Name: Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 마우스 골수에서 조혈 줄기 세포와 계통 헌신 전구세포를 자기 비드 분리 및 유세포 분석으로 분리하고 표현형을 분석하는 방법을. 이 기술은 효율적인 세포 회수와 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 귀중한 조언을 Nobuyuki Onai, 히토시 타키자와 마르쿠스 Manz 감사드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단, 스위스 암 리그와 Fondazione Ticinese마다 라 RIcerca ㅡ Cancro에 의해 재정 지원되었다.

1. 골수의 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 마우스를 안락사와 복부 뒤로 향해 스테인리스 냄비와 스프레이 70 % 에탄올에 동물을 배치하십시오. 대퇴골과 경골 뒷다리에서, 그리고 척추를 수집합니다. </li><li> 정확하게 날카로운 팁 가위로와 거즈로 다리 뼈에서 척추에서 모든 연조직 잔류물을 제거합니다. 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올, 100 μm의 제품 MEM 비 필수 아미노산과 보충 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS),, 1 밀리미터 MEM 나트륨 Pyruvate, 2를 포함하는 RPMI 매체 30 ML과 50 ML 팔콘 튜브의 상점 뼈 MM L-글루타민, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 및 100 U / ML 페니실린. </li><li> 무균 필터와 이전에 소독을 절구의 바닥을 커버. </li><li> 절구에 뼈를 전송 및 마찰 표면을 조립하기 위해 필터 계층으로 그들을 포괄합니다. </li><li> 팔콘 필터와 함께 제공되는 50 ML 팔콘 튜브를 준비합니다. </li><li> 뼈를 부술균일한 세포 현탁액을 얻기까지 유봉의 도움으로. </li><li> 튜브로 정학을 전송합니다. </li><li> 남아있는 세포를 씻고 기증 신선한 RPMI 전체 매체의 박격포 5 ML에 추가합니다. </li><li> 균질 뼈를 확실히 나타날 때까지 마지막 두 포인트를 반복합니다. </li><li> 나머지 조직 파편을 제거하기 위해 세포 현탁액을 전송하고 새 튜브로 필터링합니다. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 세포 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li></ol> 2. Phenotypic 분석 <ol><li> Resuspend 및 PBS와 2% FBS의 15 ML에서 개별 생쥐의 세포를 씻는다. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 5 ML PBS와 2퍼센트 FBS 및 카운트 세포에 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 이전 1 × 10 6 세포 /도 96 라운드 우물 밑바닥에서판. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 번호판을 원심 분리기. </li><li> 다음과 같은 표면 마커 향한 mAbs의 혼합을 준비합니다. 그들을 희석은 PBS에 표시된 및 2퍼센트 FBS가 세포를 얼룩. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, 인 경우에는 3 번 CD, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200으로 복합 </li><li> APC 1:100으로 C-키트 복합 </li><li> 비오틴 1시 50분에 복합 Sca1 </li><li> FITC 1시 50분에 복합 CD34 </li><li> PE 1:100으로 복합 FcγR </li><li> PE-Cy7 1:100으로 IL-7R 복합 </li></ul></li><li> 뜨는을 무시하고 각 잘으로 mAbs 믹스의 50 μL를 추가합니다. pipetting하여 단일 세포로 분열시키다. </li><li> 4 ° C.에 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 품어 </li><li> PBS 150 μL 및 2% FBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 접시를 원심 분리기와 반전 판에 의해 뜨는 버리고. </li><li> PBS에 streptavidin을 희석하고 2 % FBS는 세포를 얼룩이 지적했다. <ul type="disc"><li> Streptavidin conjuAPC-Cy7 1:300으로 문이 </li></ul></li><li> 각도에 대한 해결책 50 μL를 추가합니다. pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 교제를 끊다. </li><li> 4 ° C.