Name: 교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 형광 복구 및 형광 손실 광블리칭을 사용하여 교양 뉴런의 막 단백질 삽입과 엑소사이토시스 동역학을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 신경 세포에서 단백질 운송 메커니즘을 연구하는 데 강력한 도구를 제공합니다.

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우리는 재정 지원을위한 Wellcome 신뢰와 ERC에 감사를드립니다. IMGG은 EMBO 연구원입니다. KLH는 BBSRC 투자 박사 과정 학생입니다. 우리는 현미경과 유지 보수 및 지원을위한 기술 및 세포 문화 지원과 박사 앤드류 도허티를 위해 필립 루빈과 패트 릭 Tidball 감사드립니다.

1. 세포 배양, 바이러스성 형질 도입 및 단백질 표현 <ol><li> 시험 관내 (DIV)의 14~25일위한 폴리-L-라이신-코팅 유리 coverslips에서 배아 일 18 일 (E18)의 쥐 새끼의 문화 고밀도 hippocampal 뉴런. </li><li> 6 - 24 시간 전에 살아있는 실험으로, 슈퍼 황도 pHluorin (9월) 태그에 관심있는 막 단백질을 포함하는 감쇠 Sindbis 바이러스와 transduce 세포. </li><li> 에어컨 미디어 1mL를 포함 coverslip에 직접 pseudovirion 함유 매체를 추가하고 문화 인큐베이터으로 돌아왔습니다. 바이러스성 형질 도입에 따라 단백질 발현을위한 titer와 시간은 바이러스 배치에 따라 다를 수 있으며, 사전 라이브 셀 실험을 시작으로 각 일괄 처리에 대한 결정되어야합니다. </li></ol> 2. FRAP-플립 라이브 세포 이미징 <ol><li> 장비 설정 <ol><li> 자이스 혈구 Axiovert LSM 510 메타 공촛점 현미경 이미징 챔버로 coverslip을 전송합니다.이미징 동안 전력 변동을 최소화하기 위해 현미경은 이미징 이전 최소 20 분 동안 100 % 레이저 출력으로 켜져되었습니다 보장합니다. </li><li> 즉시, 미리 예열과 문화 매체를 교체 (37 ° C) 140 밀리미터 NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15 MM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM HEPES을 (산도가 조절이 포함된 세포외 녹음 솔루션 NaOH와 7.4)와이 자이스 혈구 Axiovert의 예비 가열 단계 (37 ℃)에서 챔버에 배치. 세포외 녹음 솔루션의 osmolarity가 배지 10 mOsM 이내로 조정됩니다 확인하십시오. 더 중요한 증발이 실험 timecourse 동안 발생하지 않습니다 제공,이 CO 2 독립적인 솔루션은 짧은 실험 (&lt;10 시간)에 적합합니다. 1-2 밀리미터 나트륨 중탄산염으로 보완하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 영상 캡처 매개 변수를 정의 <ol><li> 첫째, 재조합 프로를 표현하는 신경 세포를 식별관심 tein과 집중시키다. </li><li> 63X 기름 반대로, 낮은 레이저 파워에서 488nm 레이저 조명 여기를 사용하여 전체 세포의 이미지를 획득. photobleaching 최소화하기 위해 전체 스캔 속도에게 &lt;1 초 유지하는 빠른 공칭 속도 (7-9)과 낮은 픽셀 해상도 (512-512)을 사용합니다. </li><li> 투자 수익 (~ 1.5-2.5 X 광학 줌) 포함하는 프레임을 캡처하는 이미지와 확대에 dendrite의 일부를 선택합니다. 가능하다면, 불특정 인해 인수가 발생에 photobleaching 있는지 확인하기 위해, 참고 dendrites에서 측정을 얻을 수 있도록보기의 필드가 여러 프로세스를 포함하고 보장합니다. </li><li> 필터, 핀홀, 스캔 속도와 최소한의 레이저 여기에서 그러나 한정된 채도와 최대한의 형광을 활성화 탐지기 게인을 조정합니다. 대형 핀홀 직경은 (2μm는 쪽이 및 3 원 dendrites에 적합) 광자 컬렉션을 극대화하기 위해 권장합니다. 검출기 이득은 작은 형광 단위를 감지할 수있을만큼 강해 져야한다photobleaching 전에 처음 이미지, 포화 픽셀의 10 %를 극복하지 않는 것이 그러한. </li><li> 사전 / 사후 표백제와 실험의 복구 단계에 사용하도록이 구성을 저장합니다. </li><li> 다음 photobleach 영역을 정의하며 이후 반복적인 photobleaching 단계의 초기 photobleach 및 측면 지역에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 측면 지역은 스캔 (일반적으로 5 μm의, 그림을 참조하십시오. 