Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

본 영상에서는 자기 비드 기반 분리 및 형광 활성 세포 분류법을 이용하여 조혈 전구세포를 분리하고 표현형을 분석하는 프로토콜을 보여줍니다. 먼저, 마우스에서 뒷다리, 대퇴골, 경골 및 척수를 적출하여 균질화함으로써 골수 세포 현탁액을 생성합니다. 이후 자기 마이크로비드 흐름을 통해 C kit을 발현하는 세포군을 농축합니다.

농축된 세포군에 대한 유세포 분석 결과, 이 방법이 고도로 정제된 조혈 계통 세포, 전구 세포 및 조혈 줄기세포를 생성함을 보여주며, 이는 이후 in vitro 및 in vivo 기능 연구에 사용될 수 있습니다. 골수 세척(bone flushing)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 골수 세포를 더 효율적이고 빠르게 회복할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 조혈 전구 세포의 표현형 특성 분석 및 ex vivo 기능 분석을 가능하게 하므로, 염증, 자가면역, 면역 결핍, 퇴행성 질환, 대사 장애 및 암 면역 모델의 치료나 진단 분야까지 그 활용 범위가 확장됩니다.

따라서 이 방법은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 조혈 작용을 모니터링하는 데 유용한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 전구세포 하위 집합에서의 세포 생물학적 신호 전달 및 발달 조절 유전자 발현을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 우선, 안락사시킨 마우스를 스테인리스 스틸 팬에 놓는 것으로 시작하십시오.

세포 공급원으로 사용할 뼈를 채취하기 위해 복부와 등을 70% ethanol로 분무합니다. 가위를 사용하여 뒷다리 피부에 두 개의 작은 절개창을 내고, 핀셋의 도움을 받아 대퇴골을 탈구시킨 후, 마우스를 뒤집어 피부를 세로로 절개합니다. 척주를 노출시키기 위해 척주를 제거합니다.

그 다음 끝이 뾰족한 가위를 사용하여 척추에서 모든 연조직 잔해를 조심스럽게 제거합니다. 거즈를 사용하여 대퇴골과 경골에서 연조직 잔해를 제거하십시오.

그 다음 30 mL의 보충된 RPMI Medium이 들어 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 뼈를 넣습니다. 멸균된 유발에 4/5인치 멸균 필터를 여러 장 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 뼈를 유발로 옮기고, 마찰 표면을 만들기 위해 필터를 한 층 더 덮어줍니다.

다음으로 50 mL 원심분리 튜브에 40 micron 셀 스트레이너 필터를 배치합니다. 그런 다음 유발을 사용하여 균질한 세포 현탁액이 얻어질 때까지 뼈를 분쇄합니다. 그리고 피펫을 사용하여 현탁액을 세포 필터로 옮깁니다.

다음으로, 신선한 보충 RPMI 5 mL를 막자사발에 넣어 남은 세포를 세척하고 회수하기 위해 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 그다음 해당 RPMI를 필터가 있는 튜브에 넣습니다. 균질화된 뼈가 투명해 보일 때까지 위 두 단계를 반복합니다.

용액이 필터를 통과하면, 이를 새로운 50 milliliter 튜브로 옮겨 필터링 과정을 반복함으로써 남아 있는 조직 파편을 제거합니다. 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이때 세포 펠릿이 손상되지 않도록 주의하십시오.

절차의 다음 단계는 조혈 전구세포의 표현형을 분석하는 것입니다. 우선 각 마우스에서 얻은 세포 펠렛을 15 milliliters의 PBS 및 2%FBS에 재현탁합니다. 그 다음 튜브를 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리하고, 흡입법을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

펠릿을 건드리지 마십시오. 5 mL의 PBS와 2% FBS로 펠릿을 재현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 농도가 결정되면, 96웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 1x10⁵개의 세포를 분주합니다.

그런 다음 플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리하는 동안, 세포를 염색하기 위해 여기에 나열된 표면 마커에 대한 단클론 항체 혼합물을 PBS와 2% FBS에 준비합니다. 원심분리가 완료되면 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고, 각 웰에 항체 혼합물 50 µL를 첨가합니다.

그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅함으로써 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 세포를 4°C의 암실에서 20분 동안 배양한 후, 150 µL의 PBS 및 2% FBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그 후 플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

그런 다음 플레이트를 뒤집어 senna를 제거합니다. 다음으로, 2% FBS가 포함된 PBS에 희석된 1:300 AP 3 size 7 strept adin 50 µL를 각 웰에 첨가하고 피펫팅하여 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 10분 동안 배양합니다.

150 µL의 PBS 및 2% FBS로 세포를 두 번 세척합니다. 플레이트를 원심 분리한 후 상층액을 제거하고, 세포를 100 µL의 PBS 및 2% FBS에 재현탁하여 사이토메트리로 시료를 분석합니다. 다음으로 선택된 조혈 세포 서브셋을 분리하기 위해, 골수에서 자성 농축을 수행하여 secret 양성 세포를 농축합니다. 최소 10마리의 마우스에서 유래된 골수 세포 펠렛을 1:50으로 희석한 PC 접합 C 키트 단클론 항체가 포함된 1 mL의 완충 용액에 재현탁합니다.

