Name: 토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivatized 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 학습하세요 토양에서 글루코사민과 무라믹산을 추출하여 알도니트릴 아세테이트 유도체로 전환하고 기체크로마토그래피로 분석하는 방법을. 미생물 잔류물 정량에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 검사서 오대호 Bioenergy 연구 센터 (DE-FC02-07ER64494 과학 검사서 BER 사무실)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 박사 Xudong 장 및 프로토콜을 마무리 유용한 기술적인 토론과 소중한 의견에 대한 자신의 그룹 회원들에게 감사를드립니다.

1. 샘플 준비 및 산성 추출 <ol><li> 동결 건조 토양 샘플 필드 컬렉션 후. </li><li> 볼 밀, 토양 연삭기, 또는 박격포와 유봉을 사용하여 토양 샘플을 갈아서하고 homogenize. </li><li> 25 ML의 가수 분해 플라스크에 토양 샘플을 (&gt; 0.3 MG N을 포함)의 무게. </li><li> 각 가수 분해 플라스크에 10 ML 6M HCL을 추가 단단히 N 2 flasks의 가스, 뚜껑을 채운다. </li><li> 자동 타이머 스위치를 사용하여 8 시간 105 ° 인큐베이터에서 C에서 Hydrolyze. </li></ol> 2. 샘플 정제 <ol><li> 인큐베이터에서 flasks 제거, 실온에 좋아. </li><li> 소용돌이로 믹스, 각 플라스크 ~ 100 μL 내부 표준 myo-이노시톨을 (물 1 MG ML -1) 추가합니다. </li><li> ST / NS 24 / 안정성을위한 플라스틱 컵에 설정된 40 관절, 200 ML 배 모양의 flasks로 배수 플라스틱 유입​​ 경로를 설정합니다. </li><li> 공간 워트 먼지 # 2 질적 동아리 (11cm 직경) 숙소와 퍼널을에 세트로. </리&gt; <li> 소용돌이 각 가수 분해 플라스크를, 그리고 (당신이 더 이상의 물을 ~ 3 ML 각 플라스크를 헹굴 수 있음) 필터링 깔때기에 슬러리를 붓는다. </li><li> ~ 45 ° C, 신청 진공에서 회전 증발기를 사용하여 여과액 말리. </li><li> 3 ~ 5 ML 물 (필요한 경우 초음파 목욕을 사용) 각 배 플라스크에서 말린 잔류물을 Resuspend, 그리고 40 ML 테플론 튜브에 부어, 물과의 두 번째 나누어지는로 플라스크를 씻어. </li><li> 6.8 석출물 금속 이온과 다른 유기 분자로 1M 코이 솔루션을 사용하여 - 6.6로 산도를 조정합니다. </li><li> 10 분 2000 rcf에서 원심 분리하여 precipitates 제거합니다. </li><li> 40 ML 유리관에 뜨는을 붓고, -20에서 튜브 parafilm와 개방, 동결 ° C를 포함, 다음 parafilm에 구멍을 찌르지. </li><li> 모든 액체를 제거하는 냉동 뜨는을 동결 건조. </li><li> 3 ML 건조 메탄올과 찌꺼기를 해산 (원하는 경우 초음파 목욕을 사용하여) 철저 vortexing, 캡 튜브, 그리고 이주 10 분 동안 2,000 rcf에서 원심 분리기소금 아웃. </li><li> 3 ML 원뿔 반응 유리병에 뜨는 전송, 45 ° C (또는 원하는 경우 건조 질소 가스의 부드러운 스트림 이하)에서 RapidVap 기계 건조에 증발. </li><li> 각 유리병에,, 100 μL 복구 표준 N-methylglucamine (물 1 MG ML -1)과 1 ML H 2 O를 추가 -20시 유리병의 parafilm와 입을, 동결 ° C를 포함, parafilm을 구멍이 후 건조 동결 . </li><li> 표준을 만들기 : 100 μL muramic 산성 (메탄올의 0.5 MG ML -1), 100 μL 글루코사민 (물 1 MG ML -1), 100 μL myo - 이노시톨 (물 1 MG ML -1), 100 μL N을 추가 methylglucamine (물 1 MG ML -1), 1 ML H 2 O, parafilm 각 유리병, -20 ° C에서 꼼짝 다음, 동결 건조, parafilm을 구멍. </li></ol> 3. Derivati​​zation <ol><li> 32 MG ML -1 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 40 밀리그램 ML -1 4 - 디메틸 아미노 - 평을 포함 derivatization 시약을 준비한다의 ridine 피리딘 - 메탄올 (4시 1분 V / V). </li><li> 단단히 모자, 그리고 철저하게 와동, reactivials 각 derivati​​zation 시약 300 μL를 추가합니다. </li><li> 35분에 대해 75-80 ° C의 물 목욕 (물론 어떤 물이 튜브를 입력할 수 있도록 피하기 위해 튜브를 봉인)에 튜브를 넣고. