생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학

이 실험의 목적은 타임랩스 공초점 현미경을 이용하여 살아있는 초파리 배아 내 단백질 동역학 및 국소화 패턴의 생체 내 시각화를 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유지 관리된 초파리 계통에서 배아를 수확합니다. 다음으로, 배아를 슬라이드로 옮긴 후 배아에서 고쿤(coons)을 수동으로 제거하여 코팅된 배아 상태로 만듭니다.

이후 준비된 슬라이드 위에 체계적으로 장착하며, 실험에 따라 적절한 방추사 체크포인트 유도 시약을 미세 주입할 수 있습니다. 이 절차의 마지막 단계는 공초점 현미경을 사용하여 배아의 타임랩스 이미징을 수행하는 것입니다. 최종적으로 타임랩스 및 공초점 현미경을 통해 방추사 체크포인트 단백질, 염색체 공국소화 거동, 그리고 체크포인트 관련 형질전환 oph 라인에서 체크포인트 유도제의 효과를 확인합니다.

이 방법은 유전자 변형 계통을 통해 방추체 체크포인트 단백질의 돌연변이 또는 결손이 다른 체크포인트 구성 요소의 공국소화(colocalization)에 미치는 영향과, 이것이 방추체 조립 체크포인트의 효율적인 기능 수행 능력에 주는 결과와 같이 ME 조절 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 형질전환 초파리는 초파리 먹이가 들어 있는 플라스틱 바이알에서 25 °C로 유지하며, 상단에 건조 효모 분말을 추가로 제공합니다. 바이알은 성장 조건에 따라 통상적으로 2~3주마다 교체합니다.

초파리 먹이를 준비하려면, 연동 펌프를 사용하여 성분들이 용해되도록 지속적으로 저어주며 적당량의 초파리 먹이 혼합물을 가열하고, 이 배지를 슬러리 상태로 각 플라스틱 바이알에 8~10mL씩 분배합니다. 먹이 슬러리가 굳고 실온에 도달하면, 각 바이알을 면 폼 플러그로 막습니다. 소규모 알 수집을 위해 이 먹이 바이알들을 트레이에 담아 플라스틱 백으로 밀봉한 후 4°C에서 보관합니다.

배아 산란을 위해 표면에 건조 효모 분말을 추가로 공급한 신선한 초파리 먹이 바이알에 2~3일 된 성체 초파리 약 50쌍을 옮깁니다. 에어컨으로 온도가 조절되는 25°C에서 배양합니다. 매 시간마다 초파리를 신선한 바이알로 옮기고, 배아는 30분 동안 그대로 둡니다.

수집된 배아 중 일부가 핵분열 주기 8~10 단계에 도달하도록 하기 위해서입니다. 첫 1시간 동안 수집된 배아는 산란에 적합하지 않은 조건일 때 암컷의 체내에 남아 있던 노화된 배아가 포함되는 경우가 많으므로 보통 폐기합니다. 따라서 본 실험에서는 2시간째부터 전이된 배아만을 사용합니다.

이 절차에는 현미경 슬라이드와 50 by 22 밀리미터 커버슬립이 사용됩니다. 먼저 커버슬립을 준비하고, 젖은 세밀한 펜 브러시를 사용하여 한쪽 면의 네 모서리에 아주 적은 양의 물을 살짝 묻힙니다. 그 다음 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 올립니다.

얇은 액체 막으로 인해 발생하는 모세관 표면 장력이 커버슬립의 이동을 방지해야 합니다. 커버슬립 중앙에 헵탄 접착제를 얇게 바릅니다. 헵탄은 수 초 내에 증발하며 커버슬립에 접착제만 남게 됩니다.

다음으로, 다이아몬드 펜을 사용하여 또 다른 커버슬립을 약 1.5 mm² 크기의 작은 정사각형으로 자릅니다. 정사각형 하나를 집어 접착 스트립의 한쪽 끝에 배치합니다. 이는 미세주입이 필요할 때 니들 팁을 열기 위해 사용됩니다.