2) 사이에 확산하여 복구를 방지할 수있을만큼 넓은 확인하십시오. </li><li> photobleach의 ROIs 모두 표백 매개 변수를 조정하십시오. 초기 photobleach는 광학 줌 및 투자 수익 (ROI)의 볼륨에 따라 1-5 반복 사이에 필요로 급속한 (0.1-0.5 초)이어야합니다. 측면 지역의 경우, 레이저 여기는 측면 영역의 지속적인 photobleaching을 보장하도록 조정하지만, phototoxic 손상없이해야한다. </li><li> 지침으로서, 우리는 반복 photobleaching 산도를 위해 100 % 레이저 초기 photobleach 위해 여기, 그리고 10 % 만 사용ASE. </li></ol></li><li> 이미지 획득 <ol><li> 모든 매개 변수가 설정되고 나면, 아래의 4 블록에서 설명한 변수 촬영된 이미지 시퀀스와 같은 FRAP-플립 실험을 수행 : BLOCK 1 : 3-10 미리 표백제를 기준 이미지, 낮은 레이저 파워에서, 시간 지연 BLOCK 2 : Photobleach 전체 레이저 파워에서 중앙 투자 수익 (ROI), 1-5 반복 BLOCK 3 : 3-10 후 표백제를 복구 이미지 4 BLOCK : 1의 전형적인 시간 간격으로 이미지 캡쳐와 함께 미디엄 레이저 파워에서 영역을 측면의 반복 photobleach - 5 초, 조사중인 단백질의 회복 속도에 따라. </li><li> 마지막으로, 140 MM NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15mM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM MES (형광 끄지 위하여) 또는 50 MM을 구비를 포함 pH6에서 버퍼 녹음 솔루션 세포외 녹화 솔루션을 대체 NH4Cl 90 MM NaCl, 5 KCl MM 15 MM 포도당, 1.8 MM CaCl 2, 0.8 MM를 포함하는MgCl 2, 20-25 밀리미터 HEPES, pH7.4 (낮은 pH의 세포 내 상점에서 단백질을 표시하는 방법), (그림을 참조하십시오. 2). </li><li> 통계 분석을 사용하려면, 각각의 재조합 단백질을 위해 최소한 10-20 데이터 집합을 수집합니다. 바이어스 결과를 피하려면되도록 이미징 조건은 복제 일관성 유지됩니다. 모든 데이터 불완전한 표백, 중요한 초점 평면 드리프트 또는 phototoxic 세포 손상이 관찰되는 위치 설정 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> ImageJ 소프트웨어와 함께 이미지를 엽니다. </li><li> Stackreg 플러그인 (플러그인 → stackreg → 변환을 사용하여 시계열에 걸쳐 발생했을 수 XY 평면의 작은 변화에 대해 계정에 스택을 정렬 : 딱딱한 몸을 → <ok> ). </ok></li><li> 자이스 혈구 공촛점에 찍힌 사진을 보려면 텍스트 파일과 같은 시간 값 (플러그인 → 도구 모음 → LSM보기 LSM 도구 상자를보고 LSM 도구 모음 플러그인을 사용 → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> )및 분석 스프레드 시트에 이러한 값을 가져옵니다. </apply></apply></li><li> FRAP-플립 실험 중 형광 변화를 측정하기 위해서 각각의 픽셀 영역 (~ 20pixels)로 photobleached 세그먼트를 분할하고 각 시점 (F)에서 이러한 ROIs의 평균 형광을 측정합니다. 신속하게 이러한 값을 얻으려면 ImageJ &#39;투자 수익 (ROI) 관리자&#39;분석 도구 (→ 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석)를 사용하여 여러 ROIs를 선택하고 &#39;플롯 Z 축 프로파일&#39;명령 (사용하는 픽셀 당 평균 형광을보고 이미지 → 스택 → 플롯 Z 축 프로파일). </li><li> 배경이 아닌 형광 영역의 형광 강도를 측정하기 위해이 단계를 반복합니다. </li><li> 실험적인 노이즈를 제거하고 평균 미리 표백 기준 척도에 의해 모든 가치를 나눌 배경 값을 빼서하여 각 시점에서 형광 강도를 정상화. </li><li> 불특정의 수준을 평가하기 위해 인접하지 않은 photobleached dendrites의 형광 강도를 측정수집하는 동안 photobleaching. 불특정 photobleaching에 대한 정정은 &#39;FRAP-뒤집기&#39;데이터의 해석에 대해 낙심하고 가능한 한 피해야한다. </li><li> 중요한 복구가 투자 수익 (ROI)에 자리를 차지하게되지 않으면 계산하려면 첫 번째 5-10 조치 (ΔF)의 평균에서 시퀀스의 마지막 5-10 조치의 평균을 빼야하고 통계적 의미를 결정한다. exocytosis의 패턴 (예 : exocytosis의 핫스팟이나 척추 대 샤프트 복구)을 평가하기 위해 복구 및 비 회복 ROIs를 분류합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 전형 FRAP-플립 실험의 결과는 그림에 표시됩니다. 