Name: 표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 호스트 세포질로 독소가 이동하는 과정을 정량적으로 감지하고 분석하는 방법을. 이 기술은 독소 생물학 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 K. Teter에 NIH R01 부여 AI073783에 의해 투자되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기위한 subcellular 분별화 프로토콜과 헬렌 Burress의 개발에 도움 박사 쉐인 메시 감사합니다.

1. digitonin의 준비 <ol><li> microcentrifuge 튜브에 100 % 에탄올 500 μL를 추가하고 80 ° C 10 분에 대해 설정된 열 블록에 넣습니다. </li><li> digitonin의 1 % 주식 솔루션을 생산하는 온수 에탄올 250 μL에 dig​​itonin 2.5 MG를 해산. </li><li> 0.04 %의 digitonin의 작업 솔루션을 생성하려면, HCN 버퍼 960 μL (50 MM의 Hepes 산도 7.5, 150 MM NaCl, 2 MM CaCl 2, 10 MM N - ethylmaleimide, 그리고 테아제 억제제에 digitonin 주식 솔루션 40 μL를 추가 칵테일). </li></ol> 2. 휴대폰 중독과 permeabilization 우리 translocation 분석은 독소와 세포 라인의 범위에 적용할 수 있습니다. 아래, 우리는 콜레라 독소 (중부 표준시)의 검출에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 절차의 개요는 그림 1에서 제공됩니다. <ol><li> HELA 세포는 10 % 보충 한 ML DMEM을 포함하는 6 자 접시에 씨앗을 품고 아르 태아 소 혈청과 항생제 - antimycotic1x10 6 세포를 달성하기 위해 / 잘 후에 37 하룻밤 인큐베이션 ° C. 재현성 감지하기에 충분한 cytosolic 독소를 생성하려면, 세중의 위 각 조건이 필요합니다. </li><li> 하룻밤 부화 다음, 1 ML DMEM이 ganglioside GM1의 100 NG / ML을 포함하는으로 배지를 교체하십시오. 중부 표준시의 GM1 수용체가 GM1의 솔루션에 노출된 세포의 플라즈마 막에 사이에 끼어 넣다하므로 이것은, CT에 대한 구속력이있는 사이트의 수를 증가합니다. </li><li> 37 1 시간 보육 후에 ° C, GM1 - 포함된 매체를 제거하고 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻으십시오. 그런 다음, 4 셀 배치 ° C 일 ML DMEM 1 μg / 중부 표준시의 ML을 포함에서 30 분. </li><li> 37, 독소 함유 매체를 제거 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻어, 1 ML DMEM으로 세포를 품어 ° 원하는 시간 간격 (S)에 대한 C. </li><li> 각 추적 기간의 끝에, PBS로 세포를 씻어하고 PBS에 0.​​5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 250 μL와 각각 잘 품어. 세포가 10 앉아서 보자<html> 다음 상온에서 분 및 P1000 pipetman로 활발한 분쇄하여 6 잘 플레이트에서 제거합니다. 세포 중 하나를 잘 수집되고 나면 잘 같은 상태에서 두 번째 그리고 셋째로 결합되어 있습니다. 세포기구 또한 세포를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 단일 microcentrifuge 튜브의 세 가지 복제 우물 (750 μL 총 볼륨)에서 결합된 세포 현탁액을 놓고 5000 X G.에서 5 분 탁상 microcentrifuge에 스핀 대략 동등한 크기의 셀 알약은 모든 조건을 획득해야합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 digitonin의 0.04 % 작업 솔루션을 100 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 10 분 얼음에 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 탁상 microcentrifuge 10 분 16,000 XG에서 digitonin - permeabilized 세포를 돌린다. 