Name: 신경 응답을 녹음하고 추적하는 주사에 대한 깨어 마우스의 작성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 학습하세요 깨어 있는 마우스에서 단일 뉴런 반응을 기록하는 전기생리학 기법을 통해 신경과학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 마취제 영향 없이 뇌 기능을 정확히 연구할 수 있습니다.

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NSF 교부금 0,920,060, NIH 교부금 DC004395, NHMRC 교부금 1,009,482, 과학 및 의학 연구의 NSW Office 및 가넷 예스 러운와 로드니 윌리엄스 기념 재단 지원.

1. 헤드 - 구속 개요 <ol><li> 맞춤식 헤드 게시물을 조립하기 위해 십자가를 형성 스테인레스 스틸 막대 &quot;32분의 3 년 뚫고 구멍에 수직 스테인레스 스틸은 롤 핀&quot;1 / 16 삽입합니다. 헤드 게시물의 수직 조각 약 20 mm와 15mm에 대한 수평 십자가 조각이어야합니다. # 1-72 나사를 받아들이도록 수직 막대의 한쪽 끝을 누릅니다. (그림 1). </li><li> 수술 및 녹음 중에는 헤드 게시물 # 1-72 나사 (그림 2)의 맞춤식 황동 또는 알루미늄 장착 표시줄에 보안이됩니다. 장착 막대의 긴 조각 약 90 mm 길고 폭이 5-10밀리미터 있어야합니다. 헤드 게시물 4​​5 있길에 직각되는 긴 막대 해제 15mm 연장에 홈 인하로 힘드 네요. 장착 막대의 아래쪽에 작은 홈에 머리 회전, 헤드 게시물 nestles의 가로대을 방지합니다. </li><li> 에 장착 막대 후 맞춤 알루미늄 마운팅 블록에 부착된K (그림 3). 마운트 블록은 약 30mm X 30mm X 25mm입니다. 이 마운트 블록은 정면 게시물의 위치가 정확하게 중간선을 따라와 Bregma에 배치할 수 있도록 micromanipulator에 첨부되어 있습니다. 마운팅 블록 나사 함께 들으며 두 가지로 구성되어 있습니다. 블록의 컷 아웃이 장착 표시줄에 밀어하고 나사로 고정 할 수 있습니다. 장착 막대가 테이블 표면에 평행이다. 녹음하는 동안 사용자 정의 stereotaxic 프레임 (그림 4)에서 막대를 확보. stereotax는 수술 중에 장착 블록에서 같은 위치에 막대를 탑재할 수 있도록 설계되었습니다. 이 배열은 마우스가 항상 실험적인 세션에 걸쳐 stereotaxic 프레임에 정렬된다는 보장합니다. </li><li> 45 °에서 약 1 밀리미터 구부러진으로 약 5 밀리미터 길이로 텅스텐 막대 (직경 0.010 &quot;)를 잘라.이 막대가 땅에 핀 (그림 1)로서의 역할을합니다. </li></ol> 2. Stereotaxic 알Craniotomy위한 ignment 참고 : 모든 절차는 아래 표준 무균 수술 테크닉을 따라 명시된와 워싱턴 주립 대학 동물 관리 및 사용위원회와 Garvan 연구소의 동물 윤리위원회의 승인되었습니다. <ol><li> 5% isoflurane으로 유도 챔버에 배치하여 마우스를 마취. 꼬리 및 / 또는 발가락 공략하기 위해 반응의 부족 동물 완전히 anesthetized임을 보장합니다. </li><li> 마우스 어댑터 (Stoelting)에 장착된 쥐 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 마우스를 올바르게 동양에, 물린 막대의 구멍 안쪽에 치아를 배치하고 아늑한되도록 코 클램프를 조입니다. 더할 나위없이 가능한 물린 바, 코를 클램프에서 마우스를 놓으십시오. 마우스의 코 위에 라텍스 장갑의 조각으로 만든 얼굴 마스크를 놓고 마우스의 호흡 속도가 약 1 숨결 / 초까지 5 % isoflurane 보관하십시오. 1.5 isoflurane를 켜고 - 2.0 %를. T를 사용하여 머리를 고정그는 귀, 바, 아니 찔린 고막에 신중하다고. 바 아늑한 있지만 귀 운하에 너무 깊이 침투해서는 안됩니다. </li><li> 마우스 밑에 가열 패드를 놓습니다. </li><li> 말리는에서 눈을 막기 위해 안과 연고를 바릅니다. </li><li> 최대 작은 면도기이나 미세 포인트 가위로 눈을에 귀 사이에서 두피 면도. </li><li> 청소 및 알코올 다음 chlor-hexidine (또는 betadine) 스크럽 3 회 반복 헹굼에게 함께 지울하여 두피를 소독. </li><li> 두개골의 맨 위에 피부를 제거하려면 머리 뒤쪽에서 눈을에 중간선을 따라 절개를합니다. </li><li> 메스로 절개의 가장자리에 골막을 다쳤어요. 필요한 경우 (실험 대상에 따라), 신중하게 근육이 출혈을 최소화하기 위해 fascicles 따라 철거 수 있도록 집게와 목 뒤쪽 근육을 접어야합니다. 수분을 최소화하고 두개골을 통해 이동으로부터 피부를 방지하기 위해 두피 조직 아래 gelfoam을 적용합니다. </li><li> 솜 스쳐지나 작은 주걱으로 두개골 표면은 두개골 랜드마크의 시각화을 향상시키기 위해 이소 프로필 알코올로 moistened 건조합니다. </li><li> 표준 stereotaxic 좌표 13 두개골을 맞춥니다. 전극 홀더에 훌륭한 포인트 프로브를 삽입하고 stereotaxic micromanipulator에 첨부해 주시기 바랍니다. 날카롭게 금속 봉이 목적 (그림 5)을 위해 잘 작동합니다. </li><li> 두개골에 Bregma (그림 5A)와 람다 (그림 5B)를 식별 포인트를 사용하십시오. 각 지역에 대한 측면 - 중간 좌표는 더 이상 50 μm의에 의해 차이가 있는지 확인,이 점 사이 - 및 - 앞뒤 프로브를 이동합니다. 