Name: 위한 간편한 기법 현장에서 절단 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 학습하세요 인간 사체 기증자 안구에서 각막 및 망막 조직을 절제하는 간소화된 기법을. 18년의 전문성을 바탕으로 조직 품질을 보존하고 이식 및 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

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이 작품은 Regione 베네토 (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 및 Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009)의 보조금을 통해 부분적으로 지원되었다. 저자는 인간의 안구 글로브의 사용에 관한 2,010분의 2,009 요약 데이터에 대한 박사 C. Griffoni 감사드립니다.

1. 각막의 현장 절단에서 안구 글로브에서 <ol><li> 약 15 분 사용 전 판상 공기 흐름 캐비닛 전환합니다. 70% 이소 프로필 알콜을 사용하여 층류 후드를 청소합니다. 이러한 수술 모자와 마스크 같은 개인 보호복 쓰세요. 손과 팔뚝을 스크럽하고 멸균 수건을 사용하여 건조. 무균 기술을 사용하여 무균 장갑과 가운이나 소매를 착용하십시오. </li><li> 무균 멸균 악기 트레이를 배치하여 무균 필드를 설정합니다. 악기는 멸균 있는지 확인합니다. 멸균 악기 팩을 열고 모든 오염을 피하는 멸균 분야에 뒤집기. </li><li> 그들은 사용의 편의를위한 멸균 필드의 가장자리에 인접해 있습니다 있도록 안구 글로브를 포함하는 병 (안구 단지)과 함께 모든 불임이 자료와 악기 (표 2)를 놓습니다. </li><li> 표 3에 표시된대로 이전에 준비를 보존 / 저장 매체와 병 라벨과 배치I-PVP와 함께 판상 공기 흐름 후드 (요오드 - polyvinylpyrrolidone), 나트륨 thiosulphate 및 멸균 생리 식염수의 표면 m PBS (인산염 완충 식염수). </li><li> 그들이 4 ° C.에 냉장고에 보관하기 때문에 안구 조직 및 솔루션 정상적인 실내 온도에 도달하도록 허용 반복 온난화 / 냉각 사이클을 피한다. 솔루션의 뚜껑과 안쪽과 눈 항아리는 해당 단지 옆에있는 위쪽으로 향하게 보관. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 눈의 병에서 gauzes와 스폰지를 제거합니다. 안구 오는 11 일 오염을 제거하다 2 분 동안 멸균 I-PVP 0.5 %로 세계 젖어. 멸균 필드 밖 살균 트레이의 뚜껑에있는 두 개의 집게를 놓습니다. 멸균 포셉 또 한 쌍의를 사용하여 1 분 나트륨 thiosulphate 0.1 %에서 지구를 전송합니다. 같은 포셉 사용하여 멸균 생리 식염수 (PBS)를 포함하는 병으로 세계를 전송하고 그것을 운영까지 둡니다. t에서 다른 눈의 세계에 대해 동일한 절차를 반복합니다그는 같은 거였어요. </li><li> 판상 공기 흐름 후드 아래 작업, 파낸 각막에서 무균 각막두고 거즈 (반창고)와 약 5 밀리미터 공막엔를 사용하여 지구를 싸다. 눈 전구는 단순히 적절한 압력을 유지 손에 쥐어 수 있습니다. 조직 전체를 수술하는 동안 촉촉한 보관해야합니다. </li><li> 집게는 결막의 모든 최종 유적을 제거하는 가위와 함께 사용됩니다. 다른 악기와는 별도로 위의 작업에 사용되는 악기를 유지. limbus 지역 3~4mm의 scleral 절개를 수행하기 위해 메스 블레이드를 사용하여 다음 기본 uveal 조직을 구멍하기 피하고, 360 °로 절개를 연장하거나 각막의 정상적인 곡률 변형의 원인이됩니다. 유리체 신체의 분비를 피하 네 작은 간격을두고 네 큰 incisions 잘라. 이들 네 격차는 다른 조직에 대한 제거를 보장하지 절단됩니다. </li><li> 작은 scleral plaques의 존재가 절단을 방해 수도 있으므로 광고에 있는지 확인미세 가위와 scleral 절단을 lete. 이 작업은 맥락막, 망막 및 유리체 신체를 손상없이 수행되어야한다. </li><li> 그것이 완료될 수 있도록 절개를 검사합니다. 절개는 각막과 통신의 지점 ciliary 기관에 올바르게 corneo-scleral 림의 준수를 수행 되었다면. </li><li> 멸균 분야의 중심 근처에 싼 안구 지구를 아래로 설정합니다. 아래와 멀리 corneo-scleral 버튼에서 모양체 - 맥락막를 당길 절단에 사용된 scleral 가장자리 정지와 손을 잡고 집게를 사용하여 각막 제거를 완료합니다. </li><li> 부드럽게 corneo-scleral 버튼에서 남아있는 adhesions을 분리. 마찬가지 교차 각막 장력의 원인이 아니고 그것이 앞쪽에 챔버에 아래로 다시 내려시킬 수있는 방법으로 corneo-scleral 림들을 매력적이지도 않아. </li><li> 각막의 내피 세포 밀도는 tryp를 사용하여 hypotonic 솔루션과 세포 사망률이 선택되어 사용하여 검사합니다1 시경 분, 전지 블루 염색법 그 후 광학 현미경으로 계산 및 세포 / mm 2로 측정합니다. 후부는 페트리 접시의 바닥을 직시해야하면서 앞쪽에 챔버 뚜껑을 직시해야합니다. 내피 세포 밀도는 100X 배율 아래 목적에 격자를 사용하여 수동으로 집계 수 있습니다. 이탈리아의 이식에 대한 최소 허용 셀 개수는 2,200 내피 세포 / mm 2입니다. </li><li> 같은 표 3에 나타난 RT (실내 온도)에서 보존 이전에 준비 각막 저장 매체로 각막 발톱을 사용 corneo-scleral 림을 전송합니다. </li><li> 천연 결정 렌즈의 후부 챔버를 검사합니다. 공막엔가 준비되면 세계에서 모든 uvea의 잔류물과 유리체 유머를 제거합니다. 