새로운 microcentrifuge 튜브에 cytosol 함유 뜨는 분수를 전송하고, organelle 함유 펠렛 분율을 유지합니다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 샘플 준비 <ol><li> Cytosol 함유 뜨는 분수는 1 ML의 최종 볼륨 HCN 버퍼에 희석 수 있습니다. 최소한 1 ML의 샘플 볼륨은 공기가 주입되기 전에 500 μL 시료 루프에서 정화되도록하기 위해 필요합니다. </li><li> Organelle 함유 펠렛의 분수는 1퍼센트 트리톤 X - 100을 포함하는 HCN 버퍼 1 ML에 resuspended 있습니다. 세제의 추가는 독소의 멤브레인 - 쌌다는 수영장을 공개하는 것이 필요합니다. </li><li> 100 농도, 10, 1, 0.1 NG / ML에서 독소 기준은 HCN 버퍼에 준비가되어 있습니다. </li><li> cytosolic 및 organelle 분수의 양대 세트 분획화 절차의 충실도를 확인하기 위해 제어 실험을 준비하고 있습니다. 분수는 4X 샘플 버퍼 (cytosolic 분율) 또는 1X 샘플 버퍼 (organelle 분율) 120 μL의 20 μL에 resuspended 아르 제 2에 설명되어 생성. 각 분획의 상응하는 볼륨은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동에 의해 해결하고 B를 탐색할 아르Y 서양 얼룩 분석 뜨는 분수에서 cytosolic 단백질의 파티션 및 펠렛 분율 16-19에 용해, 주민 ER 단백질을 설명합니다. </li></ol> 4. SPR 슬라이드 준비 <ol><li> Reichert SR7000 SPR 굴절계는 SPR 실험에 사용됩니다. </li><li> SPR의 악기에 자기 조립 monolayer와 금도금 유리 슬라이드를 설정합니다. 41 μL / 분의 유량 10 분 슬라이드를 통해 0.4 M 및 0.1 M EDC의 보건국의 솔루션 : 센서 슬라이드를 활성화하려면, 1:1 (V V)를 perfuse. 이후의 모든 perfusions 같은 유량을 사용합니다. </li><li> EDC 제거하려면 다음 보건국 활성화 버퍼를, PBS는 0.05 %에게 십대 초반 20 (PBST)을 포함하는 5 분 접시를 씻으십시오. 보건국 솔루션 : 접시는 현재 EDC로 uncapping에 의한 반응 아미드 tethers가 포함되어 있습니다. </li><li> 15 분 20 MM의 아세트산 나트륨 (산도 5.5)에서 1:20,000의 희석에 활성화된 센서 슬라이드를 통해 안티 CTA 항체를 Perfuse. 의 굴절률에 초기 드롭덱스 단위 (RIU)은 산도의 변화로 인해 보여줄 것입니다. 항체가 센서 슬라이드에있는 아미드 반응 tethers 점령므로 이것은 RIU 증가가 뒤따라갈 겁니다. </li><li> 5 분 PBST 세척과 센서 슬라이드에서 언바운드 항체를 제거합니다. 캡처한 항체에 의해 만들어진 RIU 신호 고원과 안정화는 새로운 기준 신호를 제공합니다. </li><li> 5 분 센서 슬라이드를 통해 Perfuse 1 M ethanolamine (산도 8.5). 이 모자와 센서 슬라이드에 남아있는 언바운드 tethers을 inactivates. </li></ol> 5. 샘플 SPR 분석 <ol><li> 5 분 항체 - 코팅 센서를 통해 기본적인 읽기, perfuse의 PBST을 설정합니다. </li><li> 300 초에 대한 센서를 통해 실험 샘플이나 독소 표준을 Perfuse. 또 200 초에 대한 센서를 통해 버퍼와 perfuse의 PBST에서 리간드를 제거합니다. </li><li> 각 재관류 후, 행 독소는 산도 5.0에서 PBST로 100 초 세척하여 센서에서 제거됩니다. 이것은 신호를 반환합니다따라서 다른 샘플이 동일한 센서 처리 수 있도록. 초기 기준 읽기에 </li><li> 새로운 샘플을로드하기 전에, 이전 예제에서 잔여 액을 추방하기 위해 샘플 루프를 통해 공기의 작은 금액을 밀어. 5.2-5.4에서 설명한 절차를 사용하여, 우리는 기준 신호의 실질적 손실없이 슬라이드 12 샘플까지 실행합니다. </li><li> 데이터 분석은 스크러버이 소프트웨어와 함께 수행하고, 이고르 소프트웨어는 그림 준비에 사용됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 백일해 독소 (PT)는 체인 (PTS1)는 cytosol 세, 12를 입력하기 전에 응급실로 세포 표면에서 이동 AB 독소입니다. 