신중 laterally 머리와 귀, 바를 이동하고, 귀, 바를 retightening, 귀, 바를 풀어하여 필요에 따라 머리를 재지정. </li><li> 각 위치에 지느러미-복부 높이가 더 이상 50 μm의에 의해 차이가 있는지 확인합니다. 코 - 클램프의 높이를 조절, 즉, 귀, 막대의 축 주위 두개골을 회전합니다두개골 필요한 경우의 높낮이를 날려합니다. 귀, 막대의 높이 또한 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> Bregma에 상대적으로 관심의 대상 (그림 5C)의 좌표를 식별하기 위해 아틀라스 13 사용합니다. 대상 위에있는 해골 마크 (예를 들어, &quot;x&quot;를 또는 사각형의 점이 곳곳에 인도 잉크 사용) craniotomy는 (그림 5D) 이루어집니다 어디. </li></ol> 3. 헤드 - 게시물과 접지 핀 설치 <ol><li> 두개골을 청소 에칭 젤을 사용하십시오. 표면 (10 초) 동안 에칭 젤을 씻어하고 확산하기 위해 작은 주걱을 사용합니다. 물로 씻고 완전히 건조시키십시오. 작은 주걱을 사용하여 두개골 표면에 치과용 시멘트에 대한 입문서를 적용합니다. 새로운 작은 주걱으로 접착제를 펴. 자외선 - 총 (1주기)과 접착제를 치료. </li><li> 대상 사이트에 대한 말초은 접지 핀의 위치를​​ 선택합니다. 조심스럽게 지상 P의 짧은 끝이 그냥 통과 충분한 # 65 miniblade 메스의 팁을 사용하여 두개골에 작은 구멍을 뚫다입력하고 meninges 따라 쉬어야합니다. 그것이 Bregma하고 (그림 6A) 헤드 게시물 미래에서 떨어져 포인팅되도록 접지 핀이 지향이어야합니다. </li><li> 장착 막대 헤드 게시물을 확보해서 차단하고 micromanipulator에 첨부해 주시기 바랍니다. 가로, 세로, 높이로 micromanipulator 이동하여 바로 두개골 (그림 6B)를 만지고, Bregma 위에 정면 게시물을 배치. 헤드 게시물의 기준은 두개골에 평평하게 누워 있습니다. </li><li> 해부 프로브 사용하여 헤드 게시물과 접지 핀 (그림 6C) 주위에 치과 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. 두개골의 좋은 접촉을 보장하기 위해 시멘트를 누르십시오. 참고 : 너무 많은 시멘트를 사용하지하거나 균일하게 강화하지 않을 마십시오. 자외선 - 총 (여러 각도 3-4 사이클)와 시멘트를 치료. </li><li> 시멘트의 두 번째 단계를 적용하고 정면 포스트 주위에 기지를 구축하고 헤드 게시물 홈 (그림 6D)을 포괄합니다. </li></ol> 4. Craniotomy <ol><li> 부분적으로 프라이머로 덮여됩니다 craniotomy 참조 부호를 찾습니다. 본 사이트 주위 × 3 밀리미터 광장을 3mm를 표시하고 감도를 감소하고 출혈을 최소화하기 위해 lidocaine의 방울을 적용하기 # 65 메스를 사용하십시오. </li><li> (그림 7A) 뼈를 통해 두뇌로 침입하지 않도록주의되는 사각형의 각 측면 (많은 10)에 복수의 점수를 확인하십시오. </li><li> 뼈 플랩은 자유롭게된다되면 (그림 7B) 경질의 mater 그대로두고, 그것을 캐내려고 메스의 팁을 사용합니다. </li><li> 뼈 왁스와 함께 표지. </li></ol> 5. 이후 수술 <ol><li> 가스 마취를 끄고 stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 상처 주위에 센세이션을 달랠 때도에 노출 피부 주위 Lidocaine의 연고를 적용하는 솜 스쳐지나 작은 주걱을 사용하십시오. 노출된 피부에 Neosporin 적용할 수있는 또 다른 솜 스쳐지나 작은 주걱을 사용하십시오. 케토프로펜를 (개인 IACUC 수의사의 취향을 바탕으로 5 밀리그램 / kg 메신저 또는 IP)로 주사수술 후 진통제. 마우스는 일반적으로 최대 가스 정지의 분 이내에 이동됩니다. </li><li> 따뜻한 케이지와 모니터의 장소는 마우스가 동물의 주거로 돌아갈 준비가 될 때까지. </li><li> 그것이 수술로부터 복구되었습니다 후에 동물은 하루에 최소 한번에 확인하여야한다. 가난한 식생활 및 / 또는 음주와 마음이 내키지 않는 행동의 흔적을보세요. 고통이 의심되면 완화 전까지는 24 시간마다 (동일 선량 수술 끝에 등) 케토프로펜 제공합니다. Lidocaine은 로컬 동물 긁적 경우 상처에 적용하거나 불편의 흔적을 보여줍 수 있습니다. 동물은 일반적으로 합병증이나 통증없이 수술에서 회복. </li></ol> 6. 녹화 및 염료 분사 <ol><li> 녹음을 위해 마우스를 사용하기 전에 헤드 게시물 수술 후 최소한 1 일 이상 기다립니다. </li><li> 거품 - 접근 금지 장치 플레이스 마우스는 마우스의 시체에 맞는. 마우스는 이미으로써의 불안을 줄이고,이 장치에 맞게 조정되었습니다. 일반적인 적응은수술과 실험 이전의 이유 후 약 일주일 동안 매일 마우스를 처리하기 위해, 1~5분 위해 발포 장치에 마우스를 놓습니다. stereotaxic 프레임 (그림 4)에서 장치를 일시 중지합니다. </li><li> 지금 stereotaxic 프레임 (그림 4)에 고정 장착 표시줄에 정면 게시물 보안. </li><li> 뭉툭한 22-게이지 피하 주사 바늘 팁 때문에 종료 와이어와 접지 핀에 연결합니다. </li><li> craniotomy를 통해 뼈 왁스를 제거합니다. miniblade 메스의 팁을 사용하여 필요할 경우 경질을 제거합니다. </li><li> 적절한 stereotaxic 위치에 전극을 증가하고 (그림 8) 녹음을 시작합니다. 