2. 여기에서, 9 월 태그에 AMPA 타입 글루 탐 산염 수용체의 GluA2 subunit을 표현 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached되었습니다. 그림 2.A는 몇 군데와 (화이트 박스 영역) photobleaching로 선정되었습니다 ROIs를 나타냅니다되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다. 그림 2.B는 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도를 보여줍니다. 이 예제에서는 1 분 복구 기간은 표백하지 않은 수용체는 측면 확산하여 투자 수익 (ROI)를 입력할 수 있도록 초기 photobleach 후에 기록되었다. 측면 영역이 photobleached 때, 수용체의이 고도의 운동성이있는 분수에서 형광 신호는 중앙 지역에서 occluded하고 있으며, 지역 내에 이러한 밖을 희석된다. &#39;뒤집기&#39;순서를 통해 관찰 형광 (ΔF)의 증가 따라서 돌기 축의 월 GluA2의 삽입에 의한 것이 있습니다. 낮은 산도 세척 및 산도 7.4은 + NH4Cl 또한 각각 측정된 형광이 표면에서 파생되었는지 확인측정된 투자 수익 (ROI) 내에서 세포, 분리된 단백질의 비율을 단백질과를 공개. FRAP와 달리,이 방법론은 photobleached 지역의 형광 회복 크게 감소 수준의 결과로 인해 exocytosis에 복구를 분리합니다. 전혀 신뢰할 수있는 수학적 모델과 데이트도하는 것은 맞지와 회복이 선택적 표백 기술을 이용하여 기록된 흔적은 무었 분석하기 위해 개발되었습니다. 그것은 모노 지수 회복과 복구 추적에 맞게, 그러나 가능하다 : F (t) = S - 영 전자 (-T / τ) F (t)는 시간 t에 형광 어디있어, s는, 정상 상태 값은 0 시간 0 번 오프셋이며, τ는 일정한 시간입니다. 복구 성장 삽입 및 확산 사이의 안정된 상태로 대응하는, 평형에 도달하기 위해 주어진 속도로 고정됩니다. 중요한 것은, 시간 상수이에서 추출nalysis는 exocytosis의 지속 시간을 반영하지 않으며 오직 개인의 단백질에 대한 비교 치료에 사용될 수 있습니다. 또한, 형광 회복 예상 패턴 photobleached 지역에 따라 하위 도메인에서 관찰 가능성이 높습니다. photobleached 세그먼트 내의 작은 투자 수익 (ROI) 분석은 exocytosis &quot;핫스팟&quot;을 공개하는 것이 필수적이 될 수 있고 그것은 계산 속도에 영향을줍니다 dendrite 사이에 이러한 장소의 밀도 변화 같은 비교 길이의 영역을 분석하는 것이 좋습니다. 그림 3은보기의 분야에서 여러 dendrites 대형 섹션 투자 수익 (ROI)에 photobleach를 적용,이 프로토콜의 확장을 보여주는 단 하나의 dendrite의 표백 선택적 반복하여 따라갔다. 이 접근법은 전통적인 &#39;FRAP&#39;와 병렬로 취득되는 &#39;FRAP-뒤집기&#39;데이터 수 있습니다. 이 예제에서는 hippocampal 뉴런은 kainate 클래스의 글루 탐 산염 수용체 subunit에 감염되었습니다; GluK2을 월 태그를 지정했습니다. Prio이미징에 대한 R은 이러한 뉴런은-되었다 단백질 합성을 차단하는 cylcohexamide (200μg/ml에서 2 시간)로 치료. 각각의 측정 ROIs (그림 3.B)에서 같은 형광 복구 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 들어서는 dendrite에서 혼자 표준 FRAP의 dendrite 대 재활용의 측면 확산과 재활용으로 인해 회복의 비율을 밝히지 있습니다. FRAP 대 &#39;FRAP-뒤집기&#39;회복 곡선, 재활용의 상대적 기여도 (ΔF 레크 리에 = 11.05 %) 대 (ΔF 비교 = 9.35 %) 확산 측면에서 ΔF 값을 비교하는 것은 유추 할 수 있습니다. 그림 2와 달리 회복 단백질 합성의 억제로 인해 정상 상태 수준보다는을 유지하지 않습니다 보여줍 가능한 수용체 수영장 (휴일 약 20 % 감소의 고갈에 대한 일시적 증가와 대응, 신호의 드롭 오프 이후 촬영 기간 동안). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></P&gt; 그림 1.이 도식은 월 태그를 수용체를 사용하여 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 대 정기 FRAP의 결과를 보여줍니다 FRAP VS FRAP-플립 프로토콜의 원칙의 도식. 