그림 2에 표시된 우리 SPR 기반 translocation 분석은 음주 CHO 세포의 cytosol에 PTS1를 검색할 수 있습니다. 신호는 안티 - PTS1 항체는 호스트 cytosol의 구성 요소와 교차 반응하지 않았 확인 unintoxicated 세포의 cytosol에서 생성되지 않았습니다.brefeldin (BfA)의 존재에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 또한 긍정적인 신호를 생성하지 못했습니다. BfA는 ER의 translocation 사이트 6-8, 12, 20-25, 그리고 따라서, cytosol에 체인 전송 독소 전송을 방지합니다. 각 실행의 끝에 행 독소는 센서 슬라이드에서 제거됩니다. 이 허용되는 복수의 샘플은 하나의 센서 슬라이드 상영함으로써 다양한 실험 조건에 얻은 결과 사이에 직접적인 비교를 제공합니다. CT도 다른 AB 형, ER - translocating 독소 4. 그림 3A에서 CTA1는 CT - 치료 HELA 세포에서 cytosolic 분수에서 발견되었다. 이것은 우리의 방법론은 여러 세포 유형에서 작동하고 방지 체인 항체를 사용할 수있는 모든 독소에 적용할 수 있습니다 강조했다. CT - 처리된 세포에서 cytosolic 분수가 안티 CTB 항체 (그림 3B)로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused 때 아무 신호 따라서 그런 CTA1에게 보여주는 감지되지 않았습니다subunit는하지만 셀 바인딩 CTB pentamer는 cytosol를 입력하지 않습니다. 그림 3C는 organelle 분획에서 신호가 cytosolic 분수에서 약한 신호에 비해 오프 규모입니다 보여줍니다. 이것은 차례로 cytosol에 도달할 수있는 독소의 양을 제한 ER translocation 사이트 6, 7에 중부 표준시 교통의 알려진 비효율과 일치했다. 또한, organelle 분율은 중부 표준시의 holotoxin뿐만 아니라 ER -화된 CTA1가 있으므로, organelle 분율에 대한 결과 SPR 신호 holotoxin - 관련 CTB pentamer의 추가 질량에 의해 증가됩니다 포함되어 있습니다. 그러므로, 그것은 같은 sensorgram에 organelle과 cytosolic 분수에서 데이터를 계획하기 위해 실용적되지 않습니다. 우리의 분석은 translocated, cytosolic 독소 (그림 4)의 시간 의존 축적을 모니터링할 수 있습니다. 전지는 4 중부 표준시에 노출되었습니다 ° C, 플라즈마 막에 독소가 구속 수 있지만 휴대 관련된 독소의 내면화를 방지 온도를. remo 후언바운드 독소의 발은, 세포는 37 ° C.에 따뜻하게했다 응급실에 독소 운송 및 cytosol에 체인 translocation 모두는이 온도에서 발생할 수 있습니다. 아무도 독소는 온난 후 37 ° C.에 cytosol 15 분만에 감지되지 않았습니다 이것은 응급실에은 (i) holotoxin 거래에 필요한 지연 시간을 반영하며 응급실에서 (2) A / B의 subunit의 분리 및 cytosol에 (3) 체인 내보낼 수 있습니다. cytosolic 독소의 작은 수영장이 C는 37 ° 30 분 후에 발견되었고, cytosolic 독소 점차적으로 큰 수량은 45 60분 체이스 간격 이후에 발견되었다. cytosolic 독소의 더욱 수준 때문에 호스트 cytosol로 휴대 관련된 독소의 지속, 장기적인 납품을 보여주는, 5시간 추격 간격 17 이후에 발견되었다. 우리의 분석은 또한 cytosol에 독소의 translocation의 억제 (그림 5) 검색할 수 있습니다. 세포 10 % 디메틸 sulfoxide (DMSO), 열 disord을 방지하는 화학 보호자로 치료격리 CTA1 subunit (T. Banerjee와 K. Teter, 관찰되지 않은)의 ering, 치료 제어 세포에 비해 cytosolic CTA1의 낮은 수준을 전시. 독소의 전개 체인은 cytosol 16-18로 translocation을위한 필수 조건이다, CTA1의 DMSO 유발 안정화가 따라 응급실에서 cytosol하기 위해 운동을 방해하므로. SPR 실험에서 계산 협회 속도 상수 (K)는 재관류 버퍼 14, 15, 26 리간드의 농도에 직접 비례합니다. 