에 어둠 속에서 10 분 대한 세포를 품어 </li><li> PBS 150 μL 및 2% FBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 접시를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> PBS와 2% FBS 100 μL의 세포를 Resuspend. </li><li> FACS에서 샘플을 습득. </li></ol> 3. C-키트 + 세포의 자성 농축 <ol><li> PBS, 산도 7.2, (BSA) 0.5 % 소 혈청 알부민, 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 완충 용액을 준비한다. </li><li> APC에 복합 C-키트 mAb를 포함하는 완충 용액의 1 ML에서 최소 10 생쥐에서 추출한 뼈 marrows의 세포 펠렛을 Resuspend은 1시 50분을 희석. </li><li> 4 ° C.에 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 품어 </li><li> 완충 용액의 40 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 조심스럽게 T를 제거그는 흡인에 의해 뜨는. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> Resuspend 세포 펠렛은하고 펠릿 직접 각 euthanized 마우스에 대한 안티 - APC의 MicroBeads 50 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어서 4 ° C.에 어둠 속에서 20 분 동안 품어 </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 완충 용액 및 원심 분리기 40 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는 기음. </li><li> 사흘에 마우스 euthanized 완충 용액 4 ML의 여러 관련 Resuspend 세포 펠릿. </li><li> 적당한 맥에서 구분 기호의 자기장의 장소는 맥에서 LS 열을. 사흘에 마우스 euthanized 한 컬럼을 사용합니다. </li><li> 완충 용액 4 ML과 rinsing하여 컬럼을 준비합니다. </li><li> 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> 통과 및 완충 용액 4 ML로 칼럼을 씻고 레이블이 지정되지 않은 세포를 수집합니다. 완충 용액 4 ML 세 번 추가하여 세척 단계를 수행합니다. 열 저수지가납니다 새로운 버퍼를 추가합니다. </li><li> 구분 및 plac에서 열 제거전자 15 ML 팔콘 튜브 위에 각각. </li><li> 각 열에 진입 완충 용액의 피펫 4 ML. 즉시 열에 플런저를 밀어 자기 (磁 气)라고 표시된 전지를 살아가기. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 한 15 ML 팔콘 튜브의 완충 용액 및 그룹 알약 1 ML 각 펠렛을 Resuspend. </li></ol> 4. 조혈 줄기 세포와 리니지 헌신 Progenitors으로 정렬 <ol><li> 다음과 같은 표면 마커 향한 mAbs의 혼합을 준비합니다. 그들을 희석은 세포를 얼룩이 500 μL PBS와 2% FBS에 표시된. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, 인 경우에는 3 번 CD, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200으로 복합 </li><li> APC 1:100으로 C-키트 복합 </li><li> 비오틴 1시 50분로 SCA-1 복합 </li><li> FITC 1시 50분에 복합 CD34 </li><li> PE 1:100으로 복합 FcγR </li></ul></li><li> previou에서 튜브를 원심 분리기님의 5 분을위한 1,500 rpm으로 섹션을 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 펠렛에 mAbs 믹스를 추가합니다. pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 교제를 끊다. </li><li> 4 ° C.에 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 품어 </li><li> PBS의 14mL 및 2% FBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> streptavidin을 희석은 500 μL PBS에 표시된와 2 %의 FBS 세포를 얼룩. <ul type="disc"><li> APC-Cy7 1:300으로 복합 Streptavidin </li></ul></li><li> 튜브에 솔루션을 추가합니다. pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 교제를 끊다. </li><li> 4 ° C.