전통 FRAP의 형광 복구는 왼쪽에 표시됩니다. 중앙 투자 수익 (ROI)로 측정 형광 복구 재활용 및 / 또는 돌기 축에 드 노보 exocytosis를 통해 photobleached 투자 수익 (ROI)와 수용체의 삽입 외부에서 측방 확산 F 비 photobleached 월 태그를 수용체의 조합에 따라 결정됩니다. 반대로 오른쪽에 그림 측면 ROIs의 반복 photobleached가 보여주는 방법을 수평 확산으로 인해 수정된 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 침묵 복구. 따라서 모든 측정된 형광 복구는 투자 수익 (ROI)에 직접 삽입에 의한 것이 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> 그림 2.돌기 축의 플라즈마 막에 월 GluA2의 삽입 ) 월 GluA2을 표현 hippocampal 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached. 상단 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 도식은 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 대형 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 photobleaching 이전 dendrite를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다. 나) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도, 투자 수익 (ROI)의 회색 레벨 (정규화되지 않음)으로 꾸몄다를 보여줍니다. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF는 일을 나타냅니다돌기 축에 월 GluA2의 삽입으로 인해 복구 기간 동안 관찰 형광의 전자 증가. 후속 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> 그림 3. cyclohexamide 치료를 따라 돌기 축의 재활용 및 월 GluK2의 측면 확산 대 재활용 ) hippocampal 신경 세포가 평행 FRAP 및 별도의 돌기 ROIs 함께 수행한 &#39;FRAP-뒤집기&#39;복구 프로토콜로 선택 photobleached 월 GluK2을 표현. 이 신경 세포는 단백질 합성을 (200 μg / ML에서 2 시간) 차단, cyclohexamide으로 전처리의 대상이었다. 개략도 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 낮은 dendrite 유일의 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 이전 photobleaching에 dendrites를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜에 비해 전통적인 FRAP의 형광 회복을 보여주는 B의 높은 배율에 표시된 ROIs)를 강조 표시합니다. 회복의 늦은 단계 (제 3 패널)의 형광 강도의 수준을 비교 혼자 재활용 대 수평 확산과 재활용의 기여를 보여줍니다. C가) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 ROIs의 형광 강도가 표준 강도로 꾸몄다 보여줍니다 값. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF 우물은 FRAP / 플립 dendrite에서 결정된 수용체 재활용으로 인해 과도 회복을 나타내며 ΔF비교는 &#39;FRAP 전용&#39;투자 수익 (ROI)에 돌기 축으로 월 GluK2의 측면 확산의 공헌을 평가합니다. 일시적 증가 cyclohexamide 치료의 결과로 가능한 수용체의 실행 아래에 해당하는 신호의 점진적 감소, 뒤에있다. 이후 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 플라즈마 막 단백질 인신 매매의 구성 요소를 시각화하기위한 혁신적인 전략을 설명합니다. 월 태그가 포함된 단백질과 기술을 photobleaching의 조합 방식은 플라즈마 막 삽입 이벤트가 평가하는 선별 수 있습니다. 지속적으로 복구하는 동안 지역 측면에서 막 단백질 photobleaching으로 &#39;FRAP-뒤집기&#39;방식은 형광 회복에 소낭성의 인신 매매의 공헌을 평가합니다. 이 소설의 접근법은 결정되는 일정한 상태에서 회복이 관찰되는 하위 구획의 개수 및 복구 (ΔF)의 진폭을 모두 활성화, 단백질 막 삽입 직접 녹음이 가능합니다. 또한, 플립와의없이 FRAP 비교가 계산되는 측면 확산에 대한 회복의 비율 귀책 수 있습니다. 