TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법 장염 cholerae 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

이 절차의 목적은 자연적 변형과 플립 조합을 기반으로 하는 이 빠르고 부족한 방법을 사용하여 vio cray를 유전적으로 조작하는 것입니다. 이것은 키틴이 변형의 자연적 유도제이기 때문에 먼저 적절한 키틴 공급원을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 두 차례의 PCR을 사용하여 DNA 구조를 생성하고 자연스러운 변형을 수행하여 박테리아를 포함하는 플라스미드 PBR 플립이 PCR 단편을 흡수하고 게놈에 통합되도록 합니다.

다음으로, 플립 재조합 표적 또는 FRT 부위 측면 항생제 내성 카세트를 제거하기 위해 플라스미드 인코딩 리파아제 효소를 유도하기 위해 온도 상향 이동을 사용합니다. 마지막 단계에서 박테리아는 플라스미드를 인코딩하는 FLP를 치료합니다. 궁극적으로 PCR과 염기서열분석은 유전자 조작이 성공적이었음을 보여주는 데 사용됩니다.

vire를 유전적으로 조작하기 위해 자살 플라스미드를 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 매우 빠르고 효율적이라는 것입니다. 표준 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 50-80 밀리그램의 키틴 플레이크 샘플의 무게를 측정하는 것으로 시작하고, 튜브의 뚜껑을 열어 두고, 오토클레이브가 즉시 뚜껑을 닫고 오토클레이브 키트를 실온의 플레이크에 보관한 후 플레이크를 오토클레이브합니다. 관심 DNA 영역을 증폭하려면 최소 6개의 올리고뉴클레오티드가 필요합니다. 뿐만 아니라 PCR에 의한 FRT 측면 항생제 카세트. 또한 삽입된 PCR 단편 외부에 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것이 좋습니다.

이를 통해 FRT 측면 항생제 내성 카세트 설계, 2번, 3번, 4번 및 5번인 올리고뉴클레오티드의 통합 및 올바른 절제를 주의 깊게 확인할 수 있습니다. 프라이머 2와 5는 게놈 DNA와 프라이머에 충분히 무릎을 꿇을 수 있도록 최소 28개의 염기쌍을 포함해야 합니다. 3 및 4는 주형으로 플라스미드를 포함하는 FRT 캔 FRT로 구성되어야 하며, 프라이머 2와 3 및 프라이머 4와 5 사이의 5 프라임 끝단에서 각각 프라이머 4와 5 사이의 광범위한 무료 염기 페어링을 허용해야 합니다.

이제 PCR의 첫 번째 라운드를 위해 올리고뉴클레오티드 1 및 2를 사용하여 맞춤형으로 설계된 구조체의 관심 실험 영역의 업스트림 영역 증폭을 위한 3개의 동시적이지만 독립적인 PCR 반응 중 첫 번째 반응을 준비합니다. 이와 병행하여 올리고뉴클레오티드 3 및 4를 사용하여 FRT 측면 항생제 카세트를 증폭하여 2차 PCR 반응을 준비합니다. 예를 들어, 이 실험에서는 캐닌 내성을 암호화하는 A PH 유전자를 사용했습니다.

이와 동시에 올리고뉴클레오티드 5 및 6과 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 3차 PCR 반응을 준비하여 다운스트림 DNA 영역을 증폭합니다. 다음 PCR 파편의 모든 3의 정제 후에 모든 3개의 표본을 위한 PCR 반응을 시작하고십시오, PCR의 두번째 라운드를 실행하기 위하여 형질로 첫번째 라운드에서 얻어진 모든 3개의 파편의 동일한 양을 가진 혼합물을 사용하십시오. 이 증폭은 올리고뉴클레오티드 1과 6에 의해 촉매됩니다.