배양 후 4°C의 암소에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 40 mL의 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 원심분리 후, 흡입법을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 펠릿에 마우스당 50 µL의 anti A PC microbeads를 직접 첨가합니다. 잘 혼합하고, 배양 세척 후 4 °C의 암소에서 20분 동안 배양한 다음 이전과 동일하게 세포를 원심 분리합니다. 그 후 세포 펠릿을 4 mL의 완충 용액에 재현탁합니다. 마우스 3마리마다 적절한 max separator의 자기장 내에 max LS columns를 배치합니다.

4L의 완충액으로 컬럼을 헹구어 준비합니다. 그다음 세포 현탁액을 주입하고, 통과하여 나오는 표지되지 않은 세포를 수집 튜브에 수집합니다. 완충액 4L로 컬럼을 세 번 세척합니다.

컬럼 저장조가 비워지면 새 버퍼를 추가하십시오. 모든 솔루션이 통과하여 흘러나오면 유출액을 폐기하고, 분리기로부터 컬럼을 제거하여 각각 15 milliliter 원추형 튜브 위에 놓으십시오. 각 컬럼에 4 milliliter의 버퍼 솔루션을 파이펫으로 넣은 후, 즉시 플런저를 컬럼 안으로 밀어 넣어 자성 표지된 세포를 씻어내십시오.

튜브를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 각 펠릿을 1 mL의 완충 용액으로 재현탁하고, 펠릿들을 하나의 15 mL 원추형 튜브에 모읍니다.

c-Kit 양성 세포 집단이 농축되면, FACS를 통해 세포를 염색하고 분리합니다. 자성 비즈를 사용하여 c-Kit 양성 세포가 농축된 골수 현탁액으로부터 조혈 전구세포와 조혈 줄기세포를 얻었으며, 이 비디오에서 설명한 바와 같이 표면 분자의 발현에 따라 LT-HSC 및 THSC를 분리하였습니다. 이 그림은 Lin- 세포 중에서 공통 림프구 전구세포를 측정하기 위한 전자 게이팅 절차의 예를 보여줍니다.

CD7 low interleukin seven R positive 세포들을 확인하십시오. Lin- CD7+ CD45RA+ 및 Lin- CD7+ CD45RA- low 세포들을 CD7 positive 게이트에서 확인하십시오.

공통 골수계 전구세포는 FC gamma R.Low CD 34 양성 세포로 식별됩니다. 또한 C kit 양성 게이트에서 과립구-단핵구 전구세포는 FC gamma high CD 34 양성 세포로 식별되며, 거핵구-적혈구 전구세포는 FC gamma low CD 34 음성 세포로 식별됩니다. LKS군에서 L-T-H-S-C와 S-T-H-S-C는 각각 CD 34 음성 및 CD 34 양성 세포로 식별됩니다. 이를 통해 대조군 및 염증성 장질환 쥐의 조혈모세포에서 자가면역이 조혈 작용에 미치는 영향을 분석하기 위해, 생리학적으로는 낮은 수로 존재하는 농축 및 고순도의 두 세포 집단을 확보하였습니다.

여기에 보이는 바와 같이 KI 67 항체와 DPI로 염색되었습니다. 건강한 대조군의 LKS CD 34 음성 조혈모세포 구획에서는 세포 주기 진행 세포가 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 이와 대조적으로, IBD 동안에는 동일한 세포 하위 집합이 유의하게 증가하며, 상당수의 HSC가 세포 주기의 SG two M기에서 검출됩니다.

이는 T세포 매개 만성 염증이 조혈모세포(HSC)의 세포 주기 진입을 결정한다는 것을 시사합니다. 소포에 저장된 ATP의 존재 여부를 평가하기 위해, 건강한 마우스의 CD34 음성 세포를 뉴클레오타이드 결합 화합물인 퀴닌으로 염색하였으며, 살아있는 세포 공초점 현미경을 통한 핵 적색 분석 결과, GMP가 아닌 HSC의 세포질에서 퀴닌 양성 소포가 관찰되었습니다. HSC가 세포 외 ATP에 반응하는지 확인하기 위해, 4,0,2가 로딩된 분리 조혈모세포를 ATP와 이오노마이신으로 자극하여 칼슘 반응을 분석한 결과가 여기에 나타나 있습니다. 단일 세포 칼슘 상승 추적 결과, pure anergic P2 수용체의 활성화에 의해 LT-HSC의 세포질 내 칼슘이 증가했음을 보여줍니다.

세포질 내 칼슘 농도의 상승이 소포성 ATP 방출을 유도하기 때문에, ATP에 노출되었을 때 발생합니다. 이 실험은 ATP가 조혈모세포(HSC)로부터의 자체 방출을 조절할 수 있음을 시사하며, 이 절차가 조혈모세포의 기능 연구에 활용될 수 있음을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 기능 분석을 위해 신경계 토포 줄기세포 및 계보 결정 전구세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 이어, C 상태나 염증성 환경에서 정제된 조혈모세포의 재구성 능력과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 비조사 수recipient 마우스의 재구성으로 대표되는 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.