토콜에 연속적으로 수행해야 하는 여러 단계가 포함되어 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 영상 획득 시 최적의 X선 파라미터를 사용해야 합니다. 지방 조직에서 최상의 대조도를 얻으려면, 먼저 유도 챔버를 사용하여 대상 비만 마우스를 마취한 다음 노즈 콘(nose cone)으로 옮기십시오.

영상 촬영 동안 마취 상태를 유지하며, 쥐의 사지를 몸통 옆으로 펼친 상태로 표준 쥐 베드에 배치하십시오. 이는 균일한 CT 획득을 가능하게 합니다. CT 시스템을 설정하여 600회의 투영(projection)을 사용하여 115 millimeters 길이의 베드를 스캔하십시오.

X-선원을 200 microamps 및 45 kilovolt peak로 설정하고 0.5 millimeter 알루미늄 필터를 사용하여 빔을 경화시킵니다. 이 설정에서 마우스가 받게 될 등가 심부 선량은 약 220 milli seavers이며, 컴퓨터상에서 확인되는 표층 등가 선량은 357.4 milli seavert입니다. 영상 재구성에는 표준 파라미터를 적용한 FBP 알고리즘을 선택하십시오.

최종적으로, 최종 영상은 125 micron 등방성 폭스홀(foxholes)로 구성되며, 전신 동물 영상 분석에 사용할 수 있습니다. 영상 분석은 PMOD 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하며, 먼저 PMOD가 조직 밀도에 따라 영상을 분할한 다음 지방 부피를 측정합니다. 영상을 불러온 후, 계산 부하를 최소화하기 위해 영상 크기를 줄이십시오.

메인 뷰 탭으로 이동하여 도구(tools)를 선택한 다음 리듀스(reduce)를 선택하십시오. 리덕션 값을 X에 2, Y에 2, Z에 2로 설정하고, 체크(check) 및 교체(replace)를 선택한 후 프로세스를 실행하십시오. 프로세스가 완료되면 메시지 상자가 나타납니다.

이미지에서 베드와 노즈 콘 요소를 제거하려면, VOI 분석 전에 이를 마스킹하십시오. 평면 레이아웃, 회전, 미러 3D 마커로 이동하여 평면 및 레이아웃을 선택하십시오. Z 평면 표시를 선택한 다음, Z 평면에서 노즈 콘 부분으로 스크롤하십시오.

다음으로, 메인 VOI 탭을 선택하고 정점 그리기(draw vertices)를 선택합니다. 침대와 코콘(nose cone)을 제외하고 코 주변으로 ROI를 그린 후, 실제 ROI를 서로에게 복사(copy actual ROI to each other)를 선택합니다. 코콘 요소로 슬라이스합니다.

필요에 따라 버퍼의 ROI를 코 부분에 붙여넣습니다. 정점 그룹 편집 명령을 사용하여 ROI를 조정합니다. 코 원뿔이 더 이상 보이지 않을 때, ROI를 삭제하고 동물의 몸통 둘레를 포함하는 VOI를 생성합니다.

VOI 도구로 이동한 후, 마스킹 및 대수(algebra)를 선택하십시오. 제공된 대화 상자에 -1000을 입력하십시오. 그런 다음 '선택한 VOI 외부의 복셀 마스킹(Mask voxels outside the selected vois)'이라고 적힌 버튼을 선택하십시오.

irreversible data operation do you want to continue(되돌릴 수 없는 데이터 작업입니다. 계속하시겠습니까?) 메시지가 표시되면 'yes'를 선택하십시오. 이제 planes layouts, rotations, mirror 3D markers 순으로 이동한 후, 마지막으로 planes and layouts로 이동하십시오. show all planes를 선택하십시오.

VOI의 무결성을 확인합니다. VOI가 적절하게 설정되었다면, 이를 분석 파일로 저장하고 파일 이름 접두사를 변경합니다. 이어서 전체 동물 부피를 측정하기 위해 이미지 분할(segmenting)을 진행합니다.

먼저 도구 및 외부 항목을 선택하십시오. 그 다음 세그멘테이션 확인란을 선택하십시오. -300에서 +3,500까지의 범위를 입력하고 세그멘테이션을 실행하십시오.