조심스럽게 포장을 푸는 및 무균 기술을 사용하고, 그 각각의 눈 항아리에 남은 후부 세그먼트를 반환합니다. 새로운 악기를 사용하여 다른 세계에 대한 절차를 반복합니다. 각막 재치 고쳐H 각막 발톱 31시 저장 매체 (오르간 문화)에서 보존 ° C. 그림 1A에 나타난 excised 각막은 다음 keratoplasty 또는 연구에 사용될 수 있습니다. </li><li> 적절한 폐기물 용기에 불필요한 재료와 바이오 유해 폐기물을 배출. 작품 70% 이소 프로필 알코올 스프레이를 사용하여 완료되면 작업 공간을 청소하십시오. </li><li> 28일 후 각막 모든 평가 매개 변수를 유지하는 경우 [같은 형태로서, 셀 개수, 투명성, 두께 및 미생물학 시험 - 세균성 및 Bactec 9,240 악기 (Becton 디킨슨, 밀라노, 이탈리아)를 사용하여 곰팡이]을, 그것은 다음에 운반하실 수 있습니다 표 4에 표시된 전송 매체를 사용하는 병원. 각막이 제거되고 판상 공기 흐름 캐비닛 아래의 매체를 수송 저장 장치에서 배치해야합니다. </li><li> 마찬가지로, 저장하는 동안 각막은 이식에 필요한 자사의 일반적인 크기보다 두꺼워지고, 안구 은행은 두께를 줄이기 위해 드 붓기 에이전트를 사용합니다. 우리전송 매체에서의 정상적인 크기로 각막을 얻을 6% dextran T500을 사용합니다. 4~8% dextran T500은 사용될 수 있지만, 6 %는 우리를 위해 최선을 역임했다. 이것은 쉽게 외과 마자 그들이 그것을받는대로 각막을 이식 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 각막을 절개 후 안구 글로브에서 망막의 내장 적출 <ol><li> 절단 후, 각막은 그 형태와 내피 세포 밀도를 기반으로 이식하거나 연구에 선정되어 31 살에 저장하거나 보존 매체에 배치됩니다 ° C.가 안구 세계의 나머지는 다음, 수술 목적 등 공막엔 절연과 같은 추가 사용하기 위해 가공 연구를위한 망막 등 있습니다 </li><li> 망막 절단하기 전에 눈의 세계가 온전하고 제거됩니다 공막엔 부분에서만 각막 있는지 확인하십시오. 젤라틴 유리체 기관 정체 secreting있다면 그것은 망막 조직을 제거하기 어렵게된다. </li><li> 기증자는 아래의 65 세 경우 공막엔입니다serological 테스트 후에 수술 목적을 위해 멸균 PBS 하에서 보존하고있다. 이 경우 공막엔은 절단되지 않은 경우에만 유리 몸이 제거되고 전체 공막엔이 보존됩니다. </li><li> 망막 절단 들어, 멸균 집게와 가위를 이용하여 시신경쪽으로 이동 공막엔 각막 측면에서 작은 상처 또는 절개로 시작합니다. 집게를 사용하여 공막엔 부분을 잡고 똑바로 유리체 신체에 손상을 피하고 부분으로 일부를 절단 시신경쪽으로 가위로 잘라. </li><li> 서로 붙어 때 Choroidal plaques가 공막엔부터 구분해야합니다. 맥락막 조직을 폭로 전체 공막엔 잘라. 공막엔 완전히 절단되면 시신경 가까이에 그것을 절단하여 유리체 본문의 나머지와 함께 공막엔를 구분합니다. 그림 2A와 같이 맥락막으로 덮여 유리 몸 전체 볼이 표시됩니다. </li><li> 이 멸균 집게를 사용하면 한 사람과 그것을 감지하여 부드럽게 맥락막 층을 제거포셉의 페어와 다른 그것을 제거합니다. 또는 맥락막 레이어는 가위를 사용하여 제거할 수 있지만 망막에 손상을 일으킬 수 있으므로이 방법은 이상적으로 피해야한다. 부분적으로 맥락막 레이어를 제거하고 제거를 용이하게하기 위하여 그것을 했네요. </li><li> 맥락막 층이 제거되면 망막의 투명한 레이어를 명확하게 같은 그림 2B에 표시를 보여줄 것입니다. 맥락막 층도 제거할 수있는 인테리어 Bruch의 멤브레인을 가지고 있지만 그것은 육안으로 식별하기 어렵습니다. </li><li> 마찬가지로, 그림 2C와 같이 망막 층을 제거하기 위해 두 집게를 사용합니다. 그것은 시신경 근처에 excised 경우 망막의 높은 금액을 분리 쉽습니다. 그림 2D와 같이 안구의 모든 레이어를 이제 볼 수 있었다. </li><li> 망막 조직이 제거되면, 그것은 다른 목적으로 사용될 수 있고 보전에 사용되므로 후속 단계와 조건이 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어,망막 조직은 RNA 안정화 시약 (예 RNAlater) 또는 용해 완충액 (RNA 또는 DNA를 추출 용), dispase / 트립신 (세포의 분리를위한), 고정 솔루션을 (사전에 대해 파라핀이나 10월의 조직을 포함하는 포함하는 튜브에 삽입하실 수 있습니다 immunohistochemistry). </li><li> 모든 작업 영역을 지우고 70% 이소 프로필 알코올 스프레이를 사용하여 영역을 청소하십시오. </li></ol> 3. 대표 결과 그림 1A에서 본대로 corneo-scleral의 RIM은 scleral 림과 내피 형태, 일반적으로 관통 keratoplasty에 사용되는 각막 이런 종류의 필요한 금액과 제대로 excised 각막이다. excised 각막의 앞부분은 기질이 불투명도의 존재와 함께 손상된 경우 각막은 내피 keratoplasty / 사후 층상 keratoplasty (기질의 일부​​와 내피)에 사용될 수 있습니다. 내피 층이 손상 또는 내피 세포 밀도가 &lt;2,200 세포 / mm 2면 (그 경우, 반면에alian 표준), 각막은 앞부분은 층상의 keratoplasty (앞부분은 기질의 일부​​로 상피)에 사용될 수 있습니다. 내피 세포 개수가 필요한 미만인 경우 각막이 완전히 손상된 경우 그림 1B, 3B 및 3C 또는 폐기와 같이, 그것은 연구에 사용될 수, 반면 각막은 앞쪽에 층상 keratoplasty 또는 연구에 사용될 수 있습니다. 