또한, 동일한 실험에서, 측면 photobleached 지역에 인접하지 않은 photobleached dendrite의 지역이 될 수질적으로 복구하는 동안 평가,이 지역에서 관찰 형광 손실 dendrite 이러한 비 photobleached 세그먼트로 photobleached 수용체의 가로 확산으로 인한 것입니다. 이 선택적 photobleaching 프로토콜은 같은 (예를 들어, dendrites 또는 쪽이) 또는 병렬 FRAP를 실시하여 측방 확산 VS 삽입의 공헌을 평가하고 &#39;FRAP 정의된 subareas의 혈장 막에 excocytosis을 특성화와 같은 세포 인신 프로세스의 다양한 조사를 활용할 수 인접한 dendrites 함께 - 플립 &#39;프로토콜 (그림 3). 구체적인 지침이 제시되어있는 동안 확실히, 각 연구실에서 특정 표본과 장비에 따라 이미지 매개 변수를 최적화해야합니다. 중요한 것은 투자 수익 (ROI)의 모든 표면 수용체는 photobleached Z 축 초점 평면 독립하지만, 상당한 phototoxic 손상 또는 불특정 photobleaching없이 있어야합니다. 우리세포 소마에서이 프로토콜을하려 할 때 ERS는 상대적으로 낮은 산도 세포내 일반적으로 구획이 지역의 높은 배경 형광 결과의 높은 비율로,주의해야합니다. 또한, 이전에 선택적 photobleaching 실험을 시작으로, 방법을 다양 우리가이 기술을에 적용할 수있는 방법을 보여주면서 새로운 월 태그를 구축, 우리는 태그를 수용체의 초기 특성이 가장 먼저 애쉬 외 의해 설명된, 실시되는 조언 2. 전반적으로,이 방법은 근처에 실시간으로 평가될 수 있도록 혈장 막에 삽입 이벤트를 활성화, 표준 FRAP 프로토콜의 강력하고 다양한 적응이다.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 댓글 (옵션)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm 유리 coverslips</td&gt;<td&gt; VWR 인터내셔널</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 폴리-L-라이신</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td코트 coverslips에 borate 버퍼에&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal 중간</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21,103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2의 연결을 도금의 %와 매체를 먹이</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린의 스트렙토 마이신</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1의 연결을 도금의 %와 먹이 매체</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-글루타민</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25,030</td&gt;<td매체 도금 / 먹이에&gt; 2mM / 0.8mM</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td의 연결을 도금 미디어&gt; 10% 전용</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; pSIN ReP5 클로닝 벡터</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Sindbis 바이러스 생산을위한</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 메타 공촛점 시스템</td&gt;<td&gt; 자이스 혈구</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 이미지 J 소프트웨어</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; 오픈 액세스 소프트웨어. 여기에 설명된 모든 플러그인에서 구할 수 있습니다<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 photobleaching를 사용하여 평가