에 어둠 속에서 10 분 대한 세포를 품어 </li><li> PBS의 14 ML 및 2% FBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> PBS와 2% FBS 500 μL의 세포를 Resuspend. </li><li> 엘리를 위해 새로운 5 ML 관의 세포 현탁액을 전송 및 필터링분류 절차를 방해할 수 세포 집계를 minate. </li><li> 정렬 인구에서 7-AAD + 죽은 세포를 제외하기 위해 세포 현탁액에 7-AAD 5 μL를 (이것은 1:100 희석 사용) 추가합니다. </li><li> 다음 phenotypes에 따라 BD FACSAria로 정렬 세포 : <ul type="disc"><li> LKS 세포 : 린 - C-키트 + 무서-1 + </li><li> LT-HSCs : LKS CD34 - </li><li> ST-HSCs : LKS CD34 + </li><li> GMPs : 린 - C-키트 + 무서-1 낮은 FcγR 높은 CD34 + </li><li> MEPs : 린 - C-키트 + 무서-1 낮은 FcγR 낮은 CD34 - </li><li> CMPs : 린 - CD34 C-키트 + 무서-1 낮은 FcγR 낮음 + </li></ul></li></ol> 5. 대표 결과 한 쇼 및 전자 게이팅 절차의 예제와 그림린과 같은 점수를 일반적인 림프 progenitors (CLPs) - / C - 키트 싸다 / 인터루킨 (IL)-7R + 세포, 린 - / C-키트 + / 무서-1 + (LKS) 및 린 - / C-키트 + / 무서 -1 이오 (C-키트 +) 세포, C-키트 + 게이트에서, 일반적인 골수양 progenitors (CMPs)는 FcγR 싸다, CD34 + 세포, FcγR 하이 CD34 + 세포 및 / megakaryocyte 같은 과립 / 단핵세포 progenitors (GMPs)로 식별됩니다 FcγR 싸다, CD34와 같은 적혈구 progenitors (MEPs) - 세포, LKS 게이트, LT-HSC와 ST-HSC에서는 CD34으로 식별됩니다 - 그리고 CD34 + 세포, 각각. 그러면 위에서 설명한 표현형에 따라 CD34 표현뿐만 아니라 다른 progenitors에 따라 정렬하실 수 있습니다 LT-HSC와 ST-HSC,이 골수 세포 현탁액은 자기 구슬 (그림 2)와 C-키트 + 세포에 대해 풍부하게 할 수 있습니다. HSCs 아나 수<html> 세포가 염기 결합 화합물 quinacrine 11뿐만 아니라 핵 빨간색 (DRAQ5) 물들일되었습니다 - CD34는 그림 4와 같이 라이브 이미징 공촛점 현미경으로 lyzed. HSCs에 있지만 GMPs 아닌 quinacrine - 긍정 vesicles는 세포질 12 볼 수 있습니다. + LT-HSC에 노출시 purinergic P2 수용체의 활성화에 의한 cytosolic 칼슘 2의 증가를 보여주는 그림 5에서 보여준대로 더욱이, 정렬 HSCs는 기능적 실험에 사용할 수 아데노신-triphosphate (ATP)와 ionomycin 12. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> 그림 1. 린 - BM 전지의 대표 점 플롯 분석. 프로토콜 텍스트에 설명된대로 골수 세포 현탁액에서 조혈 progenitors과 HSCs를 파악하고 채점하는 흐름 cytometer에서 전자 게이팅 절차 묻다. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 골수에서 C-키트 + 세포의 선택적 농축을위한 제도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> 그림 3 전자 문이 LKS CD34의 세포주기 분석 -. 건강한 컨트롤 및 KI-67 항체와 DAPI 물들일 IBD와 생쥐의 HSCs. 세포가 수정 및 / Lyse 고정 및 1 μg / ML에서 FITC KI-67 복합 및 DAPI로 더럽히는 것 다음에 버퍼를 파마로 permeabilized되었다. 사이클링 세포들은 거의 LKS CD34의 모든 감지의 경우 - 건강한 컨트롤 12 HSCs 구획. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . 뉴클레오 티드 결합 화합물 quinacrine 및 핵 빨간색 (DRAQ5) 물들일 HSCs과 GMPs - 그림 4는 CD34을 정렬 FACS의 이미징 공촛점 현미경을 살고 있습니다. 작은 quadrants는 quinacrine POS를 보여itive vesicles는 HSCs의 세포질에서 발견되지만 GMPs 없습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> 그림 5. Cytosolic 칼슘 2 + Fura-2로로드되고 ATP와 ionomycin으로 자극 정렬 HSCs의 고도. 단일 세포의 성분이 표시됩니다. 모든 세포는 + ATP가 추가 후 cytosolic 칼슘 2의 현저한 증가를 보여주는 세포외 ATP에 반응했다.