오직 electrophysiological 음반의 경우 전극의 다양한 사용하실 수 있습니다. 전극의 선택은 필요한 레코딩의 위치와 종류에 따라 다릅니다. 깨어 마우스 레코딩을위한 전극의 선택은 연구자가 anesthetized 마우스에 사용하는 것과 동일합니다. 과 결합 electrophysiological 녹음을 위해염료 / 추적기 주사, micropipette 전극 10 사용됩니다. micropipette은 그것이 iontophoretically electrophysiological 실험의 끝 부분에 주입 수 있도록 선택의 염료 / 트레 이서들로 가득 차 있습니다. Multibarrel 전극은 pharmacological 조작이 이루어질 수 있도록도 사용할 수 있습니다. multibarrel 전극은 단일 녹음 micropipette (그림 8)에 마운트됩니다. 이 기술은 문학에서 표준이며 anesthetized 대 깨어 레코딩에 대해 다른 않습니다. </li><li> 녹음은 3-4 연속적인 일 동안 4~5시간 위해 만들 수 있습니다. </li><li> 녹화 세션이 끝날 때, 염료 / 추적기는 주입 수 있습니다. 두뇌에는 통증 수용체가 없기 때문에 머리를 염색하거나 추적기의 iontophoretic 주사 불편을 일으킬 가능성이다. 주사는 만들 것이다 지역의 electrophysiological 응답 특성이 특징 일단 그러나, 동물 isoflurane F와 anesthetized 될 수또는 주사. 이것은 잠재적인 원치 않는 감각을 제거합니다. 염료 / 추적기가 micropipette에 이미 있기 때문에 활성 및 접지 리드는 iontophoretically 염료 / 추적기 삽입할 현재 발전기로 electrophysiological 녹화에서 설정 전환하실 수 있습니다. 전극의 염료 / 추적을위한 적절한 프로토콜을 사용합니다. headpost 구속 및 신체 구속으로부터 동물을 제거하고 홈 케이지로 돌아갑니다. </li><li> 실험이 끝나면, 안락사 및 사출 사이트 및 라벨링을 복구하기위한 조직 처리를위한 적절한 절차를 따르십시오. </li></ol> 7. 대표 결과 헤드 게시물의 성공적인 설치는 실험자가 여러 일 동안 unanesthetized, 깨어있는 마우스에서 단일 및 multiunit 답변을 녹화할 수 있습니다. 규제 시스템은 뇌의 한 뉴런의 안정 electrophysiological 녹음을 허용합니다. 하나의 단위와 강력한 대응 전술이 우수한 절연O의 자극은 마우스 열등 colliculus (; 9B 그림, 하루에 두세 그림 9A, 첫날)의 예를 들어, 여러 일 동안 같은 뇌 구조에서 기록될 수 있습니다. 좋은 헤드 사후 설치로 각 마우스는 일관되게 stereotaxic기구 및 특정 뇌 핵의 안정적인 지방화 결과 마우스 stereotaxic 아틀라스, 13로 정렬됩니다. 이것은 안정적인 지역화 여러 녹화 일 후에 특정 구조물에 염료 및 추적기의 주입을 허용합니다. 예를 들어, 청각 brainstem에 청각 midbrain에서 전망치를 내림차순 평가하기 위해, electrophysiologically 주사의 사이트에의 연결 응답 특성을 식별 후 마우스 열등 colliculus (그림 10A)에 주입 수 dextran 아민을 (chromagen와 같은 시각을 사용 diaminobenzidine) biotinylated (그림. 10A에서 신경 세포는 51 kHz에서 중 최고의 주파수로 녹음되었다), 그리고 조직 처리 후,contralateral 지느러미 와우각 핵에서 nterograde 라벨링은 시각과 (그림 10B) 꾸몄다되어 있습니다. 높은 해상도에서 Photomicrographs도 anterogradely 분류 axons 및 터미널 (그림 10C)를 볼 얻을 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> 1 그림. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> 그림 2. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> 그림 3. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> 4 그림. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> 그림 5. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; 그림 6. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> 그림 7. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> 그림 8. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> 9 그림. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> 10 그림.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li>
<li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li>
<li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li>
<li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li>
<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