다른 현미경 슬라이드를 준비하여 2cm 길이의 양면테이프를 붙인 다음, 덮개지를 제거하여 배아 코팅 절차를 시작합니다. 촉촉하고 세밀한 펜 브러시를 사용하여 초파리들을 새로운 먹이 바이알로 옮깁니다. 준비된 슬라이드의 양면테이프 위에 약 50개의 알을 옮깁니다.

알들이 넓게 퍼질 수 있도록 적절한 양의 액체를 사용하십시오. 액체가 증발하면 알들이 해부 현미경 아래의 테이프에 부착됩니다. 핀셋 한 쌍 중 한쪽의 바깥쪽 면을 사용하여 코리온(Corian)이 깨져 열릴 때까지 알의 장축을 따라 여러 번 부드럽게 터치하십시오.

급격한 탈수를 방지하기 위해 배아를 Corian 쉘에 그대로 둡니다. 10~20개의 알이 처리될 때까지 이 과정을 반복합니다. 그다음, 배아를 집어 Corian 쉘에서 하나씩 꺼낸 후 수직 스트립에 조심스럽게 배치합니다.

글루 스트립 위에 배치합니다. 배아의 긴 쪽이 글루 스트립의 긴 쪽과 반평행이 되도록 정렬합니다. 배아를 건조 챔버에 3~8분 동안 둡니다.

마지막으로, 미세주입 전 과도한 탈수를 방지하기 위해 배아를 적당량의 volter left tennis oil로 덮어줍니다. 미세주입은 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 미세주입을 최대한 쉽고 효율적으로 수행하기 위해서는 슬라이드 준비를 위한 특정 프로토콜을 준수해야 합니다.

배아를 미세 주입하기에 최적의 상태로 만들기 위해 세심하게 준비해야 합니다. 배아 미세 주입용 니들은 미리 준비합니다. 미세 로딩 팁을 사용하여, 주입 완충액에 적절한 농도로 희석된 시약을 니들에 1~2 µL 채웁니다.

압력 파이프가 주입 제어 시스템에 연결된 상태에서 Leica TCSP two 도립 공초점 현미경의 니들 홀더에 니들을 장착합니다. 40배 대물렌즈로 배아를 찾습니다. 그다지 초점 평면을 변경하지 않고 니들의 그림자를 찾습니다.

바늘을 시야 중심부로 이동시킨 후, 오른쪽 초점 평면으로 서서히 내리면서 이 과정을 수행합니다. 현미경 스테이지를 매우 조심스럽게 움직여 접착 스트립의 한쪽 끝에 미리 장착된 작은 정사각형 커버슬립을 찾습니다. 바늘 끝이 작은 정사각형 커버슬립의 가장자리에 닿아 부드럽게 깨질 때까지 바늘을 매우 조심스럽게 이동시킵니다.

배아가 다시 시야에 들어오도록 스테이지를 이동하고, 주입하기에 적절한 시기의 배아를 선택합니다. 배아를 바늘 가까이 조심스럽게 이동시킨 후, 배아와 바늘 모두에 대해 초점 평면을 다시 조정합니다. 배아를 바늘 안으로 이동시킵니다.

배아의 측면에 시약 한 방울을 주입한 후 배아를 이동시킵니다. 살아있는 배아의 타임랩스 또는 단일 이미지는 40배 오일 침강 렌즈가 장착된 Leica TCSS SP inverted confocal microscopy system을 사용하여 수집합니다. 스펙트럼이 겹치고 동일한 배아에서 공동 발현되는 여러 형광 단백질을 이미지화할 때는 각 형광 단백질의 방출 파장을 순차적으로 수집합니다.

이 이미지들은 타임랩스 이미징을 위한 시간 간격을 설정하는 과정에서 나중에 나타났습니다. 이러한 요인들이 반드시 고려되어야 합니다. 일반적으로 하나의 이미지는 두 개의 스캔 라인의 평균값으로 얻어집니다.