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<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 설명한 방법은 개별 생쥐 (그림 1) 조혈의 신속하고 정확한 분석을 가능하게합니다. murine 염증의 모델, autoimmunity, 면역 결핍, 퇴행성 질환, 대사 질환 및 암 등 다양한 실험적 설정,이 분석은 조혈에 대한 병리 학적 조건의 영향을 해결하실 수 있습니다. 그림 3은 전자 문이 LKS의 세포 사이클링 활동의 분석을 보여줍니다 CD34 - KI-67 mab 및 DAPI로 더럽히는 것에 의해 건강한 마우스 및 염증성 장 질환 (IBD) 13과 생쥐의 세포. 후자는 세포주기의 S / G 2 / M 단계에서 세포의 상당한 증가를 표시합니다. 유동세포계측법에서 해당 분석 HSC 사이클링 활동 12 T 세포 매개 염증의 영향을 보여줍니다. 세포와 C-Kit를 표현 자성 라벨링 및 골수 세포의 농축의 조합은 흐름 cytometr으로 정렬y는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42,401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11,140 </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11,360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15,070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20,012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16,000 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 40 μm의 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td></tr><tr><td> 7-AAD의 염색법 솔루션 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559,925 </td></tr><tr><td> 버퍼를 Lyse / 수정 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558,049 </td></tr><tr><td> 버퍼 III를 파마 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558,050 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> KI-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556,026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150,041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6.7) </td><td> eBioscience </td><td> 150,081 </td></tr><tr><td> 인 경우에는 3 번 CD (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150,031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150,452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150,193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155,931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155,921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455,941 </td></tr><tr><td> C-키트 (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171,171 </td></tr><tr><td> SCA-1 (D7) </td><td> eBiosci줬어 </td><td> 135,981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110,341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553,145 </td></tr><tr><td> 안티 APC의 MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS 열 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 progenitors의 phenotypic 분석 및 절연

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

골수는 HSCs보다 성숙한 혈액 세포 가계 progenitors가 거주하고 성인 유기체에서 차별 교장 사이트입니다. HSCs는 삶의 시간을 1 모든 혈액 세포 lineages을 생성할 수있는 pluripotent 세포 분 세포 인구를 구성합니다. 골수에서 HSCs 항상성의 분자 해부는 조혈, 종양학 및 재생 의료에서​​ 중요한 의미를 가지고 있습니다. 우리는 형광 항체 및 개별 생쥐의 조혈 전구 하위 집합 및 HSCs 분포 (그림 1) 득점하기 유동세포계측법의 전자 게이팅 절차 라벨 프로토콜을 설명합니다. 또한 광범위하게 조혈 progenitors뿐 아니라 장기 (LT) 및 C-Kit를 표현하는 세포의 자성 농축하여 풀링된 골수 세포 현탁액에서 HSCs를 reconstituting 단기 (ST)를 풍부하게하는 방법을 설명합니다. 그 결과 세포 준비는 체외에 대해 선택한 하위 집합을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다생체내 기능 연구에 대하여 (그림 2). 두 trabecular osteoblasts 2,3 및 sinusoidal 내피의 4 골수에서 HSCs을 지원하는 기능성 틈새를 구성합니다. N-cadherin + osteoblasts 3의 하위 집합과 그 리간드 angiopoietin-1 5 HSCs로 표현 수용체 티로신 키나제의 Tie2의 상호 작용을 포함 osteoblastic 틈새에서 몇몇 메커니즘은 HSCs의 정지를 결정하는데 동의합니다. 골수에서 &quot;최대 절전 모드&quot;는 과도한 사이클링 활동 6시 복제 및 최종 피로로부터 HSCs을 보호하기 위해 중요합니다. 이러한 수신자 같은 수용체 리간드 7, 인터페론-α 6 등 타고난 면역 계통의 세포에 따르고 외인성 자극에도 혈통이 커밋된 progenitors으로 확산 및 HSCs의 분화를 유도하실 수 있습니다. 최근 린 내에서 휴면 마우스 HSCs의 인구 - C-키트 + 무서-1 + CD150 + CD48 - CD34 - 인구가 8을 설명했습니다. 세포 정렬 여기에 설명된대로 조혈 progenitors 강화 세포 현탁액에서 CD34 표현에 따르면 허용 정지 자체 갱신 LT-HSCs과 ST-HSCs 9 모두의 고립. 혈통 긍정적인 세포의 고갈과 CD48와 Flk2 항체와 LT-HSC의 분류를 기반으로 유사한 절차는 이전에 10을 설명했습니다. 현재 보고서에서는 phenotypic 특성화 및 다른 생리 및 병리 학적 조건에서 조혈을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다 조혈 progenitors의 전직의 생체내 세포주기 분석을 위해 프로토콜을 제공합니다. 더욱이, 우리는 요인 및 세포 생물학 및 신호 전달 장치 assays에서뿐만 아니라 이식에 대한 그들의 자기 갱신, 확장 및 분화를 조절 메커니즘을 정의하는 데 사용할 수 HSCs를위한 절차를 정렬 FACS에 대해 설명합니다.

