위한 간편한 기법

오늘 우리는 기증된 인간의 안구에서 각막과 망막 조직을 적출하는 간소화된 기술을 시연하겠습니다. 본 영상에서 설명하는 기술은 안구의 다른 조직을 손상시키지 않으면서 이식, 수술 및 연구 목적으로 사용될 고품질의 조직을 적출하는 데 도움이 될 것입니다. 18년의 전문 지식과 매년 수많은 각막 이식 경험을 바탕으로, 우리는 새로운 기술을 개발하고 매일 숙련도를 향상시킴으로써 업무의 높은 표준을 유지해 왔습니다.

이를 위해 먼저 각막을 적출한 다음, 망막을 적출합니다. 각막은 빛이 망막으로 전달될 수 있게 하는 무혈관 조직이며, 이 목적을 위해 항상 높은 수준의 투명도를 유지해야 합니다. 각막은 상피, 보우만층, 기질, 데스메막, 내피의 다섯 가지 층으로 구성됩니다.

각막이 손상된 경우, 적절한 공여 각막을 통해 교체할 수 있습니다. 맥락막은 공막과 망막 사이의 중간층으로, 내측은 브루스 막(bruss membrane)으로 경계 지어지며 안구 내 혈류를 담당합니다. 맥락막의 적절한 적출은 망막 제거만큼이나 중요합니다.

망막은 각막과 수정체로부터 들어오는 빛을 받아들여 최종적으로 뇌로 전달되는 화학 에너지로 변환하는 역할을 합니다. 시신경은 투명하고 섬세하므로, 양질의 조직을 얻기 위해서는 체계적으로 적출해야 합니다. 층류 작업대(lanar airflow cabinet)의 전원을 켭니다.

70% isop alcohol을 사용하여 층류 hoods(lamellar flow hood)를 세척하십시오. 수술용 캡, 마스크, 멸균 장갑 및 팔 토시와 같은 개인 보호구를 착용하십시오. 무균 조작법을 사용하여 멸균 타월과 사전 멸균된 기구 트레이를 배치함으로써 멸균 구역을 설정하십시오.

멸균 기구 팩을 무균적으로 개봉하고, 오염이 되지 않도록 주의하며 멸균 구역 위로 덮어 씌웁니다. 모든 멸균 재료와 기구를 멸균 구역 내에 배치하고, 안구를 담은 안구 용기를 멸균 구역의 가장자리와 거리를 두어 배치합니다. 사용 편의를 위해 미리 준비한 보존액이 든 병에 라벨을 붙이고, 요오드 폴리올 파이로 리드, 황산나트륨 및 멸균 인산염 완충 식염수 용액을 배치합니다.

멸균 공급 장치 밖에서, 4°C의 냉장고에 보관된 안구 조직과 용액이 일반 상온에 도달하도록 둡니다. 반복적인 가온 또는 냉각 사이클을 피하십시오. 멸균 집게를 사용하여 안구 보존 용기에서 거즈와 스펀지를 제거합니다.

안구를 뚜껑 위에 놓고 추가 붕대를 제거합니다. 시신경이 포함된 안구를 조심스럽게 집어 들어 멸균된 IPVP에 담급니다. 멸균된 IPVP에서 안구를 2분 동안 세척합니다.

안구를 멸균된 티오황산나트륨 용액에 1분 동안 담급니다. 안구를 멸균된 인산염 완충 세포주 용액(phosphate buffer cell line solution)으로 옮겨 사용 시까지 유지합니다. 층류 작업대(lanar airflow hood) 아래에서 안구를 PBS로 세척하여 제거한 후 멸균 구역 내에 배치합니다.

스테로이드를 사용하여 안구를 감싸되, 각막과 각막으로부터 약 5mm 거리의 공막은 노출된 상태로 둡니다. 안구는 손으로 가볍게 잡을 수 있습니다. 멸균 가위로 적절한 압력을 유지하며, 각막이 손상되지 않도록 주의하여 남아 있는 결막을 모두 제거합니다.

일회용 메스 날을 사용하여 각막연(limbus) 부위에서 3~4mm 거리로 공막 절개를 수행합니다. 그 다음, 하부의 포도막 조직을 천공하거나 각막의 정상 곡률을 변형시키지 않도록 주의하며 절개선을 360도 확장합니다. 유리체가 유출되지 않도록 주의하면서 네 군데의 큰 절개선을 만들고 네 개의 작은 틈을 남깁니다.