마우스의 electrophysiological 및 neuroanatomical 실험을위한 헤드 게시물 구속 시스템의 장점은 실험 마취 약물로 인한 잠재적인 응답 오염을 제거, unanesthetized, 깨어있는 생쥐로 수행할 수있다는 것입니다. 또한, 세트까지보다 효율적인 동물 사용할 수 있도록 여러 일 동안 사용할 수 있습니다. 헤드 게시물에 대한 대부분의 구성 요소는 재고품이 가능합니다. 만이 헤드 게시물과 장착 기기는 맞춤이며, 건설 비교적 간단하고 재사용이다 둘 다. 기계 공장은 기관에서 사용할 수없는 경우, 연구자는 가능성이 사용할 수 <a href="http://www.emachineshop.com/" target="_blank">http://www.emachineshop.com/</a> 필요한 구성 요소를 조작하는 걸. 능숙 수술 기술이 필요합니다. 외과 의사가 최선의 현미경 아래에서 수행하고 일부는 미세 수술...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 치과 시멘트 이전에 두개골을 청소를위한 에칭 겔 </td><td> 헨리 Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 1.2 ML의 주사기와 12/pk </td></tr><tr><td> 치과 시멘트에 대한 입문서 </td><td> 커 Optibond </td><td> 25,881 </td><td> 8 ML 병 </td></tr><tr><td> 치과 용 시멘트 접착제 </td><td> 커 Optibond </td><td> 25,882 </td><td> 8 ML 병 </td></tr><tr><td> 치과 시멘트에 대한 Applicators </td><td> 커 Optibond </td><td> 24,680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> 치과 시멘트 </td><td> 카리스마, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> 4gm 주사기 리필 </td></tr><tr><td> 텅스텐로드 (접지 핀) </td><td> 오전 시스템 </TD&gt; <td> 717,200 </td><td> 0.010 &quot;직경 </td></tr><tr><td> 경제 자외선 경화 라이트 </td><td> 헨리 Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> 헤드 포스트 </td><td> 자체 내장 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마운팅 바 </td><td> 자체 내장 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마운팅 블록 </td><td> 자체 내장 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic 프레임 </td><td> 데이비드 Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스와 신생아 쥐 아답터 </td><td> Stoelting </td><td> 51,625 </td><td></td></tr><tr><td> 등온 패드를 Deltaphase </td><td> Braintree 과학 주식 회사 </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