손상 조직을 mishandling의 원인이 될 수 stromal 또는 descemet 내피 흉터로 이어지는 전에 백내장 수술은 환자의 생명 등 동안 신체 상해의 개발은 따라서위한 광학 현미경으로 슬릿 램프하고있는 모든 조직을 확인하는 것이 필요집니다 미세 흉터 / 주름 / detachments. 각막은 일반적으로 이러한 장기 배양 (약 31 ° C) 일반적으로 유럽 국가 또는 저체온증 상태에 사용 (약 4 ℃) 일반적으로 미국에서 사용됩니다.과 같은 두 가지 조건 하에서 보존 그것이 댐을 다시 생성하는 데 도움으로 우리는 장기 배양을 사용하여노인 상피 세포는 높은 해부 시간이 다시 생기를 불어 넣다 내피 세포 검사로 수술을 계획에 대한 충분한 창문을주는 사주의 저장 기간 등 각막 미생물 (세균 및 곰팡이) 및 serological 테스트를위한 충분한 시간을 제공합니다 물론 7 일간 전송 매체에 보존 할 수 있습니다. 공막엔는 모든 choroidal plaques의 부드러운 제거를 보장 부분에서 일부를 잘라 수 있습니다. 그림 4와 같이 시신경, 맥락막 또는 망막이 급격하게 절단되었을 때 유리체 액체가 나물을하실 수 있습니다. RNA 분석에 excised 경우 망막은 빨리 조직이 excised 때 RNAlater으로 보존되어야합니다. 보통 ° 신선한 Eppendorf 튜브 (안전 잠금 튜브, 2 ML)에서 C까지 사용되거나 배송 건조와 맥락막과 망막 층의 1X1 cm가 excised되고 4에서 24 시간 동안 RNAlater에 보관 후 ° C는 -80하에 보존됩니다 얼음. 망막 조직은 떨어져 홍채에서 시신경 근처에 두 집게를 사용하여 excised해야망막를 검색하는 동안 또는 기타 색소 구조와 오염을 방지하고 RNA로 즉시 보존 용기로 전송해야 ciliary 마진가 불안정 다네. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1은 좋은 품질의 각막 사이의 비교 :.) 제대로 excised 각막. 이러한 각막은 대개 4 주 장기 배양 아래에 보존되어 있습니다. 미생물 (Bactec 9,240 악기를 사용)과 형태학의 (세포 사망률 결정을 위해 trypan 파랑과 세포를 더럽히는 것과 100X 확대와 광학 현미경으로 세포를 관찰) 시험은 병원 (그림 3A)으로 운반하기 전에 수행됩니다; b)는 구부러진의 각막 어느 결국 높은 descemet의 주름과 슬릿 램프 현미경을 사용하여 검사 높은 내피 세포의 손상에 의한 이식 거부 반응이 생깁니다. 이러한 각막은 대개 입술에 사용됩니다어스 또는 폐기됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 망막 조직의 정확한 절단을 보장하기 위해 사용되는 방법.) 95 곡선 mm 또는 뭉툭한 끝 멸균 가위와 0.70 mm 치아 멸균 포셉에 의해 지배 100mm의 11X2와 24mm 칼날을 사용하여 눈의 세계에서 공막엔 분석 해 봅시다. 공막엔는 집게가 가위를 사용하여 시신경을 향해 곧장 그것을 절단과 함께 한쪽 개최하여 절단해야합니다. 맥락막 계층은 이제 쉽게 볼 것이다; b)는 0.70 밀리미터 치아 멸균 포셉에 의해 통치되고이 100mm의 11X2를 사용하여 맥락막은 기본 투명한 망막 레이어를 드러내하는 차별을 찢어에 의해 제거되며 C) 투명 망막 계층은 매우 조심스럽게 근처 excised됩니다 같은 집게를 사용하여 유리체 유체의 배설없이 시신경. 포셉 모두 망막의 각 측면을 보유해야하며 조직은 부드럽게 인제를 제거한다G는 시신경 근처 망막 조직의 좋은 금액을 얻기 위해, 각막쪽으로 이동. 조직은 다양한 크기로 절단 및 분석 실험에 사용될 수 있으며, D) 각막 제거 따라 눈의 다른 레이어는이 그림에서 볼 수 있습니다. 맥락막의 시신은 눈의 다른 부분을 손상시키지 않고 망막에 의해 첫번째 다음에 제거됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 광학 현미경 100X 배율 아래에서 볼 세포 밀도 및 형태의 다른 유형의 비교.) 좋은 내피 세포 밀도 (&gt; 2,200 세포 / mm 2) 조직 형태 (이하 다형성, 낮은 변성없고 영양 장애와 0 % 이식에 적합한 각막의 사망률), b)는 가난한 내피 세포 밀도 (약 1200년부터 1400년까지 세포 / mm 2) 조직 형태 (매우 높은 다형성과 degen약 30-40% 전반적인 사망률과 함께 세포의 eration)는 trypan 블루 염색법 후에 관찰되며, 눈의 세계에서 각막를 검색하는 동안 C) 내피 세포의 일부는 내피 시트의 분리로 인해 손상됩니다. 이것은 trypan 파랑에 의해 지역 스테인드에서 세포 사망을 관찰하여 확인되며 D) descemet의 주름은 벤딩 교차 각막 장력을 만들고, 절단 시에 강렬한 등의 악기를 사용하여 인해 각막의 mishandling로 형성된다. 그림은 각막의 주변 및 광학 영역 사이에있는 두꺼운 개발 의원성 폴드를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="그림 4" /> 맥락막 및 망막 조직에 그림 4. 손해 결국 각막을 절개 동안 유리체 유체의 배설로 안내합니다. 망막은 어렵게 양질의 휴지 부 소비세에 만드는 유리 몸에 연루 받게오염을 thout. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="표 1" /> 표 1. Fondazione Banca에서 2009 년과 2010 동안 인간의 안구 글로브를 사용하여 수행한 활동의 범위 요약 Occhi을 (베네치아, 이탈리아) Degli. 조직의 약 60 %는 따라서 과학 및 의학 연구에 (40 %) 안구 글로브의 높은 숫자를 떠나, 이식에 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="보충 그림 1" /> 보충 그림 1. 인간의 눈을 5 해부학. 인간 안구의 다른 부분은 조직의 정확한 위치를 수행하는 데,이 그림에 표시됩니다.