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

골수는 성체 생물체 내에서 조혈모세포(HSC)와 더 성숙한 혈구 계열 전구세포가 거주하며 분화하는 주요 장소입니다. 조혈모세포는...

본 영상에서는 자기 비드 기반 분리 및 형광 활성 세포 분류법을 이용하여 조혈 전구세포를 분리하고 표현형을 분석하는 프로토콜을 보여줍니다. 먼저, 마우스에서 뒷다리, 대퇴골, 경골 및 척수를 적출하여 균질화함으로써 골수 세포 현탁액을 생성합니다. 이후 자기 마이크로비드 흐름을 통해 C kit을 발현하는 세포군을 농축합니다.농축된 세포군에 대한 유세포 분석 결과, 이 방법이 고도로 정제된 조혈 계통 세포, 전구 세포 및 조혈 줄기세포를 생성함을 보여주며, 이는 이후 in vitro 및 in vivo 기능 연구에 사용될 수 있습니다. 골수 세척(bone flushing)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 골수 세포를 더 효율적이고 빠르게 회복할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 조혈 전구 세포의 표현형 특성 분석 및 ex vivo 기능 분석을 가능하게 하므로, 염증, 자가면역, 면역 결핍, 퇴행성 질환, 대사 장애 및 암 면역 모델의 치료나 진단 분야까지 그 활용 범위가 확장됩니다.따라서 이 방법은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 조혈 작용을 모니터링하는 데 유용한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 전구세포 하위 집합에서의 세포 생물학적 신호 전달 및 발달 조절 유전자 발현을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 우선, 안락사시킨 마우스를 스테인리스 스틸 팬에 놓는 것으로 시작하십시오.세포 공급원으로 사용할 뼈를 채취하기 위해 복부와 등을 70% ethanol로 분무합니다. 가위를 사용하여 뒷다리 피부에 두 개의 작은 절개창을 내고, 핀셋의 도움을 받아 대퇴골을 탈구시킨 후, 마우스를 뒤집어 피부를 세로로 절개합니다. 척주를 노출시키기 위해 척주를 제거합니다.그 다음 끝이 뾰족한 가위를 사용하여 척추에서 모든 연조직 잔해를 조심스럽게 제거합니다. 거즈를 사용하여 대퇴골과 경골에서 연조직 잔해를 제거하십시오.그 다음 30 mL의 보충된 RPMI Medium이 들어 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 뼈를 넣습니다. 멸균된 유발에 4/5인치 멸균 필터를 여러 장 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 뼈를 유발로 옮기고, 마찰 표면을 만들기 위해 필터를 한 층 더 덮어줍니다.다음으로 50 mL 원심분리 튜브에 40 micron 셀 스트레이너 필터를 배치합니다. 그런 다음 유발을 사용하여 균질한 세포 현탁액이 얻어질 때까지 뼈를 분쇄합니다. 그리고 피펫을 사용하여 현탁액을 세포 필터로 옮깁니다.다음으로, 신선한 보충 RPMI 5 mL를 막자사발에 넣어 남은 세포를 세척하고 회수하기 위해 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 그다음 해당 RPMI를 필터가 있는 튜브에 넣습니다. 균질화된 뼈가 투명해 보일 때까지 위 두 단계를 반복합니다.용액이 필터를 통과하면, 이를 새로운 50 milliliter 튜브로 옮겨 필터링 과정을 반복함으로써 남아 있는 조직 파편을 제거합니다. 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이때 세포 펠릿이 손상되지 않도록 주의하십시오.절차의 다음 단계는 조혈 전구세포의 표현형을 분석하는 것입니다. 우선 각 마우스에서 얻은 세포 펠렛을 15 milliliters의 PBS 및 2%FBS에 재현탁합니다. 그 다음 튜브를 4 °C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리하고, 흡입법을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다.