Name: 기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 Chagas의 심장 질환을 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 Trypanosoma cruzi kDNA가 닭 게놈에 통합되어 Chagas 심장병을 유발하는 기전을 탐구하는 방법입니다. 이 모델은 기생충 유전자 수직 전파와 심근염 발병 원리를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 낸시 R. Sturm, 면역학학과 미생물학과 분자 생물학, 비판적 독해 원고에 대한 의학의 데이비드 Geffen 학교, 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학에게 빚을 졌네. 연구 CNPq 국립위원회, 연구 개발 - FAPDF, 브라질 재단은 연구를 지원. 우리는 브라질리아, 브라질 대학에서, 알레산드로 O. 수자, 마리아 C. Guimaro, Ciro Cordeiro, 아나 드 계수나무 로사, Roseneide의 알베스, 그리고 라파엘 엔드레데의 기술적 지원을 감사드립니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

평생 T.에 감염될 포유류와는 달리 cruzi 감염은 닭은 찰리의 내화물입니다 cruzi 감염. 치킨 모델 시스템의 주요 이점은 배아 면역 시스템의 개발에 초기 감염의 제거이다. 따라서 닭 몸 안에 남아있는 유일한 기생충의 DNA가 여러 loci에 통합되어 있습니다. 악성 T.의 최적 수량의 사용 cruzi이 풍부한 달걀을 예방하기 위해 trypomastigotes 것은 닭 배아의 게놈에 kDNA minicircles의 통합을 획득 향한 중요한 단계입니다. 100 trypomastigotes과 주사 계란의 실시간 병아리 부화의 비율은 500 기생충으로 얻은 그보다 4 배 높다. 케어는 계란 공기 챔버에 배지 10 μL에 기생충 서스펜션을 예방하기 위해 이동해야합니다. 흰자위에 대한 누설이 없어야합니다. 최적의 조건에서 세포내 기생 감염 장소 위스콘신 소요이후 감염이 타고난 면역에 의해 제거되며 몇 시간 일주일 동안 호스트 세포 진행 내부 부화 및 기생충 곱셈 후 얇게. kDNA 통합 사는 감염이되어 있어야하고, 초기 배아 닭 계란에 알몸 minicircles의 접종은 통합을 초래하지 않습니다. kDNA-양성 배아와 컨트롤은 37.5 ° C와 65 %의 습도에서 통제된 조건에서 지내게됩니다. 새끼는 33 ° C의 실온에서 두 주 동안 새장에 보관됩니다. 이후 닭고기가 22 방에 1.5 미터 너비 통로를 지나서으로 구분 정지 랙에 케이지에 보관 ° C에서 여과 공기와 동물 복지 조건을 확보하기 위해 지속적인 피로 미만의 긍정적인 압력. 성인 치킨 수유를 먹인 연령 다섯 개월 달걀을 세우고, 전체 성장과 성숙을 달성하기 위해 음료수 실행 물을 마실 수 있습니다. T. 작업시 위생 절차의 유지 보수 결과의 재현성을 위해 필수입니다 cruzi가 주사비옥한 닭고기 계란에. 치킨 모델 시스템 T.에서 cruzi 감염은 태아 성장의 초기 시대의 면역 체계의 발달 이후 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거된다. 또한이 T.부터 부화 새끼 감염없이되는 방법 cruzi는 기생충의 항원에 대한 관용이며, 특정 항체의 부족으로, 계란을 주사. 세포 독성 lymphocytes (최소 거부 유닛, 그림 3)에 의해 대상 심장 세포의 거부 반응은 면역 감시 3 유전자형 수정 및 고장을 보여주 kDNA-변이된 닭을 볼 수 있습니다. genotypically 수정된 T-세포는 신체에서 자기 조직의 가속 거절을 제시. 주요 병변 사이트 Chagas 질병의 특징은 마음입니다. physiopathologic 상태 (감시) physiologic의 통로가 clonally 세포 독성 lymphocytes 3의 확산을 보여주는 kDNA-변이된 닭고기에서 볼 수있다. 티그의 transkingdom 모델 시스템은 T.으로 게놈 수정에서 형태소 분석, 기생충 유발, 유전자 중심의 자기 면역 질환 (그림 6)을 보여줍니다 cruzi kDNA는 통합을 minicircle. 이러한 수정은 LB-주사 계란에서 부화 새끼로 볼 수 없습니다. 이러한 현상은 자기 조직의 거절을 방지하기 위해 약물 myocardium에 침투해 특정 T 세포의 표현형의 골수 시조의 억제, 그리고 histocompatible 건강한 골수의 이식이 필요할 수 있습니다 kDNA-변이된 병아리의 염증성 면역 심근증의 실험적 치료를 제안합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 재조합 DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소 </td><td> Invitrogen </td><td> 11615-010 </td><td></td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소 </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-030 </td><td></td></tr><tr><td> 랜덤 Primers 정보의 DNA 라벨링 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 18187-013 </td><td></td></tr><tr><td> 에코 RI </td><td> Invitrogen </td><td> 15202-021 </td><td></td></tr><tr><td> Mbo 전 </td><td> Invitrogen </td><td> 15248-016 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP 세트,​​ 100mM 솔루션 </td><tD&gt; GE 헬스케어 </td><td> 28-4065-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hybond - N + - 고양이 N. </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN303B </td><td></td></tr><tr><td> PlasmidPrep 미니 스핀 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9042-70 </td><td></td></tr><tr><td> NSI 전 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R5884 1KU </td><td></td></tr><tr><td> DNA, 나트륨 소금 생선 정자 </td><td> AMRESCO </td><td> 0644-10G </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 닭고기 부-1B </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8370-02 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 닭고기 CD45 </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8270-08 </td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 닭고기 TCRγδ </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8230-08 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 닭고기 CD8α </td><td> SouthernBiotech </td><td> 9220-02 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 치킨 단핵구 / 대식 세포 </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8420-02 </td><td></td></tr><tr><td> MyCycle Termocycler </td><td> 바이오 방사선 연구소 </td><td> 580BR 5501 </td><td></td></tr></tbody></table>