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"이러한 수용체 및 이온 채널 등&gt; 멤브레인 단백질이 높은 편광과 morphologically 복잡 뉴런에 적극적인 인신 매매를 겪다. 이 감독 인신 매매는 전달 유지하거나 시냅스 단백질을 제거하는 근본적인 중요하다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 슈퍼 황도 pHluorin (9월)는 광범위 플라즈마 막 단백질의 라이브 세포 이미징에 사용되고 있습니다 eGFP의 산도에 민감한 유도체이다<sup&gt; 1-2</sup&gt;. 낮은 산도에서, 9 월 중 protonation은 광자 흡수를 감소하고 형광 방출을 제거합니다. 대부분의 세포 내 인신 매매 사건이 9월 형광을 가릴되어 낮은 산도, 월 태그를 단백질의 형광 신호 구획에서 발생하는 것처럼 9월는 중성 pH의 세포외 환경에 노출되는 플라즈마 막에서 주로이다. 고강도 9월에서 조명하면, 모든 형광 염료와 같은 (photobleached) 레스터 photodamaged입니다<sup&gt; 3-5</sup&gt;. 중요한 것은, 낮은 산도는 광자 흡수에 꺼버리는 때문에, 오직 표면은 세포 내 9월는 고휘도 조명에 의해 영향을받지 반면 9월가 photobleached 수있는 표현<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"월 태그가 단백질&gt; FRAP (photobleaching 후 형광 복구)이 플라즈마 막에 단백질 역학을 평가하기위한 편리하고 강력한 기술입니다. fluorescently 태그가 포함된 단백질이 관심있는 영역에 photobleached하는 경우 (ROI) 형광의 회복은 표백 지역에 표백하지 않은 월 태그를 단백질의 움직임으로 인해 발생합니다. 이것에 의해 중 제공되지 않은 photobleached 수용체의 exocytosis에서 수평 확산 및 / 또는를 통해 발생할 수 있습니다<em&gt; 드 노보</em&gt; 합성이나 재활용 (그림을 참조하십시오. 1). 움직이기 힘드는과 모바일 단백질의 분율을 알아낼 수 있으며 diffusible 분수의 이동성과 속도론 같은 작용제 응용 프로그램 또는 같은 NMDA 또는 KCl 응용 프로그램으로의 연결을 활성화 자극 등의 기저 및 자극 상황에서 심문을하실 수 있습니다<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 선택적으로 exocytosis의 귀책 형광 반응의 회복을 시각화하기위한 photobleaching 기법을 설명합니다. 간단히, 투자 수익 (ROI)가 측면 지역의 표백 반복하여 짧은 회복 후, 다음, 표준 FRAP 프로토콜과 마찬가지로 한번 photobleached있다. 우리가 실험실에서 개발된이 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜은, 돌기 쪽이에서 AMPA 수용체 인신 매매를 특성화하기 위해 사용되었습니다<sup&gt; 10</sup&gt;, 그리고 세포 내 인신 매매 및 exocytosis를 평가하기위한 인신 매매 연구의 광범위한 적용이다.</p

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

수용체 및 이온 통로와 같은 막단백질은 고도로 분극화되어 있고 형태학적으로 복잡한 뉴런 내에서 활발한 트래픽킹(trafficking) 과정을 거칩니다. 이는...

이 절차의 전반적인 목표는 신경세포 단백질의 세포막 삽입을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배양된 해마 신경세포에 시누스 바이러스를 감염시켜 super ecliptic, Florin 또는 sep이 태그된 표적 단백질을 발현시킵니다. 그 다음, 관심 영역(ROI)을 광퇴색시킵니다.그런 다음 원래의 관심 영역이 형광 회복이 일어나는 동안 측면 세그먼트들을 반복적으로 광표백합니다. 마지막으로, 관심 영역의 형광 회복 정도를 분석합니다. 궁극적으로, 기존의 FRAP 실험을 응용한 이 방식은 세포막에서 표적 단백질의 엑소사이토시스(exocytosis) 이벤트 패턴을 보여주는 데 사용됩니다.표면 바이오티닐화(surface biotinylation)나 항체 피딩(antibody feeding)과 같은 기존 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 막 삽입 사건의 역동성을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법들은 엑소사이토시스(exocytosis) 사건이 어디서 어떻게 발생하는지를 밝혀 단백질 트래픽킹(protein trafficking)에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제가 처음 이 방법의 아이디어를 얻은 것은 항체 피딩의 대안을 찾던 중, 살아있는 세포 실험에서 스파인(spine)의 엑소사이토시스 사건을 연구하고자 했을 때였습니다. 