표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

이 실험 절차의 전반적인 목표는 세포질로 유입되는 독소 풀(pool)을 검출하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해, 먼저 4°C에서 독소를 숙주 세포 표면에 결합시킵니다. 그 다음 결합되지 않은 독소를 제거하고 세포를 37°C로 가온하는데, 이는 독소가 내막계와 그 후 숙주 세포질로 이동할 수 있게 합니다. 세포 투과가 완료된 후, digitonin을 사용하여 세포막을 선택적으로 투과성으로 만듭니다.

세포 추출물은 차등 원심분리를 통해 막 분획과 세포질 분획으로 분리됩니다. 최종 단계로, 항독소 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 세포질 분획을 관류시켜 세포질 내로 유입된 독소를 검출하고 정량화하기 위해 표면 플라스몬 공명(surface plasma resonance, SPR)이 사용됩니다. 이 방법은 세포질로의 독소 유입 효율 및 역학, 세포질로 유입되는 독소의 양, 그리고 세포질 내 독소 이동에 대한 잠재적인 약물 억제 효과와 같이 독소 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, HeLa 세포를 하룻밤 동안 배양한 후 서면 프로토콜에 기술된 대로 세포 독성 처리le를 위한 HeLa 세포를 준비하십시오.

배양액을 Ganglioside GM1 100 ng/mL이 포함된 1 mL DMEM으로 교체하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이렇게 하면 콜레라 독소의 결합 부위 수가 증가합니다. GM1 용액에 노출된 세포의 세포질 막으로 독소의 GM1 수용체가 삽입되기 때문입니다.

1시간 동안 배양한 후, 배지가 포함된 GM one을 제거하고 DMEM으로 세포를 2회 세척합니다. 그다음 1 µg/mL의 콜레라 독소가 포함된 DMEM 1 mL를 첨가하고, 세포를 4 °C에서 30분 동안 둡니다. 독소가 포함된 배지를 제거하고 세포를 2회 세척합니다.

그 후 세포를 1 mL의 DMEM에 넣고 37 °C에서 원하는 시간 동안 배양합니다. 각 체이스(chase) 기간이 끝나면 PBS로 세포를 세척한 다음, 각 웰에 250 µL의 0.5 mM EDTA 및 PBS를 넣고 배양합니다. 얼음 위에서 10분간 배양한 후, P 1000 피펫 맨(pipet man)을 사용하여 강력하게 트리톤(TRI) 처리함으로써 6-웰 플레이트에서 세포를 회수합니다.

세포가 담긴 웰 하나를 수집한 후, 동일한 조건의 두 번째와 세 번째 웰의 세포를 차례로 합칩니다. 다음으로, 세 개의 반복 웰에서 합쳐진 세포 현탁액을 단일 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 이제 테이블탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.

5,000 ×g에서 원심분리하여 모든 조건에서 거의 동일한 크기의 세포 펠렛을 얻어야 합니다. 상층액을 제거한 후, 미리 준비하여 냉각시킨 0.04% digitonin 작업 용액 100 µL에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음에 10분 동안 둡니다. 탁상용 미세원심분리기를 사용하여 digitonin으로 투과화된 세포를 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

상층액 분획이 포함된 세포질을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 소기관이 포함된 펠릿 분획은 보관합니다. SPR 독소 표준물질은 HCN 완충액에서 110, 1 및 0.1 ng/mL 농도로 준비합니다. 상층액 분획이 포함된 세포질을 HCN 완충액으로 희석하여 최종 부피를 1 mL로 만들어 시료를 준비합니다. 주입 전 500 µL 시료 루프에서 공기가 완전히 제거되도록 하려면 최소 1 mL 이상의 시료 부피가 필요합니다. 소기관이 포함된 펠릿 분획은 1% Triton X 100이 포함된 1 mL의 HCN 완충액에 재현탁합니다.

막으로 둘러싸인 독소 풀을 방출시키기 위해서는 계면활성제의 첨가가 필요합니다. 또한, 분획 절차의 정확성을 확인하기 위한 대조군 실험을 위해 세포질 분획과 organ L 분획의 병렬 세트를 준비하십시오. 세포질 분획은 20 µL의 4x 샘플 버퍼에, organ L 분획은 120 µL의 1x 샘플 버퍼에 재현탁하십시오. 각 분획의 동일한 부피를 sodium ESAL sulfate 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리한 후, Western blood 분석으로 프로빙하여 세포질 단백질이 상층액 분획으로, 가용성 resident ER 단백질이 펠릿 분획으로 분할되었음을 입증하십시오. SPR 슬라이드를 준비하려면 먼저 자기 조립 단분자막이 형성된 금 도금 유리 슬라이드를 SPR 장비에 장착하십시오.

41 µL/min의 유속으로 E-D-C-N-H-S 용액을 10분 동안 흘려주어 센서 슬라이드를 활성화합니다. 이후의 모든 퍼퓨전(perfusion)에는 동일한 유속을 사용합니다. 0.05% Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5분 동안 세척하여 E-D-C-N-H-S 활성 버퍼를 제거합니다.

E-D-C-N-H-S 용액으로 캡핑을 제거함으로써 플레이트에 반응성 MI 테더가 형성되었습니다. 다음으로, 20 mM sodium acetate에서 1:20,000으로 희석한 anti CTA 항체를 활성화된 센서 슬라이드 위로 15분 동안 주입합니다. pH 변화로 인해 굴절률 단위(refractive index unit, RIU로 약칭)의 초기 감소가 관찰될 것입니다.