신경 응답을 녹음하고 추적하는 주사에 대한 깨어 마우스의 작성

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

그것은 잘 마취가 두뇌의 여러 지역에서 신경 반응 속성을 바꿀지도 모르겠어 것으로 알려져 있습니다. 13. 청각 시스템에서 임계값, 주파수 특이성 및 억제 sidebands 포함한 brainstem의 뉴런의 근본적인 응답 특성 1-2 마취하에 상당한 방법으로 변경됩니다. 이러한 관찰 physiologists은 마취의 오염 영향없이 하나의 뉴런에서 녹화할 수있는 방법을 모색하라는 메시지가 나타납니다. 한 결과는 brainstem 완전히 midbrain 4의 수준에서 그었습니다 decerebrate 준비했습니다. 이 준비의 단점 무서운 수술, forebrain의 전망을 내림차순의 철폐, 그리고 midbrain 위의 구조를 조사하는 감각 자극을 사용하는 무능력이다. 다른 전략은 동물이 깨어 및 / 또는 5,6를 행동 중에 하나의 뉴런과 multiunit 클러스터에서 녹음 만성 전극 배열을 이식해왔다 </suP&gt;. 이 기술은 그러나 첫번째 electrophysiologically 뇌 구조를 특성화 후 추적 염료를 주입과 호환되지 않습니다. 하나의 뉴런에서 electrophysiological 응답 특성을 기록하면서 anesthetics와 신경 반응 등록 정보를 변경하지 않도록하기 위해, 우리는 오랫동안 마우스를 10-12로 박쥐 7-9에서 사용 헤드 구속 기법을 적응했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 unanesthetized 마우스에서 며칠 동안 electrophysiological 레코딩을 수행할 수 있습니다. 레코딩 세션의 끝에, 우리는 다음 전극 위치 및 녹음 사이트를 재구성하거나 및 녹화 loci의 경로가 결정 수 있도록 추적기 주입하는 염료를 주입하실 수 있습니다. 이 방법은 사용 anesthetics없이 여러 일 동안 잘 격리 단일 신경 세포 녹음을 허용합니다.

의 연결 응답 Electrophysiological 특성은 뇌의 기능을 이해와 경로 추적을위한 염료의 위치를​​지도 중요합니다. 그러나 많은 연구 anesthetized 동물에서 수행됩니다. anesthetics없이 뇌 기능을 이해하기 위해서, 우리의 연결 응답 특성을 기록하고 깨어있는 마우스에 염료를 주입하는 방법을 개발했습니다.