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</ol>

저자는 이익 갈등이 없습니다.

, 정확한 절단 및 각막 및 망막 조직의 적절한 보존 모두 같은 내피 손상 또는 descemet의 폴드의 높은 숫자 등 사소한 결함이 그래프트 온도 변경 반면 각막의 장애 또는 mishandling 것은 망막 조직의 무결성을 손상 수로 이어질 수있는 등의 중요합니다. 본 논문의 목적은 각막 및 망막 조직이 이식 또는 연구 목적으로 사용을 침해할 수있는 손해 또는 변경을 유도하지 않고, 최적의 격리 수있는 방법을 보여주는 것입니다. 필요한 최소 셀 밀도 (&gt; 2,200 세포 / mm 2), 이러한 셀의 크기로 좋은 형태, 세포 테두리와 각막의 좋은 투명성과 적당한 두께와 함께 영양 장애 부재의 구조, 낮은 변성은위한 조직 적합하다 특징입니다 이식. 메스 블레이드가 거의 사용 또는 다른 악기를 달아 사용하는 경우는 각막에 손상을뿐만 아니라, furt 만드는 유리 몸하지 않습니다다른 조직 그녀의 절단 더 어렵습니다 (그림 4). 망막은 투명한 조직 및 유리체 액체는 그것으로 출...