그다음 전체 부피를 나타내는 통계인 VOI 통계를 선택합니다. 이 부피 값을 기록해 두십시오. 이제 세분화되지 않은 질량 이미지로 돌아가서 지방 부피를 위해 이미지를 세분화합니다.

둘째로, 저장된 질량 데이터 파일을 불러오고 불러오기 창에서 분석(analyze) 상자를 체크하십시오. 다음으로, 도구(tools)와 외부(external)를 선택하십시오. 그런 다음 세그멘테이션(segmentation) 체크박스를 선택하십시오.

-200에서 -50 사이의 범위를 입력하고 세그멘테이션을 실행하십시오. 결과가 승인되면 VOI.Statistics를 선택하십시오. 이때 보고된 통계 수치는 지방 부피를 나타냅니다.

분석된 형식으로 결과를 저장하고 고유한 파일 이름 접두사를 지정하십시오. 다만, 피부나 말초 밀도가 남아 있는 경우에는 침식 및 팽창 프로토콜을 사용하여 VOI 분석을 위해 해당 영역을 제거하십시오. 저장하기 전, tools external로 이동하여 새 상자의 morphological 체크박스를 선택하십시오.

침식(erosion)을 선택하십시오. 그 다음, 형태학(morphological) 체크박스로 돌아가 팽창(dilation)을 선택하고, 피부 또는 주변부 밀도 문제가 해결되었는지 확인한 후 결과를 저장하십시오. 세분화된 이미지의 렌더링된 3D 시각적 디스플레이를 생성하기 위해 Volvo view 버전 3.2 소프트웨어 패키지를 사용하십시오.

분석 형식으로 저장된 CT 데이터셋을 여는 것으로 시작합니다. 팝업 창에서 기본 설정을 사용한 다음, 플러그인 메뉴를 열고 유틸리티(utility)에서 볼륨 병합(merge volumes)을 선택합니다. 구성 요소 재조정(rescale components) 항목의 체크를 해제합니다.

'Second input' 할당을 클릭합니다. 두 번째 입력값으로 분할된 지방 데이터를 선택하고 팝업 창의 기본 설정을 사용합니다. 그런 다음 플러그인을 적용하여 대상 마우스의 확대된 모습을 확인합니다.

볼륨 뷰 창을 더블 클릭하십시오. 색상/불투명도 탭으로 돌아갑니다. 구성 요소 드롭다운 상자는 현재 편집 중인 데이터 세트를 나타냅니다.

탭 하단에 두 개의 슬라이더가 있습니다. 이 슬라이더들은 0과 1 사이의 값을 사용하여 오버레이 내 각 구성 데이터 세트의 상대적 밝기를 결정합니다. 예를 들어, 색상을 그레이스케일로 변경하려면 스칼라 색상 매핑(scalor color mapping) 섹션으로 이동하십시오.

슬라이더 중 하나를 더블 클릭하여 상자 밖으로 드래그하십시오. 슬라이더 영역 내 아무 곳이나 클릭하여 두 번째 슬라이더를 추가하십시오. 왼쪽 색상 슬라이더는 검은색으로, 오른쪽 색상 슬라이더는 흰색으로 설정하십시오.

다음으로, 스칼라 불투명도 매핑(scalar opacity mapping) 상자로 이동하여 상자 안을 클릭해 새로운 점을 생성합니다. 이렇게 하면 중간 지점에 총 세 개의 점이 생성됩니다. 스칼라 값을 약 -3000으로 변경하고 불투명도 값을 0으로 변경하십시오.

창의 오른쪽에 있는 세 번째 포인트의 스칼라 값을 약 32,000으로, 불투명도를 0.25로 변경합니다. 첫 번째 포인트는 불투명도 값이 0으로 설정되어 있다면 왼쪽에 어디든 위치해도 무관합니다. 스칼라가 설정되면 지방의 외관을 편집하는 컴포넌트 2로 전환한 다음, 색상 슬라이더를 더블 클릭하고 색조 슬라이더 H를 끝까지 밀어 각각의 색상 슬라이더를 빨간색으로 변경합니다.