마취가 뇌의 다양한 영역에서 신경 반응 특성을 변화시킨다는 것은 잘 알려져 있습니다.13. 청각 시스템에서 기본적인 반응...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 깨어 있는 마우스의 단일 뉴런으로부터 반응을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이소플루레인 흡입법으로 마우스에 마취를 시행하고, 설치류 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 마우스를 고정한 후 두개골을 노출시킵니다. 두 번째 단계에서는 정위 좌표를 사용하여 관심 뇌 영역의 위치를 찾고, 이후의 개두술을 위해 해당 영역을 표시합니다.다음으로, 맞춤 제작된 헤드 포스트를 두개골에 장착하고, 이 헤드 포스트를 정위 고정 장치의 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마운팅 바에 배치합니다. 마지막 단계는 전극을 뇌에 삽입할 수 있도록 개두술을 수행하는 것입니다. 마우스가 수술로부터 회복되면, 마우스를 폼 블록에 고정합니다.헤드 포스트를 마운팅 바에 다시 끼워 맞춤 제작된 정위 고정 장치에 부착하며, 이때 마이크로 피펫 전극을 뇌 속으로 삽입할 수 있습니다. 이 절차를 통해 단일 단위의 분리가 가능해집니다. 동일한 뇌 구조에서 여러 날에 걸쳐 자극에 대한 강한 반응을 기록할 수 있으며, 기록된 트레이스를 통해 생리학적으로 확인된 영역으로의 상행 또는 하행 투사를 조사하거나 마취제로 인해 반응이 영향을 받지 않는 상태에서 분석할 수 있습니다.이 기술의 기존 방법 대비 주요 장점은 뉴런의 반응 특성이 마취제에 의해 영향을 받지 않는다는 것입니다. 이 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Zachary Mako가 진행하겠습니다. 머리 고정 장치를 준비하려면, 먼저 15 millimeter, 3/32 inch 스테인리스 스틸 로드에 구멍을 뚫어 맞춤형 헤드 포스트를 조립하십시오. 그런 다음 20 millimeter 스테인리스 스틸 롤 핀을 구멍에 수직으로 삽입하십시오.여기에 표시된 것처럼, 수직봉의 한쪽 끝에 1번 72 나사를 끼울 수 있도록 탭을 내어 십자형으로 만듭니다. 다음으로, 장착 바를 준비합니다. 이 장치는 길이 약 90mm, 너비 5~10mm의 긴 황동 또는 알루미늄 바와, 긴 바의 끝부분에 45도 각도로 부착된 15mm 길이의 짧은 바로 구성됩니다.더 짧은 막대에는 바닥면에 하나의 홈이 파여 있고 너비 방향으로 더 짧은 홈이 하나 더 있으며, 헤드 포스트를 이 홈들에 맞추고 가로대를 더 짧은 홈에 안착시킵니다. 마운팅 블록은 두 개의 알루미늄 조각을 나사로 결합하여 약 30 millimeters x 30 millimeters x 25 millimeters 크기의 블록으로 형성하며, 마운팅 바를 고정하기 위한 컷아웃이 있습니다. 마운팅 바를 마운팅 블록의 컷아웃에 테이블 표면과 평행하게 삽입하십시오. 헤드 포스트의 위치를 정중선과 brima를 따라 정확하게 배치할 수 있도록 마운팅 블록을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.마지막으로 0.01 inch 직경의 텅스텐 막대를 약 5mm 길이로 자르고, 끝부분 약 1mm를 45도로 구부립니다. 이 막대는 접지 핀으로 사용됩니다. 5% isoflurane이 들어 있는 유도 챔버에 동물을 넣은 후, 발가락 집기 테스트를 통해 반응이 없는지 확인하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.마우스가 완전히 마취되면, 먼저 치아를 바이트 바(bite bar)의 구멍 안에 넣고 코 클램프를 딱 맞을 때까지 부드럽게 조여 마우스 어댑터가 장착된 설치류 정위 고정 장치(stereotactic frame)에 배치합니다. 동물이 마취 상태를 유지하도록 하기 위해, 라텍스 장갑 조각으로 만든 안면 마스크를 마우스의 코 위에 씌우고 호흡수가 초당 약 1회 정도가 될 때까지 5% isof fluorine을 유지합니다.그 후, isoflurane 농도를 1.5~2%로 낮춥니다. 이제 이어 바(ear bars)를 각 외이도에 조심스럽게 삽입하여 머리를 고정합니다. 고막을 천공하지 않도록 주의하면서, 이어 바가 너무 깊게 들어가지 않도록 주의하되 단단히 고정되게 맞춥니다. 마우스 아래에 겔 히팅 패드를 놓습니다.그 다음, 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 부드럽게 도포합니다. 소형 이발기나 끝이 뾰족한 가위를 사용하십시오. 귀 사이부터 눈까지의 털을 제거합니다.이제 클로르헥시딘(chlorhexidine) 또는 베타딘(Betadine) 스크럽으로 두피를 세척 및 소독한 후, 알코올 린스를 3회 반복합니다. 머리 뒷부분부터 눈까지 정중선을 따라 절개합니다. 필요한 경우 메스로 절개선 가장자리까지 골막을 긁어냅니다.포셉을 사용하여 목 뒷부분의 근육 조직을 조심스럽게 젖히되, 출혈을 최소화하기 위해 근육이 결을 따라 찢어지도록 합니다. 두피 조직 아래에 겔 폼(gel foam)을 적용하여 수분을 최소화하고 피부가 두개골 위에서 움직이는 것을 방지합니다. 그 후, 면봉에 이소프로필 알코올을 묻혀 두개골 표면을 건조시킴으로써 두개골의 지표(landmark) 시각화를 향상시킵니다.