우선, 생세포 실험 6~24시간 전에 배아 18일차(embryonic day 18) 쥐의 태아로부터 고밀도 해마 뉴런을 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 코팅된 유리 커버슬립 위에 배양하여 14~25일 동안 in vitro에서 배양합니다.관심 막 단백질을 인코딩하고 SUP ecliptic fluorine osep으로 표지된 symbis 바이러스를 세포에 형질도입합니다. 1mL의 조건화 배지가 담긴 커버슬립에 pseudo virion 포함 배지를 직접 첨가하고, 세포를 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 세포를 이미징하려면 이미징 시작 최소 20분 전에 100% 레이저 출력으로 zes axia vert LSM five 10 meta 공초점 현미경의 전원을 켭니다.이미징 중 전력 변동을 최소화하고 스테이지를 예열하기 위한 단계입니다. 현미경 준비가 완료되면 63배 대물렌즈를 선택한 다음, 커버슬립을 이미징 챔버로 옮기고 즉시 배양액을 예열된 세포 외 기록 용액으로 교체하십시오.챔버를 예열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 이 절차에서 가장 어려운 점은 기록 과정 동안 세포의 건강 상태가 손상되지 않도록 보장하는 것입니다. 본 프로토콜은 성공을 위해 광범위한 광퇴색(photo bleaching)이 필요하므로, 대규모 실험을 시작하기 전에 모든 이미징 파라미터를 최적화하고, 고화질 이미지보다는 빠른 획득 속도를 우선시하십시오.이미징 캡처 파라미터를 설정하기 위해, 관심 있는 재조합 단백질을 발현하는 뉴런을 찾아 초점을 맞춥니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 저전력의 488 nanometer 레이저를 사용하여 세포 전체를 스캔합니다.빠른 공칭 속도와 낮은 픽셀 해상도를 사용하십시오. 총 스캔 속도를 1초 미만으로 유지하십시오. 촬영할 가지돌기 부분을 선택하고 1.5에서 2.5배의 광학 줌을 사용하십시오.비특이적 광퇴색(photo bleaching)이 발생하는지 확인하기 위해 관심 영역이 포함된 프레임을 캡처하십시오. 기준 수상돌기(reference dendrites)로부터 측정값을 얻을 수 있도록 시야(field of view)에 여러 돌기가 포함되도록 하십시오. 범위 표시 팔레트(range indicator palette)를 사용하여 레이저 여기(excitation)를 최소화하면서 형광 신호는 최대화하되, 포화(saturation)는 제한되도록 이미징 파라미터를 조정하십시오.광자 수집을 극대화하기 위해 핀홀 직경을 크게 설정하는 것이 권장됩니다. 검출기 게인은 광퇴색 전의 초기 이미지에서 포화 픽셀이 10%를 넘지 않으면서도 작은 형광 증가량을 감지할 수 있을 만큼 충분히 강해야 합니다. 초점을 조절하여 중앙 초점면이 확보되도록 합니다.설정을 완료한 후, 실험의 사전 및 사후 회복 단계에서 사용할 수 있도록 이를 저장하십시오. 다음으로, 광퇴색 영역을 정의합니다. 초기 광퇴색을 위한 관심 영역(ROI)과 이후의 반복적 광퇴색 단계를 위한 측면 영역을 선택하십시오.초기 광퇴색(photo bleach) 단계에서는 중앙 ROI와 주변 ROI 모두를 광퇴색시킵니다. 반면 반복적인 광퇴색 단계에서는 주변 ROI만 선택합니다. 스캔 사이의 확산에 의한 회복이 일어나지 않도록 주변 영역을 충분히 넓게 설정하십시오.두 광탈색 ROI에 대해 표백 매개변수를 조정하십시오. 초기 광탈색은 광학 줌과 ROI의 부피에 따라 1~5회의 반복 횟수로 빠르게 수행되어야 합니다. 주변 영역의 경우, 광독성 손상 없이 지속적인 광탈색이 이루어지도록 레이저 여기 강도를 조정해야 합니다. 매개변수 설정이 완료되면, 먼저 낮은 레이저 출력으로 시간 지연 없이 3~10장의 사전 표백 기저 상태 이미지를 획득하여 가변 시간 경과 이미지 시퀀스로 FRA flip 실험을 수행하십시오.다음으로, 최대 레이저 출력으로 중앙 ROI를 1~5회 반복하여 광탈색합니다. 그 후, 광탈색 후 회복 이미지 3~10장을 획득합니다. 조사 대상 단백질의 회복 속도에 따라 일반적으로 1~5초의 시간 간격으로 이미지를 캡처하며, 주변 영역을 중간 레이저 출력으로 반복 광탈색합니다.마지막으로, 형광을 소광시키려면 세포 외 기록 용액을 pH 6으로 완충된 기록 용액으로 교체하고, 낮은 pH의 세포 내 저장소에 있는 단백질을 드러내려면 50 millimolar 염화암모늄이 첨가된 완충액을 사용하십시오. 편향된 결과를 방지하고 통계 분석이 가능하도록 각 재조합 단백질에 대해 최소 10~20개의 데이터 세트를 수집하며, 반복 실험 전반에 걸쳐 이미징 조건이 일정하게 유지되도록 하십시오. 