생성된 PCR 단편은 자연 형질전환 실험에서 형질전환 DNA로 사용됩니다. v 콜레라 세포를 성장시킨 후, 섭씨 30도에서 호기성으로 배지를 농축했습니다. 실온에서 원심분리하여 박테리아를 수확합니다.

다음으로, 박테리아 배양액을 플레이크의 연으로 옮기고 섭씨 30도에서 밤새 세포 현탁액을 배양합니다. 다음으로, 최소 200나노그램의 2차 PCR 유래 단편을 박테리아 세포 현탁액에 조심스럽게 혼합합니다. 키틴 표면에서 박테리아를 광범위하게 분리하지 않도록 주의한 다음 이 용액을 섭씨 30도에서 하루 동안 움직이지 않고 배양합니다.

이제 소용돌이, PBR 플립 플라스미드를 보유하고있는 박테리아에 대해 최소 30 초 동안 격렬하게 배양하여 100-300 마이크로 리터의 세포 용액을 암피실린을 함유 한 이중 선택 플레이트에 퍼뜨립니다. 플레이트에 있는 다른 항생제와 함께 집락이 보일 때까지 섭씨 30도에서 박테리아 세포 배양물을 배양합니다. 그런 다음 선택적 플레이트로부터 단일 형질전환체를 분리한다.

암피실린이 함유된 LB 한천 플레이트에서 암피실린이 포함된 박테리아를 섭씨 37도에서 16-24시간 동안 배양하여 이 단계를 시작합니다. 선택 단계로, PBR 플립 플라스미드의 플립 발현이 더 높은 온도에서 억제됨에 따라 2-3시간 동안 온도를 섭씨 40도까지 변경합니다. 섭씨 37도에서 8시간 더 배양한 후 박테리아를 새 플레이트로 옮깁니다.

이제 항생제 함유 및 무항생제 한천 플레이트에서 클론을 병렬로 제한하여 항생제 감수성을 테스트한 다음 결과적으로 생성된 단일 항생제 민감성 콜로니를 분리합니다. 섭씨 30도의 호기성 조건에서 하룻밤 사이에 배양물을 성장시키고 항생제 없이 배지를 농축하여 이 단계를 시작합니다. 다음날 아침, 하룻밤 배양물을 1:100의 비율로 새로운 항생제가 없는 배지에 희석하여 3-6시간 동안 새로운 배양물을 배양하거나, 오후에 배양액을 일반 LB 한천 플레이트에 희석한 다음, 콜로니가 보일 때까지 섭씨 30도에서 8-16시간 동안 플레이트를 다시 배양합니다.

이 첫 번째 실험에서는 인접 유전자 CTXA와 CTXB를 삭제하는 것을 목표로 했습니다. 트랜스 플립 방법에 대한 올리고뉴클레오티드는 방금 부모(parent) 균주를 입증한 바와 같이 생성되었으며, C-T-X-A-B의 원래 DNA 유전자 자리 대신 FRT 측면 항생제 내성 카세트를 보유하는 중간 균주 및 C-T-X-A-B에 대해 삭제되고 내성 카세트가 해제된 최종 균주는 모두 유전자형에 대해 테스트되었으며, 형질전환 PCR 단편에 무릎을 꿇지 않은 프라이머를 사용하여 본 실험을 위해 도매 PCR을 수행했습니다. 그러나 염색체 DNA에만 해당됩니다. PCR 단편은 크기를 결정하기 위해 표준 에어로겔 전기영동으로 분리했습니다.

1번 레인에서, 세계 B형 콜레라 균주는 3, 143 염기쌍의 예상 단편 크기로 위치했다. 2열에서는 균주 델타 C-T-X-A-B-F-R-T에서 유래한 PCR 단편을 사용할 수 있습니다. FRT는 3, 162 염기쌍에 위치했습니다.