각막 및 망막의 절단을위한 재료. <table border="1"><tbody><tr><td> 제품 설명 </td><td> 치수 </td><td> 회사 소개 / 연구원 </td></tr><tr><td> 경비가 삼엄 메스 일회용 </td><td> 블레이드 사이즈 15 </td><td> 스완 - 모튼 </td></tr><tr><td> 멸균 붕대 </td><td> 5cm는 X 5cm, 8 층, 5 개 </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> 멸균 일회용 의료 타올 </td><td> 35 X 50cm </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> 멸균 가위 </td><td> 블레이드 24mm / 전체 길이. 무딘, 95mm 곡선 </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> 멸균 포셉 </td><td> 스테인레스 스틸 -100 mm 11 X 2는 0.70 mm 치아에 의해 지배 </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> 각막 발톱 - 일회용 의료 기기 </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> 준비 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> [10X] 900 ML D / W (증류수) 100 ML PBS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td></tr><tr><td> NA-thiosulphate </td><td> PBS [1X] 1 리터 1 GM 나 - thiosulphate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 1리터 D / W 5 GM I-PVP </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td></tr></tbody></table> 표 2. 테이블은 각막 및 망막의 절단과 그들로부터받은 회사를 위해 사용되는 재료에 대해 설명합니다. 저장 매체에 대한 자료 (2000 ML). <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> MEM(1X) 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10ml / L) </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2mM (10ml / L) </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> antimycotic / 항생제 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5955-20ML </td><td> 10ml / L </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2퍼센트 (20 ML / L) </td><td> 40 ML </td></tr></tbody></table> 표 3. 저장 매체에 대한 자료. 저장 매체의 작성 항아리에 위에 주어진대로 특정 농도를 사용하는 모든 재료를 넣고 잘 섞는다. 그들을 필터링연동 펌프의 도움으로 0.2 미크론 필터의 기공 크기 (Millipore, 밀라노, 이탈리아)을 사용합니다. RT에서 병에 매체를 보존. 전송 매체에 대한 자료 (2000 ML). <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> MEM (1X) 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10 ML / L) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2mM (10 ML / L) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2퍼센트 (20 ML / L) </tD&gt; <td> 40 ML </td></tr><tr><td> Dextran t500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 GM / 리터) </td><td> 120g / L </td></tr></tbody></table> 표 4. 전송 매체를위한 자재. 전송 매체의 준비 MEM의 ~ 1.5 리터에 Dextran 6 % 추가하고 밤새 그것을 두십시오. 미디어 성분의 나머지 부분을 추가하고 진공 펌프를 사용하여 0.2 미크론 필터 (Millipore, 밀라노, 이탈리아)를 사용하여 필터링합니다. RT에서 병에 매체를 보존.

위한 간편한 기법<em&gt; 현장에서</em인간 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 내장 적출의&gt; 절단

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

핵의 제거는 세계의 나머지 부분은 그대로두고 시체 같은 기증자로부터 눈의 세계를 검색하는 과정입니다. 절단은 안구 세계에서 그것이 별도의 가공하여 안구 조직, 특히 각막의 검색을 말합니다. 내장 적출은 망막으로 여기 언급된 내장을 제거하는 과정입니다. 안구 지구본이 각막, 공막엔, 유리 몸, 렌즈, 홍채, 망막, 맥락막, 근육 등 (Suppl. 그림 1)으로 구성되어 있습니다. 환자가 각막 손상을 앓고되면 각막은 제거되어야하고 건강한 한 keratoplastic 수술로 이식해야합니다. 유전 질환이나 망막의 기능 결함은 상상력을 위태롭게 수 있습니다. 인간 안구 글로브 같은 눈 뱅킹, 인간 각막이나 공막엔 이식과 안구 조직에 관한 연구 등 다양한 수술 절차에 사용될 수 있습니다. 그러나, 인간의 각막 및 망막 절단에서 사용할 약간의 정보는 아마도 리터에 의한있다인간의 조직에 imited 접근성. 유사한 절차를 설명하는 연구의 대부분은 동물 모델에서 수행됩니다. 연구 과학자들은 인간의 눈 개발, 항상성 및 기능에 대한 지식을 확장하기 위해 적절하게 해부하고 잘 보존되어 안구 조직의 가용성에 의존하고 있습니다. 우리는 그들 중 약 40 % (표 1) 연구 목적으로 사용되는 들락 거 렸고 안구 글로브의 높은 금액을받을 수 있으므로, 소비세에 기술을 정의하고 이러한 조직에서 실험의 엄청난 금액을 수행하고 정기적으로 그것을 보존하실 수 있습니다. 각막은 망막에 빛의 전송을 가능하게하고이 ​​목적을 위해 항상 투명성 좋은 정도를 유지한다 avascular 조직이다. 각막 내에 줄기 세포의 저수지입니다 limbus 지역은 상피 세포의 재건을 도움이 각막 투명성과 선명도를 유지하는 결막의 전면에 자라난을 제한합니다. 크기와 일<html> 그 중 하나의 변화가 산만, 불분명 비전으로 이어질 수로 각막의 ickness는 분명한 비전에 대한 중요합니다. 각막은 5 층의 구성, 내피) 상피, B) 보먼의 계층, C) 기질, D) Descemet의 멤브레인 및 전자). 모든 레이어는 분명한 비전에게 4,5,6을 보장하기 위해 제대로 작동해야합니다. 맥락막은 Bruch의 막에 의해 내부에 묶여 공막엔와 망막 사이의 중간 튜닉,하고 눈을 혈액의 흐름을 책임지고 있습니다. 맥락막은 또한 망막 5,6의 바깥 레이어로 온도 및 공급 영양 조절하는 데 도움이됩니다. photoreceptive 부분과 아닌 부분 수용 : 망막은 안구 세계 (Suppl. 그림 1)의 뒤쪽을 커버하고 두 부분으로 구성되어 신경 조직의 계층입니다. 망막은 각막과 렌즈로부터 빛을 수신하는 데 도움이 결국 시신경 5,6의 도움을 받아 뇌로 전달 화학 에너지로 변환합니다. 이러한 조직이 목표로 연구 목적을 위해 불가 결한대로 ove_content은 &quot;&gt; 본 논문의 목적은 인간의 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 해부를 위해 프로토콜을 제공하는 것은. 인접 조직과 교차 오염 방지와 RNA의 무결성을 보존하는 것은 기본적인 중요하다 에서는 (i) 안구 조직의 transcriptome, (2)를 특성화 재생 의료 프로젝트를 위해 줄기 세포를 분리, 그리고 (iii) 영향 / 일반 과​​목에서 조직 간의 histological 차이를 평가. 본 논문에서 우리는 기술을 설명하는 현재 제거하는 데 사용할 각막, 안구 세계에서 맥락막과 망막 조직은. 자 인간 안구 지구본과 각막 및 망막 조직의 절단의 절개를 위해 상세한 프로토콜을 제공합니다. 첨부된 동영상은 연구자들이 검색을 위해 적절한 기술을 배우는 데 도움이됩니다 정기적으로 찾기 어려운 귀한 인간의 조직.

