TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법

본 절차의 목적은 자연 형질전환과 flip 조합을 기반으로 하는 신속하고 효율적인 방법을 사용하여 vio cray를 유전적으로 조작하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 키틴원을 준비함으로써 수행되며, 키틴은 형질전환의 자연적 유도제 역할을 합니다. 두 번째 단계에서는 두 차례의 PCR을 통해 DNA 구조체를 생성하고 자연 형질전환을 수행하며, 이를 통해 PBR flip 플라스미드를 포함하는 박테리아가 PCR 단편을 받아들여 게놈에 통합하도록 합니다.

다음으로, 온도를 높여 플라스미드에 인코딩된 lipase 효소를 유도함으로써 flip 재조합 표적 또는 FRT 사이트가 양옆으로 배치된 항생제 내성 카세트를 제거합니다. 마지막 단계에서는 박테리아에서 FLP 인코딩 플라스미드를 제거합니다. 최종적으로, PCR 및 시퀀싱을 통해 유전자 조작이 성공적으로 이루어졌음을 확인합니다.

자살 플라스미드를 사용하여 바이러스를 유전적으로 조작하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 매우 빠르고 효율적이라는 점입니다. 먼저 표준 1.5 milliliter 플라스틱 튜브에 50 to 80 milligram의 키틴 플레이크 샘플을 정량합니다. 그 다음 튜브 뚜껑을 열어둔 상태로 플레이크를 오토클레이브하고, 오토클레이브가 종료되면 즉시 뚜껑을 닫고 오토클레이브 키트를 실온에서 보관합니다. PCR을 통해 관심 DNA 영역과 FRT가 측면으로 배치된 항생제 카세트를 증폭하려면 최소 6개의 올리고뉴클레오타이드가 필요합니다. 또한 삽입된 PCR 단편 외부에 올리고뉴클레오타이드 프라이머 한 쌍을 포함하는 것이 권장됩니다.

이를 통해 FRT로 둘러싸인 항생제 내성 카세트 설계의 통합 및 정확한 절제 여부를 확인할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드 2번, 3번, 4번 및 5번을 주의 깊게 준비합니다. 프라이머 2번과 5번은 게놈 DNA에 충분히 어닐링할 수 있도록 최소 28 bp를 포함해야 합니다. 프라이머 3번과 4번은 FRT를 포함하는 플라스미드를 템플릿으로 하여 제작해야 하며, 프라이머 2번과 3번, 그리고 프라이머 4번과 5번의 5' 말단 사이에서 광범위한 상보적 염기 쌍 형성이 가능하도록 프라이머 2번과 5번을 설계합니다.

이제 첫 번째 PCR 단계에서, 올리고뉴클레오타이드 1과 2를 사용하여 맞춤 설계된 컨스트럭트의 관심 실험 영역 상류 부위를 증폭하기 위한 3가지의 동시적이지만 독립적인 PCR 반응 중 첫 번째 반응을 준비합니다. 이와 병행하여, 올리고뉴클레오타이드 3과 4를 사용하여 FRT로 둘러싸인 항생제 카세트를 증폭하기 위한 두 번째 PCR 반응을 준비합니다. 예를 들어, 본 실험에서는 카나마이신 내성을 인코딩하는 A PH 유전자가 사용되었습니다.

올리고뉴클레오타이드 5 및 6과 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 세 번째 PCR 반응을 준비함으로써 하류 DNA 영역을 동시에 증폭합니다. 그런 다음 세 가지 PCR 단편을 모두 정제한 후, 1라운드에서 얻은 세 가지 단편을 동일한 양으로 혼합한 것을 템플릿으로 사용하여 2라운드 PCR을 수행합니다. 이 증폭은 올리고뉴클레오타이드 1 및 6에 의해 촉매됩니다.

결과물인 PCR 단편은 자연 형질전환 실험의 형질전환용 DNA로 사용됩니다. v cholera 세포를 30 °C의 호기성 강화 배지에서 배양한 후, 실온에서 원심분리하여 박테리아를 회수하십시오.

다음으로, 박테리아 배양액을 플레이크 형태의 카이트로 옮기고 세포 현탁액을 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이어서, 두 번째 라운드 PCR에서 유래된 단편을 최소 200 ng 취해 박테리아 세포 현탁액에 조심스럽게 혼합합니다. 박테리아가 키틴 표면에서 과도하게 떨어지지 않도록 주의하면서, 이 용액을 30 °C에서 움직임 없이 하루 더 배양합니다.

이제 배양액을 최소 30초 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. PBR flip 플라스미드를 보유한 박테리아의 경우, 세포 용액 100 to 300 µL를 ampicillin이 포함된 이중 선택 배지에 도말합니다. 배지에 포함된 다른 항생제와 함께, 콜로니가 보일 때까지 박테리아 세포 배양액을 30 °C에서 배양합니다. 그 다음, 선택 배지에서 단일 형질전환체를 분리합니다.

ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에서 박테리아를 37 °C로 16~24시간 동안 배양하여 이 단계를 시작합니다. 선택 사항으로, PBR flip 플라스미드의 flip 발현이 고온에서 탈억제되므로 온도를 40 °C로 변경하여 2~3시간 동안 유지합니다. 37 °C에서 8시간 더 배양한 후, 박테리아를 새 플레이트로 옮깁니다.

