측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

본 실험의 전반적인 목표는 인간 혈청 및 기관지 세척액(BAL) 내의 aspergillus 진단 항원을 신속하게 검출하기 위한 측방 유동 장치의 사용법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 혈청 또는 BAL 샘플을 측방 유동 장치의 주입구에 도포함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 용액이 막을 따라 이동하도록 두는 것입니다.

다음 단계는 내부 대조선(internal control line)을 확인하여 테스트가 유효한지 결정하는 것입니다. 마지막 단계는 테스트선(test line)을 확인하여 테스트 결과를 해석하는 것입니다. 결과적으로, 이 측방 유동 장치는 혈청 또는 BAL 액에서 aspergillus 진단 항원의 존재를 검출하는 데 사용됩니다.

Aspergillus LFD는 침습성 폐 아스페르길루스증 진단을 위한 보조 검사로 사용될 수 있습니다. Aspergillus, galacto-Manan 효소 면역 분석법, panfungal beta-glucan 분석 및 Aspergillus PCR 검사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 최소한의 실험실 시설과 교육만으로 가능한 신속한 현장 진단 검사라는 점입니다. LFD는 Aspergillus 종의 검출을 위해 개발되었지만, 측방 유동 기술은 Cephalosporium, Fusarium 및 Rhizopus 종과 같은 다른 감염성 병원체의 검출에도 적용될 수 있습니다.

이들 유기체에 특이적인 단클론 항체를 통합함으로써, 이 방법의 시각적 입증이 매우 중요합니다. LFD 결과의 해석에는 분석 형식에 대한 숙지가 필요합니다. 처리되지 않은 혈액 샘플에서 혈청을 수집하려면 혈액을 4 °C에서 응고시키십시오. 혈청 및 기관지폐포 세척액(BAL)은 사용 전 -20 °C에서 분주하여 보관해야 합니다. 분주하여 보관하면 반복적인 테스트 중 샘플을 반복해서 냉동 및 해동할 때 발생할 수 있는 표적 항원의 분해 가능성을 제한할 수 있습니다. 테스트를 위해 혈청 및 BAL 샘플을 준비하려면 샘플을 실온에서 해동한 후 얼음 위에 보관하십시오. 보텍싱으로 충분히 혼합한 다음 14,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리하십시오. 인간 샘플의 일상적인 테스트의 경우, 혈청을 조직 배양 배지로 1:1 비율로 희석하십시오. 또는, 혈청 면역 복합체에서 표적 항원을 분리하기 위해 4% EDTA가 포함된 PBS로 혈청을 1:2 비율로 희석하십시오. 끓는 물 중탕에서 3분 동안 가열하고 14,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하십시오.

인체 BAL 액체는 전처리가 필요하지 않습니다. 해동 후 볼텍싱과 원심분리를 거친 BAL 시료는 측방 유동 장치에 직접 적용할 수 있는 순수 시료가 됩니다. 테스트를 위해 측방 유동 장치(LFD)는 실온 또는 23 °C에서 보관하며, 이 조건에서 12개월 동안 안정적입니다.

분석을 시작하려면, 파우치에서 장치를 꺼내 평평한 표면에 놓으십시오. 멸균 피펫 팁을 사용하여 전처리된 혈청 100 µL를 수 초 이내에 장치의 방출 포트에 도포하십시오. 액체는 모세관 현상에 의해 관찰창 내의 니트로셀룰로오스 막을 따라 이동해야 합니다.

동일한 방식으로, 순수 BAL 샘플 100 µL를 장치의 방출 포트에 도포합니다. 상온에서 15분 동안 분석을 진행한 후, 해당 시점에 테스트 결과를 기록해야 합니다. 결과 기록 전까지 테스트 시간을 15분 이상으로 유지해서는 안 됩니다.

이는 결과 해석에 편향을 줄 수 있으므로, 반응이 약하다고 해서 배양 기간을 연장하여 강화해서는 안 됩니다. LFD는 플라스틱 하우징에 문자 C로 표시된 내부 대조선과 문자 T로 표시된 검사선으로 구성됩니다. 대조선은 혈청 또는 BAL 시료 내의 aspergillus 항원 존재 여부와 관계없이 항상 나타나야 합니다. 이는 혈청 또는 BAL 시료에 aspergillus 항원이 존재하는 경우 분석이 올바르게 수행되었음을 나타냅니다.

검사선 또한 시료 도포 후 15분 이내에 나타납니다. 검사선과 Lyme 반응의 강도는 혈청 및 VAL 시료 내 표적 항원의 농도에 비례합니다. 이 절차에서 가장 까다로운 부분은 검사 결과의 해석입니다.

LFD 결과는 15분 후에 판독해야 하며, 테스트 결과를 여기 제시된 대표 예시와 비교하십시오. 이 그림에는 BAL 및 혈청 샘플을 이용한 LFD 결과의 약양성, 중등도 양성 및 강양성 대표 예시가 나타나 있습니다. 강도와 관계없이 혈청 샘플에서 양성 테스트 라인이 나타나면 혈류 내에 순환하는 aspergillus 항원이 존재함을 의미하며, 이는 침습성 아스페르길루스증 또는 IPA 질환을 나타냅니다. 강도와 관계없이 BAL 반응이 양성인 경우, 폐 내에서 포자가 발아하고 잠재적으로 병원성인 hyphy가 발달했음을 나타냅니다.

Aspergillus 항원이 없을 경우 테스트 라인이 나타나지 않으며, 결과는 음성으로 기록됩니다. 이 표는 유럽 암 연구 및 치료 기구(European Organization for Research and Treatment of Cancer)와 국립 알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases) 연구 그룹의 진단 기준에 따라 진단된 급성 골수성 백혈병 또는 ML 환자의 BAL 액을 사용한 LFD 테스트 결과를 보여줍니다. 이 표에는 각 환자에 대한 해당 임상 및 심리적 데이터와 ASPERIA 특이적 PCR 테스트 결과가 포함되어 있습니다.

2002 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 따라, 환자 12, 13 및 16은 숙주 요인과 임상적 기준 또는 GM 양성 반응을 근거로 가능성 있는 IPA(possible IPA)로 진단되었습니다. 개정된 2008 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 따르면, 숙주 요인과 GM 양성 반응만으로, 또는 숙주 요인과 임상적 기준만으로는 각각 임상 데이터 및 진균학적 근거가 뒷받침되지 않는 한 가능성 있는 침습성 진균 감염으로 간주되지 않습니다. 환자 6은 숙주 요인, 주요 및 부수적 임상 특징, 그리고 GM 양성 반응으로 인해 2002년과 2008년 가이드라인 모두에서 확률적 IPA(probable IPA)로 진단되었습니다.

마지막으로, LFD 분석과 PCR 분석 모두 현재 E-O-R-T-C-M-S-G 가이드라인에 포함되어 있지는 않으나, 환자 6번과 12번의 BAL 샘플에서 두 분석법과 상용 galactomannan 테스트 결과가 매우 일치하여 aspergillus 항원 및 핵산의 존재를 나타냈다는 점에 유의하십시오. 본 절차 외에도, 침습성 진균 질환을 확진하기 위해 Pella Galactomannan 효소 면역 분석, pan-fungal beta-glucan 테스트 또는 aspergillus PCR 테스트와 같은 다른 방법들을 병행하여 수행할 수 있습니다. 사람의 혈청 및 BAL 액을 취급하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 장치 운용자는 항상 B형 간염 및 결핵과 같은 질병에 대해 예방 접종을 받아야 함을 잊지 마십시오.