동물 준비가 완료되면, 연마된 금속 막대와 같은 정밀한 포인트 프로브를 전극 홀더에 삽입하고 이를 정위 고정 마이크로 매니퓰레이터(stereotaxic micro manipulator)에 부착합니다. 브레그마(bregma)와 람다(Lambda) 사이에서 프로브를 앞뒤로 움직여, 각 위치의 외측-내측 좌표 차이가 50 µm를 초과하지 않도록 확인합니다.필요에 따라 이어 바(ear bar)를 사용하여 머리 위치를 조심스럽게 조정합니다. Bgma와 Lambda에서의 배측-복측 높이 차이가 50 microns 이하인지 확인합니다. 필요한 경우, 두개골의 피치(pitch)를 수평으로 맞추기 위해 코 클램프(nose clamp)의 높이를 조정하며, 이어 바의 높이 또한 조정해야 할 수 있습니다.마우스 뇌 지도를 사용하여 bgma 기준 관심 대상의 좌표를 확인합니다. 인디아 잉크를 사용하여 개두술을 시행할 대상 상단의 두개골 부위를 표시합니다. 먼저, 두개골 표면에 치과용 에칭 젤을 바르고 약 10초 동안 문질러 세척합니다.그런 다음 물로 세척하고 완전히 건조시킵니다. 이어서 두개골 표면에 치과용 시멘트용 접착 프라이머를 도포합니다. 어플리케이터를 사용하여 도포한 후, 새 어플리케이터를 사용하여 접착제를 펴 바르고 UV 광중합기를 이용해 한 사이클 동안 접착제를 경화시킵니다.표적 부위에서 원위쪽에 위치한 지점을 확인합니다. 접지 핀을 설치하기 위해, 65번 미니 블레이드 메스의 팁을 사용하여 두개골에 조심스럽게 작은 구멍을 뚫습니다. 이때 구멍의 크기는 접지 핀의 짧은 끝부분이 들어갈 수 있을 만큼 충분히 넓어야 합니다.접지 핀을 뇌막 위에 놓이도록 삽입하십시오. 핀이 bgma 및 헤드 포스트 부착 부위의 반대 방향을 향하도록 방향을 맞춥니다. 이제 마이크로 매니퓰레이터를 이동시켜 헤드 포스트가 bgma 위에 위치하고 두개골에 살짝 닿게 하십시오.헤드 포스트의 바닥 부분이 두개골 위에 평평하게 놓여야 합니다. 그런 다음 해부용 프로브를 사용하여 헤드 포스트와 그라운드 핀 주변에 소량의 치과용 시멘트를 도포합니다. 시멘트를 눌러 두개골과 잘 밀착되도록 합니다.그 다음 UV 라이트 건으로 3~4회 사이클 동안 경화시킵니다. 마지막으로, 헤드 포스트 주변의 베이스를 보강하기 위해 시멘트를 2차로 도포하고 헤드 포스트의 홈을 덮은 뒤 경화시킵니다. 그 전에, 프라이머에 의해 부분적으로 가려져 있을 개두술 기준 표시를 먼저 찾으십시오.그런 다음 65번 미니 블레이드 메스로 해당 부위 주변에 3 mm x 3 mm 크기의 정사각형 영역을 표시합니다. 감각을 낮추기 위해 리도카인 용액 한 방울을 도포합니다. 이제 정사각형의 각 면에 여러 번 절개선을 긋되, 뼈를 뚫고 뇌까지 절단되지 않도록 주의하십시오.골편이 헐거워지면 메스 끝을 이용해 경막이 손상되지 않도록 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 해당 부위를 본 왁스로 덮어줍니다. 수술이 완료되면 이소플루란을 끄고 마우스를 정위 고정틀에서 분리합니다.노출된 피부에 lidocaine을 도포한 후 neo spore를 바르고, 수의사가 지시한 대로 수술 후 진통제를 투여한 뒤 마우스를 홈 케이지로 옮깁니다. 24시간 후, 해당 마우스를 전기생리학적 기록에 사용할 수 있습니다. 이 그림은 헤드 포스트가 성공적으로 설치되면 실험자가 깨어 있는 마우스로부터 며칠 동안 단일 및 다중 유닛 반응을 기록할 수 있음을 보여줍니다.구속 시스템을 통해 뇌 내 단일 뉴런의 안정적인 전기생리학적 기록이 가능합니다. 동일한 뇌 구조에서 며칠에 걸쳐 단일 유닛의 우수한 분리 및 자극에 대한 강한 반응을 기록할 수 있습니다. 예를 들어, 2일 동안 마우스의 하구(inferior colliculus)에서 측정하였을 때, 왼쪽 패널은 1일 차에 얻은 기록을, 오른쪽 패널은 2일 차의 기록을 보여주며, 이를 통해 청각 중뇌에서 청각 뇌줄기로 내려가는 투사 경로를 평가할 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 주입 부위에서 뉴런의 반응 특성을 전기생리학적으로 확인한 후, 조직 처리 과정을 거쳐 Dino Benadine을 발색제로 사용하여 시각화한 biotinylated dextran amine을 마우스 하구에 주입할 수 있습니다.반대측 등측 와우핵의 전방향 표지는 여기에서 시연된 바와 같이 시각화하고 도식화할 수 있습니다. 더 높은 해상도의 현미경 사진을 통해 전방향으로 표지된 축삭과 말단을 관찰할 수도 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 깨어 있는 생쥐에서 개별 뉴런의 반응 특성을 기록하고 신경해부학적 연구를 위해 염료나 추적자를 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 준비 과정은 신경 응답 특성에 미치는 마취제의 영향을 제거하며, 동일한 동물로 며칠에 걸쳐 실험을 수행할 수 있게 합니다. 이 절차의 핵심은 헤드 포스트를 두개골에 단단히 고정하고 마우스를 잘 구속하는 것입니다. 본 영상에서는 청각 시스템의 개별 뉴런에서 기록하기 위해 이 절차를 사용하는 방법을 보여주었으나, 이 기술을 사용하여 뇌의 다른 영역도 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 청각 자극을 처리하는 마우스 뇌의 특정 영역에서 신경 세포 활동에 대한 연구를 보여줍니다. 이 기술은 억제성 신경 전달 차단제를 적용하고 약물이 국소 뇌 영역에 적용되기 전과 후의 청각 자극에 대한 신경 반응을 비교하는 것을 포함합니다.