그러므로, 그것은 그래프에서 cytosolic 독소의 농도를 결정하기 위해 가능한 것을 플롯 K 독소 농도의 함수로 독소 표준 값. 이 절차는 그림 5에 제시 독소의 translocation의 DMSO 유도 블록을 계량하는 데 사용되었습니다 독소 알려진 농도에서 생성된 표준 곡선은 cytosolic CTA1 concentrat를 계산하는 데 사용되었다의 이온 0.3 치료 세포와 DMSO - 대우 전지 0.1 NG / ML (그림 6) NG / ML. DMSO에 의해 전개 CTA1의 억제 따라서 CTA1의 ER - 투 - cytosol translocation의 3 배 감소 생성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요. (A) 세포 4 AB 독소와 incubated 아르 ° C, 세포 표면에 독소가 구속 수 있지만 독소의 endocytosis을 방지하는 온도. 독소 A와 B subunits는 각각 빨간색과 파란색 동그라미로 표시됩니다. (B) 언바운드 독소가 미디어에서 제거하고, 세포 ° C 응급실에 holotoxin의 endocytosis와 역행 수송을 촉진하기 위해 37 기까지입니다. Holotoxin 분리는 절연 체인 ER 막에 단백질 실시 채널 (S)를 통해 전달하여 cytosol를 입력할 수 응급실에서 발생합니다. (C) 세포 선택적으로 플라즈마를 permeabilize하기 위해 digitonin로 취급됩니다막. (D) 원심 분리는 별도의 cytosolic 및 organelle 분수로 파티션 세포를하는 데 사용됩니다. cytosol은 digitonin 생성 모공을 통해 세포 밖으로 압착하여 뜨는에 위치하고 있습니다. 그대로, 멤브레인 바인딩된 organelles은 펠렛 분획에서 발견됩니다. (E) 호스트 cytosol에서 독소 체인의 translocated 수영장를 검색하려면, 뜨는 분수는 안티 - 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> 그림 2. 호스트 cytosol에 PTS1 translocation의 감지. CHO 세포되었습니다 펄스 분류 4 ° 1 μg / 태평양 표준시의 ML 30 분 C. 세포는 다음 37 3 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic fracti로 파티션 세포 추출물에 사용된기능. 안티 PTS1 항체로 코팅된 SPR 센서는 치료 또는 BfA - 처리 세포에서 PTS1의 cytosolic 수영장를 검색하는 데 사용되었다. unintoxicated 세포에서 cytosolic 분율이 대조군으로 센서 슬라이드를 통해 perfused 동안 PTS1 기준은, 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> 그림 3. 호스트 cytosol에 CTA1 translocation의 감지. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic 분수로 파티션 세포 추출물로 사용되었습니다. (A) cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. 알려진unintoxicated 세포의 cytosol가 대조군으로 사용하는 동안 CTA의 수량은 긍정적인 컨트롤로 사용되었습니다. (B) BfA의 부재에서 술에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTB 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused되었습니다. 정화 CTB pentamer은 긍정적인 제어로 슬라이드를 통해 perfused되었습니다. (C) organelle 분율이 함께 solubilized했습니다 1% 트리톤 X - 100 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 재관류 전에. 비교 목적을 위해, 동일한 세포 추출물 및 CTA 표준에서 cytosolic 분수 (1 ML 최종 볼륨)도 센서를 통해 perfused했다. 모든 패널, 행 예제는 각 실행의 끝에 센서에서 뺏겼어요. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> 그림 4. cytosol에 CTA1 항목의 속도론. HELA 세포 펄스 표시 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML과 C 15, 30, 45 추격, 또는 37 60 분되었습니다 ° C 독소 무료 mediu 4시M. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 표준뿐만 아니라 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> 그림 5. DMSO에 의해 CTA1 translocation의 억제. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 또는 10% DMSO를 (+ DMSO 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 기준은 (100, 10, 1, 0.1 NG / ML) 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused 있었다, 오직 1과 0.1 NG / ML 표준 확장 목적으로 표시됩니다. unintoxicate에서 cytosolD 세포는 대조군으로 사용되었다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> 그림 6. cytosolic CTA1의 계산. 그림 5에서 CTA 표준 값 K 독소 농도의 함수로 꾸몄다되었습니다. 그 결과 표준 곡선은 K에 따라 결정하는 데 사용되었다 그림 5, 치료 및 DMSO - 처리 세포에서 cytosolic CTA1의 농도에서 실험 샘플의 값. 치료 cytosol은 열린 광장으로 제시되며, 독소 기준은 채워진 동그라미로 표시되며 DMSO - 대우 cytosol은 오픈 원으로 제공됩니다. 평균 ± 범위 두 개의 독립적인 실험이 표시됩니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기존의 방법론 비교 우리 SPR 기반 translocation 분석은 호스트 cytosol에 독소 전송을 감지하는 빠른, 민감한, 그리고 양적 방법을 나타냅니다. 기술 radiolabeling이나 독소에 다른 수정을 요구하지 않으며, 그것은 체인 항체를 사용할 수있는 해독제에 대한 독소를 적용할 수 있습니다. cytosol에 독소 통로를 모니터링하는 기존 방법은 별도의 cytosol과 막 분수 11, 23, 27, 28으로 파티션 세포 추출물에 subcellular 분획화 프로토콜에 의존. 이러한 방법은 독소의 cytosolic 수영장를 검색 서양 얼룩이나 radiolabels를 사용합니다. 이전 접근 방식은 최상의 반 양적이고 상대적으로 가난한 감성을 앓고. 도 radiolabeling 프로토콜 때문에 cytosol에 도달 독소의 낮은 수준으로, 결과를 생성하는 주가 소요될 수 있습니다. radiolabeled 독소와 정량 분석​​은 상대적인 비율을 결정할 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> 시그마 </td><td> D141 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> 시그마 </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> 시그마 </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> 목록 </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N - Hydroxysuccinimide) </td><td> 찌르다 </td><td> 24,500 </td></tr><tr><td> EDC (1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide) </td><td> 써모 과학 </td><td> 22,981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> 시GMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> 안티 CTA 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td> 안티 CTB 항체 </td><td> Calbiochem </td><td> 227,040 </td></tr><tr><td> 안티 PTS1 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR 센서는 슬라이드 </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 콜 팔머 </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