신문은 인간의 시체 같은 기증자의 안구 세계에서 망막 조직을 내장을 들어낸하는 간단한 소비세 각막에 대한 기술과 설명합니다. 기술은 안구 세계의 다른 조직을 손상시키지 않고 이식, 수술이나 연구 목적을 위해 사용되는 소비세 양질의 조직에 도움이됩니다 여기서 설명했다.

적출(Enucleation)은 안구의 나머지 부분을 손상시키지 않고 카다버 기증자로부터 안구를 회수하는 과정입니다. 절제(Excision)는 ...

오늘 우리는 기증된 인간의 안구에서 각막과 망막 조직을 적출하는 간소화된 기술을 시연하겠습니다. 본 영상에서 설명하는 기술은 안구의 다른 조직을 손상시키지 않으면서 이식, 수술 및 연구 목적으로 사용될 고품질의 조직을 적출하는 데 도움이 될 것입니다. 18년의 전문 지식과 매년 수많은 각막 이식 경험을 바탕으로, 우리는 새로운 기술을 개발하고 매일 숙련도를 향상시킴으로써 업무의 높은 표준을 유지해 왔습니다.이를 위해 먼저 각막을 적출한 다음, 망막을 적출합니다. 각막은 빛이 망막으로 전달될 수 있게 하는 무혈관 조직이며, 이 목적을 위해 항상 높은 수준의 투명도를 유지해야 합니다. 각막은 상피, 보우만층, 기질, 데스메막, 내피의 다섯 가지 층으로 구성됩니다.각막이 손상된 경우, 적절한 공여 각막을 통해 교체할 수 있습니다. 맥락막은 공막과 망막 사이의 중간층으로, 내측은 브루스 막(bruss membrane)으로 경계 지어지며 안구 내 혈류를 담당합니다. 맥락막의 적절한 적출은 망막 제거만큼이나 중요합니다.망막은 각막과 수정체로부터 들어오는 빛을 받아들여 최종적으로 뇌로 전달되는 화학 에너지로 변환하는 역할을 합니다. 시신경은 투명하고 섬세하므로, 양질의 조직을 얻기 위해서는 체계적으로 적출해야 합니다. 층류 작업대(lanar airflow cabinet)의 전원을 켭니다.70% isop alcohol을 사용하여 층류 hoods(lamellar flow hood)를 세척하십시오. 수술용 캡, 마스크, 멸균 장갑 및 팔 토시와 같은 개인 보호구를 착용하십시오. 무균 조작법을 사용하여 멸균 타월과 사전 멸균된 기구 트레이를 배치함으로써 멸균 구역을 설정하십시오.멸균 기구 팩을 무균적으로 개봉하고, 오염이 되지 않도록 주의하며 멸균 구역 위로 덮어 씌웁니다. 모든 멸균 재료와 기구를 멸균 구역 내에 배치하고, 안구를 담은 안구 용기를 멸균 구역의 가장자리와 거리를 두어 배치합니다. 사용 편의를 위해 미리 준비한 보존액이 든 병에 라벨을 붙이고, 요오드 폴리올 파이로 리드, 황산나트륨 및 멸균 인산염 완충 식염수 용액을 배치합니다.멸균 공급 장치 밖에서, 4°C의 냉장고에 보관된 안구 조직과 용액이 일반 상온에 도달하도록 둡니다. 반복적인 가온 또는 냉각 사이클을 피하십시오. 멸균 집게를 사용하여 안구 보존 용기에서 거즈와 스펀지를 제거합니다.안구를 뚜껑 위에 놓고 추가 붕대를 제거합니다. 시신경이 포함된 안구를 조심스럽게 집어 들어 멸균된 IPVP에 담급니다. 멸균된 IPVP에서 안구를 2분 동안 세척합니다.안구를 멸균된 티오황산나트륨 용액에 1분 동안 담급니다. 안구를 멸균된 인산염 완충 세포주 용액(phosphate buffer cell line solution)으로 옮겨 사용 시까지 유지합니다. 층류 작업대(lanar airflow hood) 아래에서 안구를 PBS로 세척하여 제거한 후 멸균 구역 내에 배치합니다.스테로이드를 사용하여 안구를 감싸되, 각막과 각막으로부터 약 5mm 거리의 공막은 노출된 상태로 둡니다. 안구는 손으로 가볍게 잡을 수 있습니다. 멸균 가위로 적절한 압력을 유지하며, 각막이 손상되지 않도록 주의하여 남아 있는 결막을 모두 제거합니다.일회용 메스 날을 사용하여 각막연(limbus) 부위에서 3~4mm 거리로 공막 절개를 수행합니다. 그 다음, 하부의 포도막 조직을 천공하거나 각막의 정상 곡률을 변형시키지 않도록 주의하며 절개선을 360도 확장합니다. 유리체가 유출되지 않도록 주의하면서 네 군데의 큰 절개선을 만들고 네 개의 작은 틈을 남깁니다.다른 조직이 제거되지 않도록 주의하며 네 개의 절개 부위를 모두 자릅니다. 작은 공막판(scleral plaques)이 존재할 경우 절개가 어려울 수 있으므로, 미세수술 가위로 공막 절제를 완전히 마쳤는지 확인하십시오. 이 작업은 맥락막 망막과 유리체에 손상을 주지 않고 수행되어야 합니다.절개 부위를 검사하여 완전히 절개되었는지 확인합니다. 절개가 정확하게 수행되었다면, 각막 공막 테두리는 각막과 일치하는 지점에서만 모양체에 부착되어 있습니다. 안구를 멸균 패드의 중앙 근처에 놓습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각막 제거를 완료합니다.공막 가장자리를 고정하고, 안구 광채(ocular glow)로부터 각막 공막 가장자리를 절제합니다. 각막 공막 버튼(corno scleral button)에서 남아 있는 인접 조직을 조심스럽게 분리합니다. 각막 공막 가장자리를 당길 때 각막에 가로 방향의 장력이 가해지거나, 전방 위로 다시 떨어지지 않도록 주의하십시오.저장액을 사용하여 각막의 내피세포 밀도를 확인하고, trip blue 염색을 약 1분 동안 실시하여 세포 사멸 여부를 확인합니다. 멸균 거즈로 trip blue 염색약을 제거하고 각막을 멸균 PBS로 세척합니다. 이를 sucrose 용액이 채워진 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.이 용액은 저장성 환경을 조성하여 세포를 시각적으로 식별하는 데 도움을 줍니다. 그 후 광학 현미경의 100배 배율에서 세포 수를 측정하여 mm²당 세포 수로 계산합니다. 일반적으로 세포 밀도와 더불어 세포 간 경계, 다형성 퇴행, 이영양성 및 세포 사멸과 같은 형태학적 특성을 관찰합니다.각막 두께는 적출된 각막의 우수한 투명도와 더불어 이식 시 중요한 고려 사항입니다. 멸균된 각막 CLO를 사용하여 공막 가장자리에 각막을 고정하고, 공막 가장자리를 고정하기에 충분한 구멍이 확보되도록 각막 CLO를 구부린 후, 각막 클로브를 이용해 각막 공막 가장자리를 상온에서 미리 준비한 각막 보관 배지로 옮깁니다. 