기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 chagas의 심장 질환을 유발

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

어렸을과 어린 시절에 얻은 Trypanosoma cruzi 급성 감염이 asymptomatic 보이지만 만성 감염된 가지 경우 약 삼분의 30 년 이상으로 Chagas 질병을 보여줍니다. Autoimmunity 및 기생충 지속성은 이론 Chagas 질병 1, 2의 pathogenesis를 설명하기 위해 경쟁하고 있습니다. Chagas 질병에 기생 지속성과 autoimmunity에 의해 연주 별도의 역할에 우리는 T.의 예방 수정된 달걀의 공기 챔버의 cruzi. 성숙한 닭 면역 체계가 T를 상대로 꽉 생물 학적 장벽입니다 cruzi 및 감염이 성장 3 첫 주 말까지 자사의 면역 체계의 발달에 따라 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거한다. 병아리가 부화에 기생충이없는 있지만, 그들은 기생충 mitochondrial DNA kinetoplast (kDNA)가 자신의 자손으로 전송됩니다 자신의 게놈 내에 minicircle 통합 유지합니다. 닭 게놈의 kDNA minicircle 통합 문서 targ에 의해 얻은 것입니다eted 주요 꼬리-PCR, 남부 hybridizations, 복제 및 시퀀싱 3, 4. kDNA는 통합을 minicircle 파열 해독 및 면역 시스템 요인에 대한 열린 독서 프레임, 인산 가수 분해 효소는 (GTPase), adenylate cyclase와 phosphorylases (PKC, NF-카파 B 활성제, PI-3K)는 세포 생리학, 성장 및 분화 3, 5와 연관된 - 7, 및 다른 유전자 기능. effectors 세포 독성 lymphocytes에 의한 대상 심장 섬유의 거부로 인해 심한 심근염 인간 Chagas 질병에서 본 것과 유사한 염증성 심근증을 보여주는, kDNA 변이된 닭을 볼 수 있습니다. 특히, 심장 마비 및 골격근의 약점은 염색체 1 8의 dystrophin 유전자의 kDNA 파열로 성인 닭에 존재한다. 비슷한 genotipic 변경은 effectors CD45 +, CD8γδ + CD8α lymphocytes가 실시하는 조직 파괴와 관련된다. 따라서이 protozoan 감염 유전자 중심의 자기 면역 질환을 일으킬 수.

의 접종<em&gt; Trypanosoma cruzi</em&gt; 인큐베이션 이전 비옥한 계란에 기생충 kDNA는 배아 세포의 게놈에 통합을 minicircle 렌더링. 이종 교배하는가 자손에게 변이의 수직 이동을 보여준다. kDNA은 여러 염색체에서 영역을 코딩으로 통합하고 닭이 염증성자가 면역 질환 심장 질환으로 죽어.

기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 Chagas의 심장 질환을 유발

영유아기 및 아동기에 감염된 Trypanosoma cruzi 급성 감염은 무증상인 것으로 보이나, 만성 감염 사례의 약 3분의 1은...

