토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

이 비디오의 전체적인 목적은 토양에서 추출한 글루코사민과 뮤이산(muic acid)의 Aldon nitrile acetate 유도체에 대한 GC 기반 분석의 상세한 설명을 제공하는 것입니다. 이 과정은 유기 폴리머를 분해하여 글루코사민과 뮤이산을 방출시키는 산 분해 단계로 시작됩니다. 그 후, 혼합 용액으로부터 단량체 아미노당을 분리 및 정제합니다.

이어지는 유도체화 단계에서는 이러한 아미노당을 가스 크로마토그래피 분석이 가능한 휘발성 알돈 니트릴 아세테이트로 전환합니다. 절차의 마지막 단계는 액체-액체 추출 및 GC 측정입니다. 최종적으로, 불꽃 이온화 검출기를 이용한 GC 분석을 통해 myo 및 acetol과 methyl glutamine 표준물질 사이에서 용출되는 알돈 니트릴 아세테이트 아미노당의 기선 분리 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술이 다른 방법보다 갖는 주요 장점은 정밀도, 민감도, 간편함, 우수한 색도 그래픽 분리능 및 시료 보관 시의 안정성 사이의 균형이 최적화되어 있다는 점입니다. 이 방법은 안정적인 토양 탄소 풀에 대한 SSE 미생물의 기여도와 같이 전 지구적 탄소 순환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 토양 내 미생물 잔해의 축적에 대한 통찰과 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 해양 시스템, 생물학적 조직, 그리고 외계 샘플과 같은 다른 매질에도 적용 가능합니다.

본 프로토콜을 시작하려면 현장 수집 후 토양 시료를 동결 건조하고, 볼 밀 토양 분쇄기나 막자와 유발을 사용하여 토양 시료를 분쇄 및 균질화하십시오. 분쇄된 토양 시료를 25 milliliter 가수분해 플라스크에 정량하여 넣습니다. 각 가수분해 플라스크에 6 molar 염산 10 milliliters를 넣고, 질소 가스로 채운 후 캡을 단단히 닫으십시오.

인큐베이터에서 105°C로 8시간 동안 가수분해합니다. 자동 타이머 스위치를 사용하여 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내어 실온까지 냉각합니다.

각 플라스크에 내부 표준 물질인 myo acetol 100 µL를 첨가합니다. 플라스틱 깔때기가 200 mL 배형 플라스크로 배수되도록 설치한 후, 가볍게 흔들어 섞어줍니다. 이때 안정성을 위해 표준 테이퍼 사이즈 24 40 지상 유리 조인트를 플라스틱 컵 위에 거치합니다.

Watman 2번 정성 분석용 원형 여과지를 4등분으로 접어 깔때기에 넣습니다. 각 가수분해 플라스크를 가볍게 흔든 후 슬러리를 깔때기에 붓습니다. 각 시료를 여과하려면 약 45°C에서 진공 회전 증발기를 사용하여 여과액을 건조하십시오.

각 페어 플라스크의 건조 잔해물을 3~5 mL의 물로 현탁시켜 40 mL 테플론 튜브에 붓습니다. 두 번째 물 분량을 사용하여 각 플라스크를 세척합니다. 금속 이온과 기타 유기 분자를 침전시키기 위해 1 M 수산화칼륨 용액을 사용하여 시료의 pH를 6.6에서 6.8로 조정합니다. 그다음 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다.

상층액을 40 mL 유리 튜브에 붓고 튜브 입구를 파라필름으로 덮어 상층액을 동결시킨 후, 파라필름에 구멍을 뚫습니다. 동결된 상층액을 동결 건조하여 모든 액체를 제거합니다. 상층액이 건조되면, 잔류물을 3 mL의 건조 메탄올로 용해합니다.

튜브 캡을 단단히 닫고 충분히 볼텍싱한 후, 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 염을 침전시키기 위해 상층액을 3 mL 원추형 반응 바이알로 옮기고, 45 °C의 급속 진공 농축기(VA machine) 또는 완만한 질소 가스 흐름 하에서 완전히 증발시킵니다. 증발이 완료되면, 각 바이알에 회수 표준물질과 methyl glutamine 100 µL 및 물 1 mL를 첨가합니다.

그 다음 유도체화 작업을 시작하기 전에 시료를 동결하십시오. 서면 프로토콜에 기술된 대로 표준물질을 제조한 후, 시료와 표준물질을 모두 동결 건조하십시오. 32 mg/mL의 hydroxyl amine hydrochloride와 40 mg/mL를 포함하는 유도체화 시약을 준비하십시오.

퓨린 메탄올에 용해된 4-디메틸아미노퓨린입니다. 유도체화 시약 300 µL를 각 반응 바이알에 넣고, 뚜껑을 단단히 닫은 후 완전히 볼텍싱합니다. 밀폐된 바이알을 75~80 °C의 항온수조에 35분 동안 둡니다.

