측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

이 절차의 전반적인 목적은 인간 혈청 및 BAL 액에서 아스페르길루스 진단 항원을 신속하게 검출하기 위한 측방 유동 장치의 사용법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 혈청 또는 BAL 시료를 측방 유동 장치의 방출 포트에 도포함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 용액이 막을 따라 이동하도록 하는 것입니다.

다음 단계는 내부 대조선(internal control line)을 확인하여 테스트의 유효성을 결정하는 것입니다. 마지막 단계는 테스트선(test line)을 확인하여 테스트 결과를 해석하는 것입니다. 궁극적으로, 이 측방 유동 장치는 혈청 또는 기관지 폐포 세척액(BAL fluids) 내의 aspergillus 진단 항원 존재 여부를 검출하는 데 사용됩니다.

Aspergillus LFD는 침습성 폐 아스페르길루스증 진단을 위한 보조 검사로 사용될 수 있습니다. Aspergillus, galacto-mannan 효소 면역 측정법, panfungal beta-glucan 분석 및 Aspergillus PCR 검사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 최소한의 실험실 시설과 교육만으로 가능한 신속한 현장 진단 검사라는 점입니다. LFD는 Aspergillus 종의 검출을 위해 개발되었지만, 측방 유동 기술은 Cephalosporium, Fusarium 및 Rhizopus 종과 같은 다른 감염성 병원체의 검출에도 적용될 수 있습니다.

이들 생물체에 특이적인 단클론 항체를 통합함으로써, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. LFD 결과의 해석에는 분석 형식에 대한 익숙함이 필요하므로, 처리되지 않은 혈액 샘플에서 혈청을 수집하려면 혈액을 4 °C에서 응고시키십시오. 혈청 및 기관지폐포 세척액(BAL fluid)은 사용 전 -20 °C에서 분주하여 보관해야 합니다. 분주 보관은 반복적인 테스트 과정 중 샘플의 반복적인 냉동-해동으로 인해 표적 항원이 분해될 가능성을 제한합니다. 테스트를 위해 혈청 및 BAL 샘플을 준비하려면, 샘플을 상온에서 해동한 후 얼음 위에 보관하십시오. 볼텍싱으로 충분히 혼합한 다음 14,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리하십시오. 인간 샘플의 일반적인 테스트의 경우, 혈청을 조직 배양 배지와 1:1로 희석하십시오. 또는, 혈청 면역 복합체로부터 표적 항원을 해리시키기 위해, 4% EDTA가 포함된 PBS로 혈청을 1:2로 희석한 후 끓는 물 중탕에서 3분간 가열하고 14,000 RPM에서 5분간 원심 분리하십시오.

사람의 BAL 액은 전처리가 필요하지 않습니다. 해동 후 볼텍싱과 원심분리를 거친 BAL 샘플은 측방 유동 장치에 직접 적용할 수 있는 순수 샘플입니다. 테스트를 위한 측방 유동 장치(LFD)는 실온 또는 23 °C에서 보관하며, 이 조건에서 12개월 동안 안정적입니다.

분석을 시작하려면 파우치에서 장치를 꺼내 평평한 표면에 놓으십시오. 멸균 피펫 팁을 사용하여 전처리된 혈청 100 µL를 수초 이내에 장치의 주입구에 도포합니다. 액체는 모세관 현상에 의해 관찰 창의 니트로셀룰로오스 막을 따라 이동해야 합니다.

동일한 방법으로, 원액 BAL 샘플 100 µL를 장치의 방출 포트에 적용합니다. 상온에서 15분 동안 분석을 진행한 후, 해당 시점에 테스트 결과를 기록해야 합니다. 결과를 기록하기 전까지 테스트 시간을 15분 이상 방치해서는 안 됩니다.

이는 결과 해석에 편향을 줄 수 있으므로, 배양 기간을 연장한다고 해서 약한 반응이 강화되지는 않습니다. LFD는 플라스틱 하우징에 문자 C로 표시된 내부 대조선과 문자 T로 표시된 검사선으로 구성됩니다. 대조선은 혈청 또는 BAL 샘플 내 aspergillus 항원 존재 여부와 관계없이 항상 나타나야 합니다. 이는 혈청 또는 BAL 샘플에 aspergillus 항원이 존재할 때 분석이 올바르게 수행되었음을 나타냅니다.

검사선 또한 시료 도포 후 15분 이내에 나타납니다. 검사선과 Lyme 반응의 강도는 혈청 및 VAL 시료 내 표적 항원의 농도에 비례합니다. 이 절차에서 가장 까다로운 부분은 검사 결과의 해석입니다.

LFD 결과는 15분 후에 판독해야 하며, 테스트 결과를 여기에 제시된 대표 예시와 비교하십시오. 이 그림에는 BAL 및 혈청 샘플을 사용한 LFD 결과의 약양성, 중등도 양성 및 강양성 대표 예시가 나와 있습니다. 강도와 관계없이 혈청 샘플에서 양성 테스트 라인이 나타나면 혈류 내에 순환하는 aspergillus 항원이 존재함을 의미하며, 이는 침습성 아스페르길루스증 또는 IPA 질환을 나타냅니다. 강도와 관계없이 BAL 반응이 양성인 경우는 폐 내에서 포자의 발아 및 잠재적 병원성 균사가 발달했음을 나타냅니다.

Aspergillus 항원이 없는 경우, 테스트 라인이 나타나지 않으며 결과는 음성으로 기록됩니다. 이 표는 유럽암연구치료기구(European Organization for Research and Treatment of Cancer) 및 국립알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases) 연구 그룹의 진단 기준에 따라 진단된 급성 골수성 백혈병 또는 ML 환자의 BAL 액을 이용한 LFD 테스트 결과를 보여줍니다. 이 표에는 각 환자에 대한 해당 임상 및 심리학적 데이터와 ASPERIA 특이적 PCR 테스트 결과가 포함되어 있습니다.

2002년 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 따르면, 환자 12, 13 및 16은 숙주 요인과 임상적 기준 또는 GM 양성 반응을 근거로 가능성 있는(possible) IPA로 진단되었습니다. 개정된 2008년 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 따르면, 숙주 요인과 GM 양성 반응만으로 또는 숙주 요인과 임상적 기준만으로는 각각 임상 데이터 및 진균학적 증거가 수반되지 않는 한 가능성 있는 침습성 진균 감염으로 간주되지 않습니다. 환자 6은 숙주 요인, 주요 및 부수적 임상 특징, 그리고 GM 양성 반응으로 인해 2002년과 2008년 가이드라인 모두에서 확률 높은(probable) IPA로 진단되었습니다.

마지막으로, 현재 LFD 분석이나 PCR 분석 모두 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 포함되어 있지 않으나, 환자 6번과 12번의 BAL 샘플에서 두 분석법과 상용 galactomannan 검사 결과가 일치하며, 본 절차를 통해 aspergillus 항원과 핵산의 존재가 확인되었음에 유의하십시오. 침습성 진균증을 확진하기 위해 Pella Galactomannan 효소 면역 분석, panf, 진균 beta-glucan 검사 또는 aspergillus PCR 검사와 같은 다른 방법들을 병행하여 수행할 수 있습니다. 인간 혈청 및 BAL 액을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 장비 조작자는 항상 B형 간염 및 결핵과 같은 질병에 대해 예방 접종을 받아야 함을 잊지 마십시오.