이 과정은 지방을 빨간색으로 거짓 색상 처리합니다. CT 지방 및 오버레이를 표시하는 3패널 회전 영상을 만들기 위해, 먼저 마우스로 피험자를 클릭하여 등이 위를 향하도록 똑바로 세웁니다. 두 번째로, 구성 요소 가중치(component weights)에서 구성 요소 2의 값을 0으로 설정하여 CT 스캔만 표시되도록 합니다. 세 번째로, 검토(review)를 클릭한 후 카메라(camera)를 선택하고 회전 영상에 사용할 프레임 수를 선택합니다. 네 번째로, X 회전 값을 360도로 변경합니다.

팝업 대화 상자에서 다섯 번째 항목을 선택하여 생성하십시오. CT라는 이름의 새 폴더를 생성하고 파일을 TIF 형식으로 저장하면 일련의 회전 이미지가 출력됩니다. 지방 이미지와 중첩된 지방 CT 이미지에 대해서도 이 단계를 반복하여, 각각의 회전 이미지를 별도의 폴더에 저장하십시오. 출력된 이미지들로 회전 영상을 생성하려면, Image J를 열고 이미지 시퀀스를 가져오십시오.

CT 폴더에서 첫 번째 이미지를 선택하면 나머지 이미지들이 자동으로 선택됩니다. 지방(fat) 및 오버레이(overlay) 시퀀스에 대해서도 하나의 스택을 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 여전히 열려 있는 상태입니다.

ROI 관리자를 엽니다. 분석 도구(analyze tools) 항목 아래에서 ROI 관리자를 찾을 수 있습니다. 불필요한 배경 픽셀을 제외하고 대상 마우스 주변으로 ROI를 그립니다. 완료되면 ROI 관리자에서 추가(add)를 클릭합니다.

그런 다음 모든 이미지 시퀀스에 동일한 ROI를 적용합니다. 모든 스택에 ROI가 설정되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다. ROI 선택 메뉴에서 duplicate(복제)를 선택합니다. 복제된 스택을 확인하십시오.

이 과정을 통해 ROI를 이미지의 나머지 부분과 분리합니다. 이제 더 큰 이미지 스택들을 닫고, 세 가지 이미지 시퀀스 모두에 대해 이 절차를 반복하십시오. 스택을 결합하려면 Stacks 항목의 Tools 아래에 있는 combine 명령을 사용하십시오.

스택 1에 CT 스택을 선택하고, 스택 2에 지방(fat) 스택을 선택하십시오. 그런 다음 이 과정을 반복합니다. 새롭게 결합된 스택을 스택 1로 선택하고, 오버레이(overlay) 스택을 스택 2로 선택하십시오.

이로써 3개 패널로 구성된 이미지 회전 스택 생성이 완료되었습니다. 이미지 창의 왼쪽 하단에서 재생을 선택하여 스택을 미리 확인하십시오. 그런 다음 이를 AVI 동영상 파일로 저장하십시오.

Alber CT 시스템의 타당성을 입증하기 위해 비만 B6LEOBJ 마우스를 사용하였습니다. CT 기반의 지방 함량 측정을 위해, 이를 C57BL/6 야생형 마우스와 비교하였습니다. 왼쪽은 비만 마우스의 전체 CT 볼륨입니다.

중앙은 빨간색으로 표시된 지방 부피이며, 오른쪽은 오버레이 영상입니다. 야생형 동물을 대상으로 유사한 분석을 수행한 결과, 비만 쥐와 비교하여 지방 함량에서 상당한 차이가 나타났습니다. 각 동물에 대해 전체 부피, 지방 부피 및 부피 비율을 계산하였습니다.

야생형 그룹과 비만 그룹의 지방 대 총 부피 비율의 평균값은 각각 0.09와 0.42였습니다. 이 값들은 P 값이 0.001로 유의미한 차이를 보였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 숙달 과정을 거쳐 살아있는 마우스의 CT 데이터 세트 내에서 지방 부피를 분할하는 방법에 대해 확실히 이해하게 될 것입니다.

이 기술의 수행 시간은 30분 미만입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 다음 시간에 다시 뵙겠습니다.