표면 plasmon 공명하여 호스트 cytosol에 독소를 translocation의 감지

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB의 독소 subunit 효소와 세포 결합의 B subunit 1로 구성되어 있습니다. 이러한 독소는 세포 환경으로 분비하지만, 그들은 진핵세포 cytosol 내의 대상에 따라 행동하고 있습니다. 세포 표면에서 cytosol 2-4 들어가기 전에 endoplasmic reticulum (ER)에 소포 항공사에 의해 일부 AB 독소 여행. 응급실에서 독소와 이동의 나머지 부분에서 단백질 실시 채널을 통해 촉매 체인 dissociates은 cytosolic 목표 5에 도달합니다. 응급실에 독소 거래가 매우 비효율적 프로세스이기 때문에 translocated, cytosolic 체인은 감지하기가 어렵습니다 : 대부분의 내면 독소는 잠돌군 Zz 장치 및 ER 6에 도달 표면 바운드 독소의 작은 파편 때문에 전용 저하에 대한 lysosomes로 라우팅됩니다 -12. 응급실에서 교양 세포의 cytosol에 독소의 translocation을 모니터하기 위해, 우리는 highl과 subcellular 분획화 프로토콜을 결합표면 plasmon 공명 (SPR) 13-15의 Y 민감한 검출 방법. 독소 - 치료 세포의 플라즈마 막은 선택 후 해독제 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused하는 cytosolic 분수의 컬렉션을 수 있도록 digitonin와 permeabilized 있습니다. 항체 - 코팅 센서 cytosolic 독소의 PG / ML 수량을 캡처하여 검색할 수 있습니다. 이 프로토콜로, 그것은 cytosol에 독소 항목의 속도론를 수행하고 translocation 이벤트에 대한 억제 효과를 특성화 수 있습니다. cytosolic 독소의 농도는 또한 센서를 통해 perfused되었습니다 체인 표준의 알려진 수량과 생성된 표준 곡선으로부터 계산하실 수 있습니다. 우리의 방법은 radiolabeling 또는 대상 독소 다른 수정을 요구하지 않는 빠른, 민감한, 그리고 양적 탐지 시스템을 나타냅니다.

이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB 독소는 효소 활성을 가진 A 서브유닛과 세포 결합 B 서브유닛으로 구성됩니다1. 이러한 독소들은 세포 외 환경으로 분비되지만, ...

본 절차의 전반적인 목표는 세포질로 유입되는 독소 풀을 검출하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해, 먼저 4°C에서 독소를 숙주 세포 표면에 결합시킵니다. 그다음 결합되지 않은 독소를 제거하고 세포를 37°C로 가온하여 독소가 세포내막계 및 결과적으로 숙주 세포질로 이동할 수 있도록 합니다. 세포 투과 후에는 digitonin을 사용하여 세포막을 선택적으로 투과성 있게 만듭니다.세포 추출물은 분별 원심분리를 통해 별도의 막 분획과 세포질 분획으로 나누어집니다. 마지막 단계로, 항독소 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 세포질 분획을 흘려보내는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasma Resonance, SPR) 분석을 사용하여 세포질로 유입된 독소를 검출하고 정량화합니다. 이 방법은 세포질로의 독소 유입 효율 및 역학, 세포질로 유입되는 독소의 양, 그리고 세포질로의 독소 이동에 대한 잠재적인 약물 억제 효과와 같이 독소 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, HeLa 세포를 하룻밤 동안 배양한 후 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포 독성 처리를 위한 HeLa 세포를 준비하십시오.배양액을 100 ng/mL의 Ganglioside GM1이 포함된 DMEM 1 mL로 교체하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이는 콜레라 독소의 결합 부위 수를 증가시킵니다. GM1 용액에 노출된 세포의 세포막으로 독소의 GM1 수용체가 삽입되기 때문입니다.1시간 동안 배양한 후, 배지가 포함된 GM one을 제거하고 DMEM으로 세포를 2회 세척합니다. 