그 후 각막은 4주간의 보존 기간 동안 31 degree SIUs에서 보관되어야 합니다.저장 매체는 B 9 2 4 0 장비를 사용하여 여러 가지 미생물학적 테스트를 거칩니다. 저장 과정에서 각막은 이식에 필요한 일반적인 크기보다 더 두꺼워집니다. 안구은행에서는 두께를 줄이기 위해 D 팽창제(swelling agents)를 사용합니다. 각막을 정상 크기로 되돌리기 위해 6%Dextron T 500과 운송 매체를 사용합니다.망막 적출 전, RA free 환경을 조성하기 위해 RNA app으로 멸균 기구를 세척하십시오. 멸균 구역을 준비하고 안구가 온전한 상태이며 각막과 공막 가장자리만 제거되었는지 확인하십시오. 유리체 유출이 발생하면 망막 조직 제거가 어려워집니다.기증자의 연령이 65세 미만인 경우, 혈청학적 검사 후 수술 목적으로 공막을 70% alcohol 내에서 보존합니다. 이 경우 공막을 절단하지 않고 유리체만 제거하며, 망막 절제술을 위해 공막 전체를 보존합니다. 멸균 포셉과 가위를 사용하여 공막의 각막 측 근처에서 작은 절개를 시작하여 시신경 방향으로 진행합니다.멸균 핀셋으로 공막 부위를 잡고, 유리체에 손상을 주지 않도록 주의하며 가위로 시신경 방향을 향해 부분적으로 절개합니다. 맥락막 플러그는 공막에 붙어 있으므로 이를 공막에서 분리해야 합니다. 공막 전체를 절개하여 맥락막 조직을 노출시킵니다.공막을 완전히 절개한 후, 시신경 근처를 절단하여 공막을 나머지 조직과 분리하면 유리체를 덮고 있는 맥락막 층 전체가 보입니다. 두 개의 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 RNA-free append-off 튜브에 RL 버퍼 2 ml를 채웁니다. 한 쌍의 핀셋으로 시신경을 잡고 다른 핀셋으로 맥락막을 제거하여 맥락막 층을 조심스럽게 분리합니다.맥락막을 부분적으로 분리하고 제거하기 쉽도록 절개합니다. 망막에 손상을 주지 않도록 주의하며 가위를 사용하여 맥락막 층을 절개할 수 있습니다. 절제된 맥락막 층을 RNA later 용액에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 보관합니다.망막 조직을 노출시키기 위해 모든 추가 맥락막을 제거합니다. 맥락막 층 전체가 제거되면 투명한 망막 층이 보일 것입니다. 분명 맥락막 층에는 내부의 브루크 막(brus membrane)이 있으며, 이 또한 제거할 수 있으나 육안으로는 확인하기 어렵습니다.마찬가지로, 두 개의 핀셋을 사용하여 망막층을 제거합니다. 시신경 근처에서 절제하면 많은 양의 망막을 쉽게 분리할 수 있습니다. 이제 눈의 모든 층을 확인할 수 있습니다.적출한 망막을 RNA later 용액에 넣고 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 70% 이소프로필 알코올을 사용하여 작업 영역을 세척하십시오. Trypan blue로 염색된 내피세포는 도립 현미경의 100배 배율에서 관찰할 수 있습니다.제곱밀리미터당 200개 이상의 세포를 보유한 적합한 각막을 통상적으로 추후 사용을 위해 보존합니다. 품질을 보통에서 우수함까지 등급별로 분류하는 것은 비교 연구에 도움이 됩니다. 일반적으로 이식 준비가 된 각막의 두께와 투명도를 기록한 후, 적합한 각막을 각막 전체를 이식하는 관통성 각막이식술에 사용합니다.세포 사망률은 청색으로 염색된 세포를 관찰하여 확인하며, 사망한 세포의 백분율로 평가합니다. 보존 중 전체 세포 사망률이 2% 이상이면 부적합한 것으로 간주합니다. 세포 밀도가 제곱밀리미터당 2200개 미만이거나 사망으로 인한 손상이 있는 경우, 각막은 전층 각막 이식술에 사용될 수 있습니다.전방 외상이 손상되었으나 각막의 내피세포 밀도가 양호한 경우, 해당 각막을 후면 층판 각막이식에 사용할 수 있습니다. 장기 배양 과정에서 일반적으로 각막의 두께가 증가합니다. 운송 배지는 각막이 정상적인 모양과 구조를 회복하도록 돕습니다.또한, 장기 배양은 각막의 재상피화를 돕고 보관 기간이 길기 때문에 적절한 기증자 선택에 도움이 됩니다. 미생물학적 및 혈청학적 검사를 수행할 수 있습니다. 이는 수술 일정을 조정할 충분한 시간을 제공하며, 사후 시간이 너무 길어 확인이 불가능한 경우 내피세포 밀도와 형태를 확인하는 데 도움이 됩니다.따라서 설명된 절차를 따르면 다른 조직에 손상을 주지 않고 각막을 절제할 수 있습니다. 만약 각막이 이식에 적합하지 않은 경우, 안구 표면 질환 연구를 위한 새로운 배지와 보존 조건 개발, 각막줄기세포 분리 및 각막에 대한 약물 효과 연구 등의 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 망막의 경우, 중심 조직에 의한 RNA 샘플의 교차 오염을 방지하고 RNA의 무결성을 보존할 수 있으며, 이는 매우 중요합니다.연구 목적으로 필수적인 이 조직들은 안구 조직의 전사체를 특성화하고, 재생 의학 프로젝트를 위한 줄기세포를 분리하며, 정상 피험자와 환자 유래 조직 간의 조직학적 차이를 평가하는 데 사용됩니다. 망막 조직이 제거되면 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 이에 따라 보존에 사용되는 후속 단계와 조건이 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 망막 조직은 RNA 또는 DNA 추출을 위해 r nator나 thisis 버퍼와 같은 RNA 안정화 시약이 포함된 튜브에 넣거나, 세포 분리를 위해 displaced 또는 trypsin에 넣을 수 있습니다.면역조직화학염색을 위해 조직을 파라핀이나 OCT에 매립하기 전 고정액 처리 단계입니다. 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 연구에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