이제 항생제 감수성을 테스트하기 위해 항생제가 포함된 한천 배지와 항생제가 없는 한천 배지에서 클론을 병렬로 제한하고, 결과로 나타난 항생제 감수성 단일 콜로니를 분리합니다. 이 단계는 항생제가 없는 농축 배지에서 30 °C의 호기성 조건으로 배양액을 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액을 신선한 항생제 무첨가 배지에 1:100 비율로 희석하여 3~6시간 동안 새로운 배양액을 성장시킵니다. 오후에 희석된 배양액을 일반 LB 한천 배지에 스트리킹하거나 도말한 후, 콜로니가 보일 때까지 30 °C에서 8~16시간 동안 추가로 배양합니다.

인접한 유전자인 CTXA 및 CTXB를 결실시키기 위한 첫 번째 실험에서, trans flip법에 필요한 올리고뉴클레오타이드를 앞서 설명한 대로 생성하였습니다. 모주(parental strain), C-T-X-A-B의 원래 DNA 궤적 대신 FRT로 둘러싸인 항생제 내성 카세트를 보유한 중간주(intermediate strain), 그리고 C-T-X-A-B가 결실되고 내성 카세트가 제거된 최종주의 유전형을 모두 테스트하였습니다. 본 실험에서는 형질전환용 PCR 단편이 아닌 염색체 DNA에만 결합하는 프라이머를 사용하여 전체 PCR을 수행하였습니다. PCR 단편은 표준 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여 크기를 확인하였습니다.

1번 레인에서, 세계 표준 B형 콜레라 균주는 예상 단편 크기인 3,143 base pairs에서 확인되었습니다. 2번 레인에서, strain delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT 유래 PCR 단편은 3,162 base pairs에서 확인되었습니다.

그리고 3번 레인에서는 1 KB ladder와 비교했을 때 delta ctx A B FFR TP CR fragment가 1, 769 base pairs 위치에 나타났습니다. 전체 게놈 섬(genomic island)을 제거한 두 번째 예시에서는 Vibrio 병원성 섬 1(Vibrio Pathogenicity island one 또는 VPI one)이 이번 실험의 표적으로 선정되었습니다. trans flip 방법은 두 단계로 수정되었습니다.

먼저, PI one의 시작 부분에 위치한 단일 FRT 사이트를 통해 kanamycin 내성 유전자의 통합을 진행하였습니다. 그 다음, 두 번째 천연 형질전환을 수행하여 병원성 섬의 끝부분에 두 번째 FRT 사이트와 더불어 또 다른 항생제 내성 마커인 Gentamycin 내성 유전자를 삽입하였습니다. 각각의 프라이머 쌍은 각 젤 사진 위에 표시되어 있으며, 앞서 시연한 것과 동일하게 trans FLP 방법을 계속해서 진행하였습니다.

모계, 중간 및 최종 균주는 모두 레인 1의 정제된 게놈 DNA에 대한 PCR을 통해 검증되었습니다. 야생형 V cholera 균주의 PCR 단편은 레인 2에서 분석되었습니다. VPI one FRT can GM FRT 균주로부터 얻은 PCR 단편이 분석되었습니다.

그리고 3번 레인에서는 delta VPI one FRT 유래 PCR 산물을 분석하였습니다. 프라이머 쌍은 각 겔 사진 상단에 표시되어 있습니다. 최종 균주는 VPI one 전체가 결손된 상태입니다.

세 번째 예시에서는, 표준 프로토콜을 약간 수정한 trans flip 방법을 사용하여 자연 형질전환의 주요 조절 인자인 Gene T fox의 상위(upstream)에 T seven RNA polymerase 의존성 프로토콜 서열을 통합하였습니다. T seven RNA 의존성 프로토콜 컨센서스 서열을 올리고뉴클레오타이드 4번과 5번의 오버행(overhang)으로 포함시켜, 해당 DNA 서열이 염색체 내에 유지되도록 하였습니다. 항생제 내성 카세트가 제거된 후, 이 구축물은 T seven RNA polymerase를 포함하는 V colorized 균주에 통합되었습니다.

이 균주에서는 T7 RNA polymerase 유전자의 발현이 LAC UV5 프로모터에 의해 구동되었으며, 이는 T7 RNA polymerase 의존적인 T Fox 발현을 테스트하기 위함이었습니다. 자연 형질전환 분석은 LB 배지에서 수행되었습니다. Gene T Fox 앞에 T7 의존적 프로모터가 없는 모균주는, 풍부 배지 내에서 T FOX 전사가 일어나지 않고 천연 유도제인 chitin이 없기 때문에 이러한 조건에서 자연적으로 형질전환되지 않습니다. 이러한 표현형은 T7 RNA polymerase가 IPTG에 의해 인위적으로 유도되었는지 여부와 상관없이 나타났습니다.

하지만, competence 유전자인 T Fox의 상류에 T7 RNA polymerase 의존성 프로모터를 포함하도록 제작된 trans flip 균주는 LB 배지 내 LAC UV five 프로모터의 누출(leakage)로 인해 실제로 농축 배지에서 자연 형질전환이 가능했습니다. 생성된 T7 RNA polymerase가 IPTG 유도 없이도 T7 RNA polymerase 의존성 프로모터로부터 T FOX를 이미 전사했기 때문입니다. 이는 자연적 수용성(natural competence)과 형질전환을 개시시켰으며, 통합된 T7 RNA polymerase 의존성 프로모터 서열의 기능성을 확인시켜 주었습니다.

이 표현형은 LAC UV five 프로모터의 유도체인 IPTG를 첨가하여 T seven RNA polymerase의 완전한 유도를 통해 유의하게 강화되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 키틴 유도 자연 형질전환과 flip 재조합의 조합을 사용하여 V. cholerae를 유전적으로 조작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 단 며칠 만에 유전자나 게놈 아일랜드를 결실시키거나, 특정 부위에 DNA 서열을 정밀하게 통합할 수 있습니다.