그 다음, 1 µg/mL의 콜레라 독소가 포함된 DMEM 1 mL를 첨가하고, 4 °C에서 30분 동안 세포를 둡니다. 독소가 포함된 배지를 제거하고 세포를 2회 세척합니다.그런 다음 37°C에서 1mL의 DMEM으로 원하는 시간 동안 세포를 배양합니다. 각 체이스(chase) 기간이 끝나면 PBS로 세포를 세척한 후, 각 웰에 250µL의 0.5mM EDTA 및 PBS를 넣어 배양합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, P1000 피펫맨으로 강하게 트리튜레이션(trituration)하여 6-웰 플레이트에서 세포를 수거합니다.세포가 수집된 한 개의 웰을 동일한 조건의 두 번째 및 세 번째 웰과 합칩니다. 그다음, 세 개의 반복 웰에서 합쳐진 세포 현탁액을 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 이제 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.5,000 ×g에서 원심분리하면 모든 조건에서 거의 동일한 크기의 세포 펠릿을 얻어야 합니다. 상층액을 제거한 후, 미리 준비하여 냉각시킨 0.04% digitonin 작업 용액 100 µL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음에 10분간 둡니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 digitonin 처리되어 투과성이 된 세포를 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.상청액 분획이 포함된 세포질을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 소기관이 포함된 펠릿 분획은 보관합니다. SPR 독소 표준물질은 HCN 완충액에서 110, 1 및 0.1 ng/mL 농도로 준비합니다. 상청액 분획이 포함된 세포질을 HCN 완충액으로 희석하여 최종 부피가 1 mL가 되도록 시료를 준비합니다. 주입 전 500 µL 시료 루프에서 공기가 완전히 제거되도록 하려면 최소 1 mL 이상의 시료 부피가 필요합니다. 소기관이 포함된 펠릿 분획은 1% Triton X 100이 포함된 1 mL의 HCN 완충액에 재현탁합니다.막으로 둘러싸인 독소 풀을 방출하기 위해 계면활성제 첨가가 필요합니다. 또한 분획 절차의 정확성을 확인하기 위한 대조 실험용으로 세포질 및 organ L 분획의 병렬 세트를 준비하십시오. 세포질 분획은 20 µL의 4x 샘플 버퍼에, organ L 분획은 120 µL의 1x 샘플 버퍼에 각각 재현탁하십시오. 각 분획의 동일한 부피를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 Western blot 분석으로 탐지하여, 세포질 단백질이 상층액 분획으로, 가용성 상주 ER 단백질이 펠렛 분획으로 분배되었음을 입증하십시오. SPR 슬라이드를 준비하려면 먼저 자기 조립 단분자막이 형성된 금 도금 유리 슬라이드를 SPR 장치에 장착하십시오.41 µL/min의 유속으로 E-D-C-N-H-S 용액을 슬라이드 위로 10분 동안 흘려주어 센서 슬라이드를 활성화합니다. 이후의 모든 퍼퓨전(perfusion) 단계에서는 동일한 유속을 사용합니다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 플레이트를 5분 동안 세척하여 E-D-C-N-H-S 활성 버퍼를 제거합니다.E-D-C-N-H-S 용액에 의한 언캡핑(uncapping)으로 인해 현재 플레이트에는 반응성 MI 테더가 포함되어 있습니다. 다음으로, 20 millimolar sodium acetate에서 1:20,000으로 희석한 anti CTA 항체를 활성화된 센서 슬라이드 위에 15분 동안 흘려줍니다. pH 변화로 인해 굴절률 단위(RIU로 약칭)의 초기 감소가 관찰될 것입니다.이후 항체가 아미드 반응성 테더에 포획됨에 따라 RIU가 증가하게 됩니다. 센서 슬라이드에서 5분간의 PBST 세척을 통해 결합되지 않은 항체를 제거하십시오. 포획된 항체에 의해 생성된 RIU 신호는 고점에 도달하여 안정화되며, 이를 통해 새로운 기선 신호를 제공하게 됩니다.