세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

이 프로시저의 전반적인 목적은 기질 섬유아세포가 상피세포 생물학에 미치는 영향을 분석하기 위해 3차원 혼합 세포 조직 배양물로부터 상피세포를 유도하는 것입니다. 이는 먼저 3차원 혼합 세포 스테로이드 공동 배양을 구축함으로써 수행됩니다. 그 후, 공동 배양 후의 상피세포를 분리하기 위해 구형체(sphere)를 매트릭스 배양물로부터 분리합니다.

다음 단계는 분석 준비가 될 때까지 공동 배양 후의 상피 세포를 계대 배양하는 것입니다. 최종적으로, 3차원 배양에서 섬유아세포 노출이 상피 세포 거동에 미치는 영향은 배양물의 현미경 이미지 촬영 및 공동 배양 후 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 여기에서 보여주는 매트릭스 침투의 형광 이미지 촬영 및 Transwell 이동성과 같은 상피 세포 분석 절차를 연구원 Quin이 시연하겠습니다. 공동 배양은 전날에 구축되었습니다.

냉동고에서 Matrigel을 꺼내 4°C 냉장고의 얼음 위에서 하룻밤 동안 해동합니다. 실험 당일에는 배양 배지를 Matrigel과 섞기 최소 1시간 전에 얼음 위에 둡니다. 해동된 Matrigel을 희석하려면 다음과 같이 합니다.

공배양에 필요한 부피의 절반에 해당하는 얼음처럼 차가운 H Mac 배지를 얼음 위에 놓인 멸균 튜브에 넣습니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 유지한 상태에서 해동된 matrigel을 동일한 절반의 총 부피만큼 추가하여 1:1 희석액을 만듭니다. 다음으로, 24-웰 플레이트의 지정된 웰 중앙에 matrigel 배지 혼합물 50 µL를 넣고, 습윤 공기와 5% CO2가 공급되는 37 °C 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음, 웰에 matra gel 배지 혼합물을 450 µL 더 추가하고 60분 동안 더 배양합니다. 두 번째 배양 과정 동안, 섬유아세포와 상피세포를 각각 0.5 mL의 H me 배지에 0.5 × 10⁵ cells/mL 농도로 1:1 현탁액으로 준비합니다. matrigel 배지 혼합물이 고형화되면, 세포 현탁액을 겔 상단에 조심스럽게 떨어뜨리고 배양기를 다시 이용하여 2일 동안 배양합니다.

2~3일마다 웰의 측면에서 배지를 아주 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 새로운 HEC 배지로 조심스럽게 교체하십시오. 현미경을 통해 매일 스페로이드 형성을 관찰하고, 필요에 따라 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 우선 멸균된 2 mL 유리 피펫을 사용하여 배양물을 10회 파이펫팅합니다. 그런 다음 유리 피펫으로 배양물을 멸균된 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 실온에서 350 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 세포 스페로이드가 튜브 바닥에 침전됩니다.

멸균된 파스퇴르 피펫 팁을 사용하여 원심분리기 상단의 분해된 매트리젤을 조심스럽게 제거합니다. 준비 단계입니다. 이제 펠렛화된 스테로이드에 H mac 배지 1 mL를 가하고, 멸균된 2 mL 유리 피펫으로 2~3회 파이펫팅한 후, 배양물을 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 배지를 교체하기 전, 스테로이드가 디쉬에 부착될 수 있도록 최소 48시간 동안 둡니다.

시간이 지남에 따라 세포는 구형 구조를 벗어나 단층으로 성장하게 됩니다. 세포 배양이 50% Confluence에 도달하면 표준 프로토콜을 사용하여 35 millimeter 디쉬로 계대 배양하여 2~4일 동안 배양한 후, 세포의 추가 분석 전까지 100 millimeter 디쉬로 계대 배양하여 3~5일 동안 배양하십시오. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지를 흡입한 다음, 잔류하는 구형 세포 집합체(spheroids)를 가능한 한 수동으로 제거하십시오. 3차원 구형 세포 공배양에서, 그림 D, E, F에 나타낸 것과 같이 TM one 실런싱(silencing)이 설계된 섬유아세포는 그림 A, B, C의 대조군 섬유아세포와 비교하여 유선 상피세포의 매트릭스 침투를 증가시킵니다. 그림 D와 F에서 화살표로 표시된 것처럼 TM one 실런싱 섬유아세포가 포함된 구형 세포 집합체에서 매트릭스로 침투하는 상피 돌기에 주목하십시오. 여기 그림 J, K, L에 표시된 TM one의 과발현이 설계된 섬유아세포는 그림 G, H, I의 대조군 섬유아세포와 비교하여 유방암 세포주 sum 1 59의 침투를 감소시켰습니다. 공배양 구형 세포 집합체가 형성되면, TM one 설계 섬유아세포가 포함된 구형 세포 집합체에서 상피 돌기가 부족한 것을 그림 G와 I의 화살표로 표시된 대조군 섬유아세포 포함 구형 세포 집합체와 비교하십시오.

세포군은 2차원 환경에서 재배양함으로써 스테로이드로부터 분리될 수 있습니다. 이 합성 이미지는 매트리젤(matrigel) 배양에서 분리한 후 광학 및 형광 현미경으로 관찰한 배양 상태를 보여줍니다. 0일 차는 분리 직후의 이미징을 나타내며, 1일, 2일 및 5일 차는 분리 후 경과된 일수를 나타냅니다.

이 스테로이드를 떠나는 세포들의 코로나(corona)가 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 확인하십시오. 결국, 화살표로 표시된 것처럼 세포가 거의 남아있지 않은 고스트 스테로이드(ghost steroid)만 남게 됩니다. 고스트 제거와 계대 배양 후에는 스테로이드가 거의 남지 않습니다.

테스트된 세포의 상대적 성장 속도에 따라 결과가 달라질 수 있습니다. 순수 배양 집단은 연속 계대를 통해 얻거나 적절한 세포 마커를 사용하여 분리할 수 있습니다. 본 예시에서는 유세포 분석법으로 샘플을 분석하며, GFP를 발현하는 섬유아세포와 mCherry를 발현하는 상피세포를 각각 녹색 형광과 적색 형광으로 식별하여 상피세포와 섬유아세포의 상대적 세포 집단 비율을 결정합니다.

3D 공동 배양에서 분리한 후에도 상피 세포는 섬유아세포와의 장기간 공동 배양으로 인해 부여된 특성을 유지하므로, 분석을 위한 충분한 기회를 가질 수 있습니다. 본 예시에서는, TM one 결핍 섬유아세포에 노출되었을 때 공동 배양된 H max의 이동성 증가가 유도되었으며, 이는 여기서 C로 표시된 대조군 섬유아세포에 노출된 경우와 비교하여 3D 공동 배양에서 분리한 후에도 수주 동안 지속되었습니다. 이 절차에 이어, 섬유아세포가 상피 세포에 미치는 영향에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 유전자 발현 및 후성유전적 표지의 변화를 분석하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.