바이알을 항온수조에서 꺼내 실온으로 식힙니다. 그런 다음 3 mL 반응 바이알 각각에 무수초산 1 mL를 첨가하고, 뚜껑을 단단히 닫은 후 볼텍스 믹서로 충분히 혼합합니다. 이어서 75~80 °C 항온수조에서 25분 동안 2차 배양을 수행합니다.

바이알을 항온수조에서 꺼내 실온으로 냉각합니다. 분리와 측정을 시작하려면 각 튜브에 1.5 milliliters 디클로로메탄을 첨가한 후 볼텍싱합니다. 각 바이알에 1 molar 염산 1 milliliter를 첨가하고 충분히 볼텍싱한 다음, 두 층이 분리될 때까지 용액을 그대로 둡니다.

상층의 수성층을 흡입하여 제거합니다. 1000 µL 피펫을 사용하여 동일한 방식으로 유기층을 3회 추출하되, 마지막 세척 단계에서는 1 mL의 물을 사용합니다. 모든 상층 수성층이 완전히 제거되었는지 세심하게 확인하십시오.

45°C의 급속 VAP 또는 질소 가스 기류를 사용하여 최종 용액을 건조하고, 각 시료를 300 µL의 ethyl acetate hexane에 용해합니다. 이를 소량 인서트가 포함된 2 mL 호박색 스크류 캡 바이알로 옮기고 캡을 단단히 닫아, 서면 프로토콜에 명시된 대로 DB five와 같은 퓨즈드 실리카 비극성 모세관 칼럼과 불꽃 이온화 검출기를 이용한 가스 크로마토그래피로 정량 분석합니다. 표준 분석 및 가동 후, acetol glucosamine 및 mu amic acid 유도체는 250°C에서 용리되고 end methyl glutamine은 270°C에서 용리되도록 운반 가스의 유량을 조정합니다.

가스 크로마토그래피 분석 후, GC 주입구를 250 °C로 설정하고 오토샘플러를 사용하여 1 µL의 30:1 분할 주입을 수행합니다. 이 절차의 마지막 단계로, 서면 프로토콜에서 논의된 크로마토그래피 및 분광법 방법을 사용하여 유도체 검증을 수행합니다. 표준 줄기 및 토양 시료에서 추출한 글루코사민과 요산의 분석 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 글루코사민과 뮤산 외에도, 적용된 표준물질의 정확한 양과 두 가지 내부 표준물질 각각의 반응 계수를 기반으로 하는 이 방법을 통해 글루코사민의 두 이성질체인 오사민과 갈락토사민을 동시에 정량할 수 있습니다.

토양 시료 내 이러한 바이오마커의 양을 측정할 수 있습니다. 또한 유도체화 과정을 정성적으로 모니터링하기 위해 회수 표준물질(recovery standard)이 사용되었습니다. 알돈 니트릴 아세테이트(aldon nitrile acetate), 유도체화된 글루코사민(derivate glucosamine) 및 뮤산(muic acid)의 형성 계획도가 여기에 제시되어 있습니다.

1번은 니트릴 반응을 나타내며, 2번은 아세틸화를 나타냅니다. 전자 이온화 시 형성되는 이온 파편의 제안된 구조는 다양한 동위원소가 도입된 시료들의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었습니다. 여기에서는 글루코사민 알돈 니트릴 아세테이트 유도체의 주요 이온이 서로 다른 시나리오에서 나타내는 질량 이동을 보여줍니다.

본 예시에서는 표지되지 않은 시약뿐만 아니라 동위원소 표지된 무수 아세트산 및 동위원소 표지된 글루코사민을 사용하여 준비하였습니다. 화학 구조식의 별표는 중동위원소 원자 또는 동위원소 그룹을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, 유도체화 과정 동안 엄격하게 무수 조건을 유지하는 것이 중요합니다.

이 단계에서 사용하는 유기 용매와 유리 기구는 모두 건조된 상태여야 합니다. 많은 업체에서 무수 용매를 판매하고 있지만, 보유 중인 용매는 황산마그네슘과 같은 건조제 가 포함된 컬럼을 통과시켜 건조할 수 있습니다. 이 절차 이후, 거대 생물의 발달 후 생존 개체와 사후 개체를 구분함으로써 거대 생물이 어떻게 반응하는지, 또는 토양 내 탄소나 질소의 회전 및 축적이 어떻게 이루어지는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 비율 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 거시 생태학, 토양 생물학 및 화학 분야의 연구자들이 자연 또는 관리되는 육상 시스템에서 토양 유기물에 대한 거시적 기여와 탄소 격리를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.