평균 2회의 프레임 스캔 시, 동시 스캔 모드에서는 512 x 512 픽셀 이미지를 스캔하고 양호한 신호 대 잡음비를 생성하는 데 최소 6.3초가 소요되며, 순차 스캔 모드에서는 15.44초가 소요됩니다. 핀홀은 보통 1~2 au(airy unit)로 설정하며, 심각한 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 출력은 가능한 최저 수준으로 조정합니다. 이 대표 타임랩스 영상은 살아있는 cial 배아 내에서 CDC 20의 동역학적 핵심 모집과 염색체 이동을 보여줍니다.

GFP-CDC20(녹색으로 표시)과 RFP-histone 2B(적색으로 표시)를 공동 발현하는 형질전환 초기 배아에서 타임랩스 이미지를 촬영하였습니다. 핵 분열 주기 동안 10초마다 7~8프레임을 촬영하였으며, 세포가 이미 전기에 진입한 프레임을 0시점으로 처리하였습니다. 이 그림은 타임랩스 영화의 프레임들을 보여주며, 이미지 3과 4의 흰색 화살표로 각각 표시된 바와 같이 전기에 그리고 전중기에 GFP-CDC20이 kinetochore에서 쉽게 관찰되며, 이미지 5와 6에서 관찰되는 것처럼 중기와 후기 kinetochore에서도 지속적으로 나타납니다.

이미지 1의 흰색 화살표 머리로 표시된 인터페이스 핵에서 G-F-P-C-D-C 20이 배제되어 있으며, 이미지 2에서 보듯 초기 전기에 핵 내부로 진입합니다. 이미지 8에서 14까지는 공동 발현된 RFP histone two B를 마커로 사용하여 병합함으로써 염색질 형태를 결정하였습니다. 해당 이미지들은 하단 행에 표시되어 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여, SAC을 유발할 가능성이 있는 항체, 형광 표지 단백질 또는 관심 화학 화합물을 미세 주입하여 배아를 조작함으로써 방추사 조립 체크포인트(spindle assembly checkpoint, SAC) 기능을 연구할 수 있습니다. 본 예시에서는 colchicine을 처리하여 미세소관의 중합을 해제함으로써 SAC을 유도하며, GFP CDC 20 또는 GFP MAD를 관찰합니다. 세포 주기 진행 마커로 두 가지 키네틱 코어 신호를 사용하였습니다.

상단 패널에서, ARES는 이미지 2에서 6까지의 정지된 esci를 나타냅니다. 이미지 1에서 화살표로 표시된 영역은 colchicine 처리 전, G-F-P-C-D-C 20이 후기 인터페이스 핵에서 배제되어 있음을 나타냅니다. 중간 패널의 이미지들은 내인성 MAD 2가 없을 때, 7에서 12까지 화살표로 표시된 G-F-P-C-D-C 20이 핵 내부와 외부, 그리고 kinetochore 위와 아래를 계속해서 오가며 진동함을 보여줍니다.

세포질 분열에 결함이 있는 것으로 보이지만, 이는 Colchicine 처리 시 세포를 정지시키는 SAC 기능이 실패했음을 시사합니다. 딸핵의 분리가 실패한 사례가 이미지 10에서 관찰됩니다. 마지막으로, 이미지 14에서 18의 하단 패널에 있는 화살표 머리는 GFP MA two 융합 단백질이 축적된 정지된 운동성 핵(kinetic cores)을 나타내며, 이는 기능적인 GFP MA two가 MA two 돌연변이 배아의 sac 결함 표현형을 회복시켰음을 시사합니다.

이미지 13의 화살표는 후기 인터페이스 핵에 축적된 GFP MAD two를 나타냅니다. 이 영상들을 시청한 후에는 유지 줄기에서 두 소프트웨어 배아를 수확하는 방법, 슬라이드를 준비하기 전 배아를 수동으로 분리하는 방법, 그리고 공초점 현미경을 이용한 인비보(in vivo) 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.