이어서 항체가 아미드 반응성 테더(amide reactive tethers)에 의해 포획됨에 따라 RIU가 증가하게 됩니다. 센서 슬라이드에서 5분간 PBST 세척을 통해 결합되지 않은 항체를 제거하십시오. 포획된 항체에 의해 생성된 RIU 신호는 정체기에 도달하여 안정화되며, 이를 통해 새로운 기선(baseline) 신호가 제공됩니다.

슬라이드 준비의 마지막 단계로, 1 M ethanolamine을 센서 슬라이드 위에 5분 동안 관류합니다. 이는 센서 슬라이드에 남아 있는 결합되지 않은 테더(tether)를 캡핑하여 비활성화합니다. RIU 신호를 증가시켜 기준선을 설정하기 위해, 항체가 코팅된 센서 위에 PBST를 5분 동안 관류합니다.

그런 다음 실험 샘플 또는 독소 표준물을 센서 위로 300초 동안 흘려줍니다. 버퍼에서 리간드를 제거하고 PBST를 센서 위로 200초 동안 더 흘려줍니다. 센서에 결합된 상태로 남아 있는 독소는 pH 5.0의 PBST로 102번째 세척을 하여 제거합니다.

이렇게 하면 신호가 초기 기선(baseline) 값으로 돌아가므로, 동일한 센서에서 다른 샘플을 처리할 수 있습니다. 새 샘플을 로드하기 전에 샘플 루프에 소량의 공기를 주입하여 이전 샘플의 잔류 액체를 모두 배출하십시오. 획득 후.

데이터는 scrubber two 소프트웨어로 분석할 수 있으며, figure 작성을 위해 Igor 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 백일해 독소(Pertussis toxin)는 AB 독소로서, a 체인이 세포질로 들어가기 전 세포 표면에서 소포체(ER)로 이동합니다.

SPR 기반 전위 분석법을 통해 독성 물질이 처리된 CHO 세포의 세포질 내 PTs를 검출할 수 있었습니다. 독성 물질이 처리되지 않은 세포의 세포질에서는 신호가 생성되지 않았으며, 이는 anti PTs의 선택성을 확인시켜 주었습니다. 한 항체는 숙주 세포질의 구성 성분과 교차 반응을 일으키지 않았습니다.

felden이 존재하는 상태에서 독소에 노출된 세포의 세포질 분획입니다. A 또한 양성 신호를 생성하지 못했으며, BFA는 소포체(ER) 전위 부위로의 독소 수송을 차단하여 H 체인의 세포질 전달을 방해합니다. Chole toin은 또 다른 AB 유형의 소포체 전위 독소입니다.

CT 처리된 helo 세포의 세포질 분획에서 CTA1이 검출되었습니다. 이는 본 방법론이 다양한 세포 유형에 적용 가능하며, 항-체인 항체가 존재하는 모든 독소에 응용될 수 있음을 강조합니다. CT 처리된 세포의 세포질 분획을 항-CTB 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 흘려보냈을 때 신호가 검출되지 않았으며, 이는 세포 결합 CTB PENTAMER가 CTA1 서브유닛과 달리 세포질로 유입되지 않음을 입증합니다.

anti CTA 항체가 코팅된 SPR 센서 상에서 확산시킨 후의 결과입니다. 세포소기관 분획의 신호는 세포질 분획의 더 약한 신호와 비교하여 측정 범위를 벗어날 정도로 강합니다. 이는 CT가 ER 전위 부위로 운반되는 효율이 낮아 결과적으로 세포질에 도달할 수 있는 독소의 양이 제한된다는 알려진 사실과 일치합니다.

이동된 세포질 내 독소의 시간 의존적 축적 또한 모니터링할 수 있습니다. 4°C에서 세포를 CT에 노출시킨 후, 37°C로 가온하고 15분이 지난 시점에서는 세포질에서 독소가 검출되지 않았습니다.

37 °C에서 30분 후 소량의 세포질 독소가 검출되었으며, 45분 및 60분의 체이스(chase) 간격 후에는 점진적으로 더 많은 양의 세포질 독소가 검출되었습니다. 이는 세포와 결합된 독소가 숙주 세포질로 지속적으로 장기간 전달됨을 보여줍니다. 이 분석법은 세포질로의 독소 전위 억제 또한 검출할 수 있습니다. 10% DMSO로 처리된 세포는 독소의 언폴딩(unfolding)이 일어나지 않은 처리되지 않은 독소 노출 대조군 세포와 비교하여 낮은 수준의 세포질 CT1을 나타냈습니다.

사슬은 세포질로의 전위를 위한 전제 조건이므로, DMSO에 의한 CT A1의 안정화는 그에 따라 ER에서 세포질로의 이동을 방지했습니다. DMSO로 유도된 독소 전위 차단을 정량화하기 위해, 기지 농도의 독소로 생성한 표준 곡선을 사용하여 세포질 내 CTA1 농도를 계산한 결과, 처리하지 않은 세포는 0.3 ng/mL, DMSO 처리 세포는 0.1 ng/mL로 나타났습니다. 따라서 DMSO에 의한 CT A1 언폴딩 억제는 CTA1의 ER에서 세포질로의 전위를 3배 감소시켰습니다.

이 절차를 통해, 세포질에 존재하는 독소의 양과 독소 활성 사이의 직접적인 연관성을 규명하기 위해 독성 분석법과 같은 다른 기술들을 활용할 수 있게 됩니다.