Cha 병은 ate prot 및 tno mausi에 의한 만성 감염으로 인해 발생하는 임상 상태입니다. 이 질환은 감염된 사람들의 심장을 감염 후 수십 년이 지난 뒤에 공격합니다. 계(kingdom) 간 모델 시스템을 통해 닭의 달걀이 Taz macro cruise 감염에 취약하다는 것이 밝혀졌습니다.배아 성장 첫째 주 동안, 감염되지 않은 닭이 게놈에 기생충 KA를 보유한 경우 샤가스 심장병으로 사망한다는 것을 실험을 통해 확인하였으며, 우수한 사육 환경과 사료 및 용수 공급을 통해 동물 복지를 보장하였습니다. 조직 배양을 통해 크루즈 삼중 질량 및 양호한 수영 형태를 얻었습니다. 기포 제어를 확인하기 위해 tio 및 난자를 투과 조명하였습니다.난자에는 파라 접종을 하지 않습니다. 모의 대조군 난자에는 10 µL의 배양액을 접종합니다. 구멍은 100 viral FL mania용 에시브 테이프로 밀봉합니다.Brazilians is pro master입니다. 염성 유정계란의 기실에 100 viral의 Goats를 접종하고, 10 µL의 calcium media에 포함된 trap macro triple master goats를 유정계란의 기실에 접종합니다. 계란은 37 °C, 습도 65% 조건에서 1~1일 동안 30분마다 부드럽게 회전시키며 배양합니다. renoso macro 접종란과 mark 대조군 모두에서 병아리가 동일하게 부화합니다.성체까지 사육합니다. 날개 정맥에서 혈액 샘플을 채취합니다. 혈액을 15 Ml 원추형 튜브로 옮깁니다.단핵세포는 원심분리를 통해 분리하며, FICO 밀도 구배 세척 후 백혈구 펠렛을 제거하고 상층액을 버립니다. 혈액 단핵세포로부터 중간 유전체 DNA를 추출합니다. PCR 설계에 따라 1.5 ml 원추형 튜브를 준비합니다. 특정 프라이머 세트를 사용하여 chroy nuclear G-N-A-N-G-N-A 및 pls GNA kg NA를 증폭시키기 위한 PCR을 수행합니다. 반응 튜브를 써모사이클러에 넣고 가동합니다.서모사이클러에서 튜브를 꺼냅니다. PCR 산물을 분석합니다. PCR 산물은 Agarose 겔 전기영동으로 분리합니다.겔의 GNA 밴드는 양전하를 띤 나일론 막으로 전이됩니다. 기생충의 지속성과 숙주의 면역에 의해 독립적으로 수행되는 역할을 구분하기 위해 특정 방사성 표지 프로브를 사용하여 하이브리드화를 진행합니다. 샤가스병의 병인 연구에서, 우리는 면역 체계가 발달하기 전인 초기 배아 성장기 동안에만 T. cruzi 감염이 가능한 닭 모델을 사용합니다. T. cruzi가 접종된 알에서 부화한 병아리들은 감염되지 않은 상태이지만, 기생충의 미토콘드리아 AKG A는 체내에 남아 있습니다.tzo macro가 접종된 계란에서 부화한 병아리들만이 kg a 밴드를 나타내며, 해당 DNA는 닭의 게놈에는 존재하지 않습니다. Leia Brazilian의 pro master goats가 접종된 계란에서 부화한 병아리들은 게놈 내에 미토콘드리아 원형 서열을 보유하지 않습니다. 레인 1: 공백, 레인 2: 대조군 GNA, 레인 3 및 4: mock GS, 레인 5~14: Las mania Brazilians 감염란에서 부화한 병아리 유래 Gs.레인 15은 LB3 및 LB5 특이적 KDNA 프라이머 세트를 사용하여 얻은 750 base pairs 크기의 Brazil amplicon format 밴드입니다. L-P-C-R-A 체커보드 스캔은 온도를 높여가며 3회 증폭시킨 네스팅(nesting) 과정 이후에 사용된 gallus guns 프라이머를 나타냅니다. PCR은 서로 다른 KDNA PRI 세트로 수행되었습니다.Louis 엄격도 사이클은 프라이머 결합 및 니엘링(kneeling)을 위한 부위와 고엄격도 사이클을 생성합니다. 이는 증폭 산물의 특이성을 높여줍니다. KA 프로브와 하이브리드화된 저증폭 PCR 산물을 상업적으로 클로닝하고 시퀀싱하였습니다.서열은 파란색 원으로 표시된 kg NA 중간 마이크로 상동성 재조합 접합부(노란색)와 녹색의 gallo ga GNA를 보여줍니다. 닭 게놈에 통합된 kg NA의 매핑은 타겟 프라이머 타입 PCR(R TP therapy PCR) 기술에 의해 확인되었습니다. 변이된 성체 닭인 Cajun은 샤가스 심장 질환이 발생했습니다.대조군일수록 더 건강하게 성장합니다. KDNA 변이 닭은 X선 사진에서 심장 실루엣이 증가한 양상을 보입니다. 부검 결과, 대조군 닭은 심장 크기가 작은 것으로 나타났습니다.변이된 닭 품종인 Cajun은 심낭수종, 독성 수종 및 심비대를 보입니다. 이러한 심비대는 샤가스 심장병의 양상과 유사합니다. Moog로 제어된 닭의 심장은 정상적인 조직학적 소견을 보입니다.변이된 닭의 kg은 심근 섬유 사이에 위치한 세포독성 림프구에 의해 심근에 형성된 터널을 보여줍니다. 여러 염색체의 코드 영역에 통합된 조류 서클의 서열은 kg NA 프라이머와 호스트 GNA 특이적 프라이머 세트 수십 개를 결합한 변형 중첩 PCR(nested type PCR)을 통해 밝혀졌습니다. GNA 변이 닭은 심부전으로 사망하며 심비대증을 보입니다.현미경 병리 소견에서 샤가스병과 유사한 심근염이 관찰되며, 이는 심장으로 전이되었습니다. kg NA 변이 닭은 유전적으로 유도된 질환을 나타냅니다. 이는 샤가스병의 임상적 및 병리학적 징후가 깨끗한 종간 모델 시스템에서 재현된 첫 사례입니다.감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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