다른 조직이 제거되지 않도록 주의하며 네 개의 절개 부위를 모두 자릅니다. 작은 공막판(scleral plaques)이 존재할 경우 절개가 어려울 수 있으므로, 미세수술 가위로 공막 절제를 완전히 마쳤는지 확인하십시오. 이 작업은 맥락막 망막과 유리체에 손상을 주지 않고 수행되어야 합니다.

절개 부위를 검사하여 완전히 절개되었는지 확인합니다. 절개가 정확하게 수행되었다면, 각막 공막 테두리는 각막과 일치하는 지점에서만 모양체에 부착되어 있습니다. 안구를 멸균 패드의 중앙 근처에 놓습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각막 제거를 완료합니다.

공막 가장자리를 고정하고, 안구 광채(ocular glow)로부터 각막 공막 가장자리를 절제합니다. 각막 공막 버튼(corno scleral button)에서 남아 있는 인접 조직을 조심스럽게 분리합니다. 각막 공막 가장자리를 당길 때 각막에 가로 방향의 장력이 가해지거나, 전방 위로 다시 떨어지지 않도록 주의하십시오.

저장액을 사용하여 각막의 내피세포 밀도를 확인하고, trip blue 염색을 약 1분 동안 실시하여 세포 사멸 여부를 확인합니다. 멸균 거즈로 trip blue 염색약을 제거하고 각막을 멸균 PBS로 세척합니다. 이를 sucrose 용액이 채워진 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.

이 용액은 저장성 환경을 조성하여 세포를 시각적으로 식별하는 데 도움을 줍니다. 그 후 광학 현미경의 100배 배율에서 세포 수를 측정하여 mm²당 세포 수로 계산합니다. 일반적으로 세포 밀도와 더불어 세포 간 경계, 다형성 퇴행, 이영양성 및 세포 사멸과 같은 형태학적 특성을 관찰합니다.

각막 두께는 적출된 각막의 우수한 투명도와 더불어 이식 시 중요한 고려 사항입니다. 멸균된 각막 CLO를 사용하여 공막 가장자리에 각막을 고정하고, 공막 가장자리를 고정하기에 충분한 구멍이 확보되도록 각막 CLO를 구부린 후, 각막 클로브를 이용해 각막 공막 가장자리를 상온에서 미리 준비한 각막 보관 배지로 옮깁니다. 그 후 각막은 4주간의 보존 기간 동안 31 degree SIUs에서 보관되어야 합니다.

저장 매체는 B 9 2 4 0 장비를 사용하여 여러 가지 미생물학적 테스트를 거칩니다. 저장 과정에서 각막은 이식에 필요한 일반적인 크기보다 더 두꺼워집니다. 안구은행에서는 두께를 줄이기 위해 D 팽창제(swelling agents)를 사용합니다. 각막을 정상 크기로 되돌리기 위해 6%Dextron T 500과 운송 매체를 사용합니다.

망막 적출 전, RA free 환경을 조성하기 위해 RNA app으로 멸균 기구를 세척하십시오. 멸균 구역을 준비하고 안구가 온전한 상태이며 각막과 공막 가장자리만 제거되었는지 확인하십시오. 유리체 유출이 발생하면 망막 조직 제거가 어려워집니다.

기증자의 연령이 65세 미만인 경우, 혈청학적 검사 후 수술 목적으로 공막을 70% alcohol 내에서 보존합니다. 이 경우 공막을 절단하지 않고 유리체만 제거하며, 망막 절제술을 위해 공막 전체를 보존합니다. 멸균 포셉과 가위를 사용하여 공막의 각막 측 근처에서 작은 절개를 시작하여 시신경 방향으로 진행합니다.

멸균 핀셋으로 공막 부위를 잡고, 유리체에 손상을 주지 않도록 주의하며 가위로 시신경 방향을 향해 부분적으로 절개합니다. 맥락막 플러그는 공막에 붙어 있으므로 이를 공막에서 분리해야 합니다. 공막 전체를 절개하여 맥락막 조직을 노출시킵니다.

공막을 완전히 절개한 후, 시신경 근처를 절단하여 공막을 나머지 조직과 분리하면 유리체를 덮고 있는 맥락막 층 전체가 보입니다. 두 개의 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 RNA-free append-off 튜브에 RL 버퍼 2 ml를 채웁니다. 한 쌍의 핀셋으로 시신경을 잡고 다른 핀셋으로 맥락막을 제거하여 맥락막 층을 조심스럽게 분리합니다.