이미지를 분석하려면 파일을 엽니다.Image J 소프트웨어를 사용하여, 시계열 동안 발생했을 수 있는 XY 평면의 미세한 변동을 보정하기 위해 스택을 정렬하십시오. zes 공초점 현미경으로 촬영한 이미지의 경우 stack reg 플러그인을 사용하고, LSM toolbox 플러그인을 사용하여 시간 값을 텍스트 파일로 출력한 뒤, 이 값들을 분석 스프레드시트에 가져와 형광 변동을 측정하십시오. FRA flip 실험 중에는 이미지 ROI manager 분석 도구를 사용하여 여러 ROI를 선택함으로써 광퇴색 세그먼트를 개별 픽셀 영역으로 나누십시오.다음으로, plot Z axis profile 명령을 사용하여 각 시간 지점에서의 픽셀당 평균 형광값을 측정합니다. 동일한 과정을 반복하여 형광이 없는 배경 영역의 평균 형광 강도를 측정합니다. 실험 노이즈를 제거하기 위해 각 시간 지점의 형광 강도에서 배경값을 빼서 정규화하고, 모든 값을 광퇴색 전의 평균 기선 측정값 또는 광퇴색 직후의 값으로 나눕니다.시간에 따라 플롯된 각 ROI의 회복 트레이스를 조사하여 유의미한 회복이 일어났는지 계산하십시오. ROI 내에서 광퇴색 회복 시퀀스의 처음 5~10개 측정값의 평균을 마지막 5~10개 측정값의 평균에서 뺌으로써 delta F를 계산합니다. 그런 다음 delta F의 통계적 유의성을 결정하고, 회복되는 ROI와 회복되지 않는 ROI를 특성화하여 엑소사이토시스의 패턴을 평가하십시오.이는 엑소사이토시스 핫스팟 또는 가시(spine) 대 간(shaft)의 회복을 나타냅니다. 이 영상은 SERP glue를 사용한 전형적인 frap flip 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다. 두 가지.수상돌기의 한 영역을 한 번 광퇴색시킨 후 1분간의 회복 시간을 둡니다. 그 후 파란색 화살표로 표시된 주변 영역들의 반복적인 광퇴색을 시작합니다. 빨간색 화살표는 형광 회복이 관찰되는 작은 관심 영역을 강조하며, 이는 화면의 오른쪽 패널에 확대되어 표시됩니다.회복 과정은 아래 그래프에 표시되어 있으며, 전체 형광 증가분은 delta F로 표시됩니다. 이 과정에서 관찰된 형광 증가의 원인은 수지상 돌기 축삭 내 glue A two의 삽입으로 볼 수 있습니다. 실험 종료 시점에서 나타나는 형광 강도의 급격한 변화는 낮은 pH 및 pH 7.4 염화암모늄 세척이 sep 형광 신호에 미치는 영향을 보여줍니다. 이 예시에서 뉴런은 SEP glue K two로 감염되었습니다.여기서는 시야 내에 여러 수지상돌기가 포함된 넓은 ROI를 광퇴색시킨 후, 단 하나의 수지상돌기만을 선택적으로 반복 광퇴색시켰습니다. 이 뉴런들은 단백질 합성을 차단하기 위해 이미징 전 2시간 동안 cyclo heximide로 처리되었습니다. 이에 따라, 각각 측정된 ROI에서의 형광 회복 정도를 통해, 표준 FRAP 수지상돌기에서의 측면 확산 및 재순환에 의한 회복 비율과 FRAP-flip 프로토콜이 적용된 수지상돌기에서의 재순환 단독에 의한 회복 비율을 확인할 수 있습니다.FRAP과 FRAP-flip 회복 곡선에서 얻은 delta F 값을 비교하면, 단백질 합성이 억제된 상태이므로 재활용(recycling)과 측방 확산(lateral diffusion)의 상대적 기여도를 추론할 수 있습니다. 회복 과정에서는 가용 수용체 풀이 고갈됨에 따라 신호가 이후에 다시 감소하는 양상을 보입니다. 이 영상을 시청한 후에는 뉴런에서 성공적인 이미징 실험을 설정, 수행 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 광퇴색 기술의 조합을 사용하여, 관심 단백질의 막 삽입 증거를 연구할 수 있습니다.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

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시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

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FRAP는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 교양 세포에있는 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 우리는 photobleaching 후 형광 복구 비율을 분석하여 GFP의 모바일 / 고정되어 분수를 조사. 본 연구에서는, FRAP는 hippocampal 뉴런의 쪽이에서 수행되었다.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

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교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

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