억제성 신경전달물질 차단제가 있는 상태에서 깨어 있는 쥐의 청각 신경 반응 조사

이 비디오는 전극 어셈블리를 마우스의 뇌에 이식하는 기술을 보여줍니다. 어셈블리에는 해마의 활동을 기록하기 위한 양극성 전극과 소뇌에서 기준선 활동을 얻기 위한 참조 전극이 포함되어 있습니다. 마취된 마우스를 입체성 프레임에 놓고 전극 어셈블리를 표적 뇌 영역에 이식합니다. 그런 다음 동물은 전기 생리학적 기록을 수행하기 전에 회복하도록 허용합니다.

전기생리학적 기록을 위해 마우스 뇌에 전극 어셈블리를 이식합니다.

출처: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-Arrest Rats(경보, 머리 구속 쥐의 피질하 뇌 구조 내 단일 뉴런의 모니터링 및 국소화). J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 구속되고 깨어 있는 쥐의 병치세포 기록 및 염색 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런의 신호를 기록하고 염료를 주입하여 기록 부위의 위치를 정확하게 파악하는 작업이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 신경 활동을 뇌의 해부학적 구조에 정확하게 매핑할 수 있습니다.

깨어 있는 쥐의 신경 활동을 정확하게 매핑하기 위한 Juxtacellular Recording and Staining 

자유롭게 행동하는 쥐에서 뇌파(EEG)와 근전도(EMG)를 기록하는 것은 행동 및 생리학을 수면 및 각성과 연관시키는 중요한 단계입니다. 본 명세서에 기술된 실험 프로토콜은 마우스에서 EEG 및 EMG 기록을 획득하기 위한 케이블-기반 시스템을 제공한다.

마우스 절전 모드를 측정 등사 기록 절차

깨어 있는 쥐의 기록 부위 부근에서 세포 외 신경 활동을 동시에 기록하고 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극 구성 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 뉴런에 대한 추정 국소 시냅스 입력값을 자세히 분석할 수 있습니다.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

이 프로토콜은 머리가 고정된 마우스의 뇌간에서 생체 내 고밀도 단일 뉴런 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 전신 마취 전과 전신 마취 중에 REM(Rapid Eye Movement) 수면 중에 비활성화된 뇌간 영역인 복외측 수관 주위 회색에서 뉴런의 활동 전위 발화를 측정하기 위해 배포됩니다.

Head-Fixed Mice의 뇌간에서 발생한 급성 단일 단위 다중 전극 기록

학습하세요 깨어 있는 마우스에서 단일 뉴런 반응을 기록하는 전기생리학 기법을 통해 신경과학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 마취제 영향 없이 뇌 기능을 정확히 연구할 수 있습니다.

신경 응답을 녹음하고 추적하는 주사에 대한 깨어 마우스의 작성

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