그리고 3번째 레인에서 delta ctx A B FFR TP CR 단편은 1KB ladder와 비교하여 1,769 염기쌍에 위치했습니다. 전체 게놈 섬을 제거한 두 번째 예에서는 Vibrio 병원성 섬 1 또는 VPI 섬이 이 실험의 표적으로 선택되었습니다. 트랜스 플립 방법은 두 단계로 수정되었습니다.

첫째, 카나마이신 저항성 유전자의 통합은 PI 1 시작 시 단일 FRT 부위에 의해 진행되었습니다. 그런 다음 두 번째 자연 형질전환이 수행되어 추가 항생제 내성 마커, 즉 겐타마이신 내성을 삽입한 후 병원성 섬 끝에 두 번째 FRT 부위를 삽입할 수 있었습니다. 각각의 프라이머 쌍은 각 겔 그림 위에 표시되었으며, 트랜스 FLP 방법은 방금 시연된 바와 같이 계속되었다.

부모, 중간 및 최종 균주는 모두 1열에서 정제된 게놈 DNA의 PCR에 의해 검증되었습니다. 야생형 V형 콜레라 균주의 PCR 단편은 2차선에서 실행되었습니다. 균주 VPI 1 FRT can GM FRT로부터 생성된 PCR 단편을 실행하였다.

그리고 3열에서는 균주 델타 VPI 1 FRT 유래 PCR 산물을 분석하였다. 프라이머 쌍은 각 젤 사진 위에 표시되어 있습니다. 최종 변형에는 전체 VPI 변형이 없습니다.

이 세 번째 예에서, A T 7 RNA 중합효소 의존성 프로모터 서열은 표준 프로토콜에서 약간의 변형과 함께 트랜스 플립 방법을 사용하여 자연 형질전환의 주요 조절자인 Gene T fox와 업스트림에 통합되었습니다. T 7 RNA 의존성 프로모터 합의 서열은 올리고뉴클레오티드 번호 4 및 번호 5로의 돌출부로 포함되어, 이 DNA 서열이 염색체 내에서 유지되도록 하였다. 항생제 내성 카세트를 절제한 후에도, 구축물은 V 착색된 균주를 함유하는 T 7 RNA 중합효소에 통합되었습니다.

이 균주에서, T Fox 자연 형질 전환 검정의 T 7 RNA 중합효소 의존적 발현을 시험하기 위해 LAC UV 5 프로모터에 의해 T 7 RNA 중합효소 유전자의 발현을 LB 배지에서 수행하였다. Gene T Fox 선행하는 T 7 의존성 프로모터가 결핍된 부모 균주는 풍부한 배지에서 T FOX 전사가 부족하고 천연 유도 물질인 키틴이 없기 때문에 이러한 조건에서 자연적으로 형질전환되지 않습니다. 이 표현형은 T seven RNA 중합효소가 IPTG에 의해 인위적으로 유도되었는지 여부와 무관했습니다.

그러나, 역량 유전자 T Fox의 상류에 T 7 RNA 중합효소 의존성 프로모터를 함유하는 트랜스 플립 생성 균주는 LB 배지에서 LAC UV 5 프로모터의 누출로 인해 실제로 자연적으로 변형 가능한 농축 배지였습니다. 생산된 T 7 RNA 중합효소는 IPTG에 의한 유도 없이 T 7 RNA 중합효소 의존성 프로모터로부터 T FOX를 이미 전사하였다. 이는 자연적 역량과 형질전환을 촉발하여 통합된 T 7 RNA 중합효소 의존성 프로모터 염기서열의 기능을 확인했습니다.

이 표현형은 LAC UV five promoter IPTG의 유도제 첨가로 인한 T seven RNA 중합효소의 완전 유도에 의해 크게 향상되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 키틴에 의한 자연 형질전환과 플립 재조합의 조합을 사용하여 VI 콜레라를 유전적으로 조작하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 유전자 또는 게놈 섬을 삭제할 수 있을 뿐만 아니라 단 며칠 내에 현장 지시 방식으로 DNA 염기서열을 통합할