이 비디오는 쥐 모델에서 안구 표면 염증 및 마이봄샘 기능 장애를 유도하는 방법을 보여줍니다. 면역원을 사용하여 마우스의 면역 체계를 자극한 후 동일한 면역원으로 재자극하면 안구 표면 염증이 촉진되어 호중구에서 생성된 응집체를 통한 마이봄샘 분비물이 막히고 안구건조증을 유발합니다.

쥐 모델에서 안구 표면 염증을 유도하는 방법

또한 안구 적출술라는 눈의 제거는, 그것은 돌이킬 수없는 부분 (단안) 또는 전체 (쌍안) 시력 손실을 유발하기 때문에 포유류의 시각 시스템에 따라 시각, 크로스 모달, 발달 가소성의 측면을 연구하기위한 유용한 전략을 제공합니다. 여기에서 우리는 생체 안구 적출술에서 수행 할 수있는 높은 재현성 및 간단한 방법을 설명합니다.

높은 재현성과 단순 명료 한 방법이 수행하는 생체 안구 탈핵

이 프로토콜의 목표는 사후 적출된 돼지 눈에서 온전한 유리체핵과 피질을 전체적으로 분리하는 효과적인 기술을 보여주는 것입니다.

Vitreodynamic 분석을위한 항목의 유리체 유머 해부

이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.

설치류 눈의 미세 해부

우리는 인간의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE)를 효율적으로 분리하고 RPE의 조직 학적 및 형태 측정 분석을 위해 전체 RPE / 맥락막 플랫 마운트를 생성하는 방법을 설명합니다.

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.

마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

학습하세요 인간 사체 기증자 안구에서 각막 및 망막 조직을 절제하는 간소화된 기법을. 18년의 전문성을 바탕으로 조직 품질을 보존하고 이식 및 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

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