슬라이드 준비의 마지막 단계로, 1 M 에탄올아민을 센서 슬라이드 위로 5분 동안 흘려줍니다. 이는 센서 슬라이드에 남아 있는 결합되지 않은 테더(tether)를 캡핑하여 비활성화합니다. RIU 신호가 증가하며 기준선(baseline) 수치가 설정되면, 항체가 코팅된 센서 위로 PBST를 5분 동안 흘려줍니다.그 후, 실험 샘플 또는 독소 표준물을 센서 위로 300초 동안 흘려줍니다. 버퍼에서 리간드를 제거하고 PBST를 센서 위로 다시 200초 동안 흘려줍니다. 센서에 결합되어 남아 있는 모든 독소는 pH 5.0의 PBST로 102번째 세척을 통해 제거합니다.이렇게 하면 신호가 초기 기저선 읽기 값으로 돌아가므로 동일한 센서에서 다른 샘플을 처리할 수 있습니다. 새 샘플을 로드하기 전에 샘플 루프를 통해 소량의 공기를 밀어 넣어 이전 샘플의 잔류액을 모두 배출하십시오. 획득 후.데이터는 scrubber two 소프트웨어로 분석할 수 있으며, Igor 소프트웨어는 그림 작성에 사용할 수 있습니다. 백일해 독소(Pertussis toxin)는 AB 독소로, a 사슬이 세포질로 들어가기 전 세포 표면에서 소포체(ER)로 이동합니다.SPR 기반의 전위 분석법을 통해 독소에 노출된 CHO 세포의 세포질 내 PTs를 검출할 수 있었습니다. 독소에 노출되지 않은 세포의 세포질에서는 신호가 생성되지 않았으며, 이는 anti PTs의 선택성을 확인시켜 주었습니다. 이는 항체가 숙주 세포질의 구성 요소와 교차 반응하지 않았음을 나타냅니다.felden이 존재하는 상태에서 독소에 노출된 세포의 세포질 분획입니다. A 또한 양성 신호를 생성하지 못했으며, BFA는 소포체(ER) 전위 부위로의 독소 수송을 막아 결과적으로 H 사슬의 세포질 전달을 방해합니다. Chole toin은 또 다른 AB형 소포체 전위 독소입니다.CT 처리된 helo 세포의 세포질 분획에서 CTA1이 검출되었습니다. 이는 본 방법론이 여러 세포 유형에 적용 가능하며, 항-체인 항체가 존재하는 모든 독소에 적용될 수 있음을 강조합니다. CT 처리된 세포의 세포질 분획을 anti-CTB 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 흘렸을 때 신호가 검출되지 않았으며, 이는 CTA1 서브유닛과 달리 세포 결합 CTB PENTAMER는 세포질로 들어가지 않음을 입증합니다.anti CTA 항체가 코팅된 SPR 센서상에서 확산시킨 후의 결과입니다. 세포소기관 분획에서 얻은 신호는 세포질 분획의 약한 신호와 비교했을 때 측정 범위를 벗어날 정도로 강하게 나타납니다. 이는 소포체(ER) 전위 부위로의 CT 수송 효율이 낮아 세포질로 도달하는 독소의 양이 제한적이라는 알려진 사실과 일치합니다.전위된 세포질 독소의 시간 의존적 축적 또한 모니터링할 수 있습니다. 4°C에서 CT에 세포를 노출시킨 후, 37°C로 가온하고 15분이 지날 때까지 세포질에서 독소가 검출되지 않았습니다.37°C에서 30분 후 세포질 내 소량의 독소가 검출되었으며, 45분 및 60분 추적 간격 후에는 세포질 독소의 양이 점진적으로 더 많이 검출되었습니다. 이는 세포와 결합된 독소가 숙주 세포질로 지속적으로 장기간 전달됨을 입증합니다. 이 분석법은 세포질로의 독소 전위 억제 또한 검출할 수 있으며, 10% DMSO로 처리한 세포는 독소의 언폴딩이 억제되어 처리되지 않은 독소 처리 대조군 세포에 비해 CT1과 같은 세포질 내 독소 수준이 낮게 나타났습니다.사슬 구조는 세포질로의 전위(translocation)를 위한 전제 조건이므로, DMSO에 의한 CT A1의 안정화는 그에 따라 소포체(ER)에서 세포질로의 이동을 방지하였습니다. DMSO로 유도된 독소 전위 차단을 정량화하기 위해, 기지 농도의 독소로 생성한 표준 곡선을 사용하여 세포질 내 cta1 농도를 계산하였으며, 그 결과 처리하지 않은 세포는 0.3 ng/mL, DMSO 처리 세포는 0.1 ng/mL로 나타났습니다. 따라서 DMSO에 의한 CT A1 언폴딩(unfolding) 억제는 CTA1의 소포체에서 세포질로의 전위를 3배 감소시켰습니다.이 절차를 통해, 세포질 내 독소의 양과 독소 활성 사이의 직접적인 연관성을 입증하기 위해 독성 분석과 같은 다른 기술들을 활용할 수 있게 됩니다.

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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