맥락막을 부분적으로 분리하고 제거하기 쉽도록 절개합니다. 망막에 손상을 주지 않도록 주의하며 가위를 사용하여 맥락막 층을 절개할 수 있습니다. 절제된 맥락막 층을 RNA later 용액에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 보관합니다.

망막 조직을 노출시키기 위해 모든 추가 맥락막을 제거합니다. 맥락막 층 전체가 제거되면 투명한 망막 층이 보일 것입니다. 분명 맥락막 층에는 내부의 브루크 막(brus membrane)이 있으며, 이 또한 제거할 수 있으나 육안으로는 확인하기 어렵습니다.

마찬가지로, 두 개의 핀셋을 사용하여 망막층을 제거합니다. 시신경 근처에서 절제하면 많은 양의 망막을 쉽게 분리할 수 있습니다. 이제 눈의 모든 층을 확인할 수 있습니다.

적출한 망막을 RNA later 용액에 넣고 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 70% 이소프로필 알코올을 사용하여 작업 영역을 세척하십시오. Trypan blue로 염색된 내피세포는 도립 현미경의 100배 배율에서 관찰할 수 있습니다.

제곱밀리미터당 200개 이상의 세포를 보유한 적합한 각막을 통상적으로 추후 사용을 위해 보존합니다. 품질을 보통에서 우수함까지 등급별로 분류하는 것은 비교 연구에 도움이 됩니다. 일반적으로 이식 준비가 된 각막의 두께와 투명도를 기록한 후, 적합한 각막을 각막 전체를 이식하는 관통성 각막이식술에 사용합니다.

세포 사망률은 청색으로 염색된 세포를 관찰하여 확인하며, 사망한 세포의 백분율로 평가합니다. 보존 중 전체 세포 사망률이 2% 이상이면 부적합한 것으로 간주합니다. 세포 밀도가 제곱밀리미터당 2200개 미만이거나 사망으로 인한 손상이 있는 경우, 각막은 전층 각막 이식술에 사용될 수 있습니다.

전방 외상이 손상되었으나 각막의 내피세포 밀도가 양호한 경우, 해당 각막을 후면 층판 각막이식에 사용할 수 있습니다. 장기 배양 과정에서 일반적으로 각막의 두께가 증가합니다. 운송 배지는 각막이 정상적인 모양과 구조를 회복하도록 돕습니다.

또한, 장기 배양은 각막의 재상피화를 돕고 보관 기간이 길기 때문에 적절한 기증자 선택에 도움이 됩니다. 미생물학적 및 혈청학적 검사를 수행할 수 있습니다. 이는 수술 일정을 조정할 충분한 시간을 제공하며, 사후 시간이 너무 길어 확인이 불가능한 경우 내피세포 밀도와 형태를 확인하는 데 도움이 됩니다.

따라서 설명된 절차를 따르면 다른 조직에 손상을 주지 않고 각막을 절제할 수 있습니다. 만약 각막이 이식에 적합하지 않은 경우, 안구 표면 질환 연구를 위한 새로운 배지와 보존 조건 개발, 각막줄기세포 분리 및 각막에 대한 약물 효과 연구 등의 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 망막의 경우, 중심 조직에 의한 RNA 샘플의 교차 오염을 방지하고 RNA의 무결성을 보존할 수 있으며, 이는 매우 중요합니다.

연구 목적으로 필수적인 이 조직들은 안구 조직의 전사체를 특성화하고, 재생 의학 프로젝트를 위한 줄기세포를 분리하며, 정상 피험자와 환자 유래 조직 간의 조직학적 차이를 평가하는 데 사용됩니다. 망막 조직이 제거되면 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 이에 따라 보존에 사용되는 후속 단계와 조건이 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 망막 조직은 RNA 또는 DNA 추출을 위해 r nator나 thisis 버퍼와 같은 RNA 안정화 시약이 포함된 튜브에 넣거나, 세포 분리를 위해 displaced 또는 trypsin에 넣을 수 있습니다.

면역조직화학염색을 위해 조직을 파라핀이나 OCT에 매립하기 전 고정액 처리 단계입니다. 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 연구에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.