세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 기질 섬유아세포가 상피 세포 생물학에 미치는 영향을 분석하기 위해 3차원 혼합 세포 조직 배양에서 상피 세포를 추출하는 것입니다. 이것은 먼저 3차원 혼합 세포 스테로이드 공동 배양을 확립함으로써 달성됩니다. 그런 다음 sphe는 공동 배양 후 상피 세포를 분리하기 위해 매트릭스 배양에서 분리됩니다.

다음 단계는 분석 준비가 될 때까지 공동 배양 후 상피 세포를 계대배양하는 것입니다. 궁극적으로, 3차원 배양에서 섬유아세포에 대한 노출이 상피 세포 행동에 미치는 영향은 배양의 현미경 이미징과 공동 배양 후 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 여기에 나타난 바와 같이 매트릭스 침입 및 Transwell 이동의 형광 이미징과 같은 상피 세포, 절차를 시연하는 것은 전날 내 실험실의 연구원인 Quin이 공동 배양을 확립할 것입니다.

냉동실에서 마트레 젤을 꺼내 섭씨 4도의 냉장고에서 얼음에 올려 하룻밤 동안 해동합니다. 실험 당일, matra gel과 혼합하기 최소 1시간 전에 배양 배지를 얼음 위에 놓습니다. 해동된 마트라 젤을 희석합니다.

공동 배양에 필요한 얼음 차가운 H Mac 배지 부피의 절반을 얼음 위의 멸균 튜브에 추가합니다. 그런 다음 동일한 총 해동된 마트리겔의 절반 부피를 튜브에 추가하여 튜브를 얼음 위에 유지하면서 일대일 희석을 달성합니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 마트라 겔 배지 혼합물을 24 웰 플레이트의 지정된 웰에 넣고 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에서 가습 공기와 5 % CO2로 10 분 동안 배양합니다.

그런 다음 450마이크로리터의 마트라 겔 배지 혼합물을 웰에 추가로 추가하고 60분 동안 더 배양합니다. 두 번째 배양 동안, 섬유아세포와 상피 세포의 0.5 곱하기 10의 농도로 0.5 x 10 농도로 H me 배지 0.5 밀리리터당 5 번째 세포를 일대일 현탁액으로 준비합니다. 마트리겔 배지 혼합물이 응고되면 세포 현탁액을 겔 상단에 부드럽게 떨어뜨리고 배양액을 2일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

우물 측면에서 배지를 매우 부드럽게 흡인하고 광학 또는 형광 현미경을 사용하여 적절하게 현미경 이미지 아래에서 매일 새로운 HEC 배지 모니터의 스페로이드 형성으로 부드럽게 교체하여 2-3일마다 배지를 교체합니다. 먼저 멸균 2ml 유리 피펫을 사용하여 배양물을 위아래로 10회 피펫팅합니다. 그런 다음 유리 피펫으로 배양액을 멸균 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 옮기고 원심 분리 후 실온에서 350 배 G로 10 분 동안 원심 분리하면 세포 스테로이드가 튜브 바닥에 침전됩니다.

멸균 목초지 피펫 팁을 사용하여 원심분리기 상단에서 파괴된 마트라 젤을 부드럽게 제거합니다. 준비. 이제 멸균 2 밀리리터 유리 피펫으로 펠릿 스테로이드 피펫에 1 밀리리터 H 맥 배지를 위아래로 2-3 회 첨가하고 배양을 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 매체를 변경하기 전에 최소 48시간 동안 스테로이드가 접시에 부착되도록 하십시오.

시간이 지남에 따라 세포는 세포 배양이 50%에 도달한 후 스팽 구조를 떠나 단층으로 성장합니다.Confluence Passage 표준화 프로토콜을 사용하여 35mm 접시에 2-4일 동안 통과한 다음 100mm 접시에 3-5일 동안 배양한 후 세포에 대한 추가 분석을 합니다. 멸균 목초지 피펫을 사용하여 배지를 흡입한 다음 가능한 한 많은 잔류 고스트 스페로이드를 수동으로 제거합니다. 3차원 스페로이드 공동 배양에서, 그림 d, E, F에서 보여준 바와 같이 조작된 TM 1 침묵을 가진 섬유아세포는 그림 A, B, C의 대조 섬유아세포에 비해 기억 상피 세포에 의한 기질 침입을 증가시킨다. 그림 D와 F에서 화살표로 표시된 바와 같이 TM 1을 침묵시킨 스페로이드에서 기질로 침입하는 상피 돌기(epithelial projections)는 그림 D 및 F 섬유아세포에서 섬유아세포를 침묵시켰다. 그림에서 JK와 L은 그림 GH에 있는 통제 섬유아세포와 비교된 유방암 세포주 합계 1 59에 의하여 감소된 침입을 유도하고 나는 그림 G와 i에 있는 화살표에 의해 표시된 통제 섬유아세포를 통합하는 그들과 TM 1 공학된 섬유아세포를 통합하는 스테로이드에 있는 상피 돌기의 부족을 비교한다 일단 스테로이드를 공동 배양하는 스테로이드가 설치되었다.

세포 집단은 2차원 맥락에서 리플레팅을 통해 스테로이드로부터 분리할 수 있습니다. 이 이미지 합성은 이곳의 마트리겔 배양에서 분리한 후 광 및 형광 현미경 하에서 배양물을 보여줍니다. 0일차는 격리 직후의 이미징을 나타내며 1일, 2일, 5일은 격리 후 며칠을 나타냅니다.

이 스테로이드를 떠나는 세포의 코로나가 시간이 지남에 따라 어떻게 증가하는지 주목하십시오. 결국, 세포가 거의 없는 유령 스테로이드는 여기에서 화살표로 강조 표시된 대로 남아 있습니다. 유령 제거와 통과 후 스테로이드가 거의 남지 않습니다.

테스트된 세포의 상대적 성장 속도에 따라 다릅니다. 순수 집단은 연속 통로를 통해 나타나거나 적절한 세포 마커를 사용하여 분류할 수 있습니다. 이 예에서는 유세포 분석법으로 시료 와트를 분석하며, 녹색 형광 및 적색 형광을 사용하여 섬유아세포를 발현하는 GFP와 상피 세포를 발현하는 mCherry를 각각 식별하여 상피 세포와 섬유아세포 세포의 상대적 집단을 결정합니다.

3D 공동 배양에서 분리한 후 상피 세포는 섬유아세포와의 공동 배양으로 부여된 특성을 장기간에 걸쳐 유지하여 충분한 분석 기회를 제공합니다. 이 예시에서, TM 1 결핍 섬유아세포에 대한 노출은 3D 공동배양에서 분리 후 몇 주 동안 지속된 공동 배양 H max의 이동을 증가시켰으며, 이는 여기에서 C로 표시된 대조 섬유아세포에 대한 노출에 비해 이 절차를 따랐습니다. 유전자 발현 및 후성유전학적 표지의 변화를 분석하는 것과 같은 다른 방법은 상피 세포에 대한 섬유아세포의 영향에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.