펠릿을 건드리지 마십시오. 5 mL의 PBS와 2% FBS로 펠릿을 재현탁하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 농도가 결정되면, 96웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 1x10⁵개의 세포를 분주합니다.그런 다음 플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리하는 동안, 세포를 염색하기 위해 여기에 나열된 표면 마커에 대한 단클론 항체 혼합물을 PBS와 2% FBS에 준비합니다. 원심분리가 완료되면 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고, 각 웰에 항체 혼합물 50 µL를 첨가합니다.그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅함으로써 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 세포를 4°C의 암실에서 20분 동안 배양한 후, 150 µL의 PBS 및 2% FBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그 후 플레이트를 500 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.그런 다음 플레이트를 뒤집어 senna를 제거합니다. 다음으로, 2% FBS가 포함된 PBS에 희석된 1:300 AP 3 size 7 strept adin 50 µL를 각 웰에 첨가하고 피펫팅하여 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 10분 동안 배양합니다.150 µL의 PBS 및 2% FBS로 세포를 두 번 세척합니다. 플레이트를 원심 분리한 후 상층액을 제거하고, 세포를 100 µL의 PBS 및 2% FBS에 재현탁하여 사이토메트리로 시료를 분석합니다. 다음으로 선택된 조혈 세포 서브셋을 분리하기 위해, 골수에서 자성 농축을 수행하여 secret 양성 세포를 농축합니다. 최소 10마리의 마우스에서 유래된 골수 세포 펠렛을 1:50으로 희석한 PC 접합 C 키트 단클론 항체가 포함된 1 mL의 완충 용액에 재현탁합니다.배양 후 4°C의 암소에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 40 mL의 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 원심분리 후, 흡입법을 통해 상층액을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 펠릿에 마우스당 50 µL의 anti A PC microbeads를 직접 첨가합니다. 잘 혼합하고, 배양 세척 후 4 °C의 암소에서 20분 동안 배양한 다음 이전과 동일하게 세포를 원심 분리합니다. 그 후 세포 펠릿을 4 mL의 완충 용액에 재현탁합니다. 마우스 3마리마다 적절한 max separator의 자기장 내에 max LS columns를 배치합니다.4L의 완충액으로 컬럼을 헹구어 준비합니다. 그다음 세포 현탁액을 주입하고, 통과하여 나오는 표지되지 않은 세포를 수집 튜브에 수집합니다. 완충액 4L로 컬럼을 세 번 세척합니다.컬럼 저장조가 비워지면 새 버퍼를 추가하십시오. 모든 솔루션이 통과하여 흘러나오면 유출액을 폐기하고, 분리기로부터 컬럼을 제거하여 각각 15 milliliter 원추형 튜브 위에 놓으십시오. 각 컬럼에 4 milliliter의 버퍼 솔루션을 파이펫으로 넣은 후, 즉시 플런저를 컬럼 안으로 밀어 넣어 자성 표지된 세포를 씻어내십시오.튜브를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 각 펠릿을 1 mL의 완충 용액으로 재현탁하고, 펠릿들을 하나의 15 mL 원추형 튜브에 모읍니다.c-Kit 양성 세포 집단이 농축되면, FACS를 통해 세포를 염색하고 분리합니다. 자성 비즈를 사용하여 c-Kit 양성 세포가 농축된 골수 현탁액으로부터 조혈 전구세포와 조혈 줄기세포를 얻었으며, 이 비디오에서 설명한 바와 같이 표면 분자의 발현에 따라 LT-HSC 및 THSC를 분리하였습니다. 이 그림은 Lin- 세포 중에서 공통 림프구 전구세포를 측정하기 위한 전자 게이팅 절차의 예를 보여줍니다.CD7 low interleukin seven R positive 세포들을 확인하십시오. Lin- CD7+ CD45RA+ 및 Lin- CD7+ CD45RA- low 세포들을 CD7 positive 게이트에서 확인하십시오.공통 골수계 전구세포는 FC gamma R.Low CD 34 양성 세포로 식별됩니다. 또한 C kit 양성 게이트에서 과립구-단핵구 전구세포는 FC gamma high CD 34 양성 세포로 식별되며, 거핵구-적혈구 전구세포는 FC gamma low CD 34 음성 세포로 식별됩니다. LKS군에서 L-T-H-S-C와 S-T-H-S-C는 각각 CD 34 음성 및 CD 34 양성 세포로 식별됩니다. 이를 통해 대조군 및 염증성 장질환 쥐의 조혈모세포에서 자가면역이 조혈 작용에 미치는 영향을 분석하기 위해, 생리학적으로는 낮은 수로 존재하는 농축 및 고순도의 두 세포 집단을 확보하였습니다.여기에 보이는 바와 같이 KI 67 항체와 DPI로 염색되었습니다. 건강한 대조군의 LKS CD 34 음성 조혈모세포 구획에서는 세포 주기 진행 세포가 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 이와 대조적으로, IBD 동안에는 동일한 세포 하위 집합이 유의하게 증가하며, 상당수의 HSC가 세포 주기의 SG two M기에서 검출됩니다.이는 T세포 매개 만성 염증이 조혈모세포(HSC)의 세포 주기 진입을 결정한다는 것을 시사합니다. 소포에 저장된 ATP의 존재 여부를 평가하기 위해, 건강한 마우스의 CD34 음성 세포를 뉴클레오타이드 결합 화합물인 퀴닌으로 염색하였으며, 살아있는 세포 공초점 현미경을 통한 핵 적색 분석 결과, GMP가 아닌 HSC의 세포질에서 퀴닌 양성 소포가 관찰되었습니다. HSC가 세포 외 ATP에 반응하는지 확인하기 위해, 4,0,2가 로딩된 분리 조혈모세포를 ATP와 이오노마이신으로 자극하여 칼슘 반응을 분석한 결과가 여기에 나타나 있습니다. 단일 세포 칼슘 상승 추적 결과, pure anergic P2 수용체의 활성화에 의해 LT-HSC의 세포질 내 칼슘이 증가했음을 보여줍니다.세포질 내 칼슘 농도의 상승이 소포성 ATP 방출을 유도하기 때문에, ATP에 노출되었을 때 발생합니다. 이 실험은 ATP가 조혈모세포(HSC)로부터의 자체 방출을 조절할 수 있음을 시사하며, 이 절차가 조혈모세포의 기능 연구에 활용될 수 있음을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 기능 분석을 위해 신경계 토포 줄기세포 및 계보 결정 전구세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 이어, C 상태나 염증성 환경에서 정제된 조혈모세포의 재구성 능력과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 비조사 수recipient 마우스의 재구성으로 대표되는 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

이 비디오는 태아의 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 영역을 미세 절개하다 및 조혈 줄기 세포를 정렬 유동세포계측법를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

배우세요 마우스 골수에서 조혈 줄기 세포와 계통 헌신 전구세포를 자기 비드 분리 및 유세포 분석으로 분리하고 표현형을 분석하는 방법을. 이 기술은 효율적인 세포 회수와 기능 연구에 활용됩니다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

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