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 3 ML의 reactivials, 단단히 캡, 그리고 철저히 와동 각 1 ML 아세트산 무수물를 추가한 후 75-80 25분 대한 ° C 물 목욕으로 재가열. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li></ol> 4. 분리 및 측정 <ol><li> 각 유리병, 단단히 캡, 그리고 철저하게 소용돌이에 1.5 ML의 dichloromethane을 추가합니다. </li><li> 솔루션은 두 개의 구문을 별도 때까지 그대로 앉아있을 수 있도록 각 유리병, 단단히 뚜껑 철저히 와동 1 ML 1M HCL을 추가, 기음 1000 μL pipettor를 사용하여 상위 (수성) 단계를 버리고. </li><li> 같은 F에서ashion, 유기농 단계 3 번씩를 추출하지만, 한 ML H 2 O와 (마지막 세척 단계와 수성 상위 단계의 모든이 제거되었음을 보장하기 위해 특별한 처리). </li><li> 45 RapidVap를 사용하여 최종 솔루션을 건조 ° C (또는 건조한 원하는 경우 질소 가스를 사용하여). </li><li> 300 μL 아세트산 에틸 헥산 (1:1 V / V) 및 소형 볼륨 넣고 단단히 뚜껑 2 개 ML 호박 나사 캡 튜브에 이송에 디졸브. </li><li> ; 고정 위상 5퍼센트 페닐 - 95 % 메틸 polysiloxane (DB-5 또는 동급) 수소와 30m 길이, 0.25 밀리미터 ID, 0.25 음 필름 두께 : 부량 들어, 융합된 실리카 무극 성 모세관 컬럼을 사용하여 GC-FID로 분석 또는 헬륨 캐리어 가스와 같은, 0.5 ML 분 -1 일정한 흐름에서. 크로마 토그래피는 프리미엄 &quot;불활성&quot;단계와 수소 캐리어 가스에 좋다지만,보다 일반적인 종류와 헬륨으로 허용됩니다. 감지기 설정은 300입니다 ° C, 400 ML 분 -1 공기 30 ML 분 -1 질소 및 모두수소 화장 가스. 사출 및 오븐 매개 변수는 다음과 같습니다 ° C ~ 250으로 설정 GC 입구 1 개 μL 분할 주입 (30:1), 초기 오븐 온도 120 ° C, 1 분 개최, 10 오븐 온도를 증가 ° C 분. -1 250 ° C, 2.5 분, 잡아;. 270까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 2 분 개최, 290까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 5 분 누르고 있습니다. 캐리어 가스 유량을 조절하므로 250 ° C에서 이노시톨, 글루코사민과 muramic 산 유도체 elute, 270에서 N-methylglucamine elutes ° C. </li></ol> 5. 파생 검증 <ol><li> 분자 이온을 파악하고 유도체의 분자량을 결정하는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS를 사용합니다. </li><li> 파생의 대상 이온을 조사하기 위해 감도 향상을위한 GC-EI-MS-SIM 또는 GC-EI-MSMS을 사용하십시오. </li><li> 파생 상품의 준비에 대해 여러 isotopically 라벨이 시약을 사용하고 대량 시프트를 사용하여MS의 이러한 isotopically 표시된 파생 상품의 분자 이온과 이온 조각을 조사합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 방식의 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정 (그림 1). 글루코사민 및 표준 주식과 토양 샘플에서 muramic 산성에 대한 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 글루코사민과 muramic 산, mannosamine 및 galactosamine (글루코사민의 두 isomers) 이외에도 메소드를 사용하여 동시에 확인할 수 있습니다. 내부 표준 myo - 이노시톨과 관련한 표준의 반응 요인에 따라 토양 샘플에서 이러한 생체를 정할 수 있습니다. 복구 기준은 질적 derivati​​zation 과정을 모니터링하는 데 사용되었습니다. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성 형성을위한 구조는 그림 3에 표시됩니다 </strong&gt;. 파생 상품의 제안된 구조는 감도 향상, 또는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS 8시 GC-기독교-SIM에 의해 결정되었다; 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각 제안된 구조의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었다 샘플은 다양한 동위 원소의 incorporations 11으로 준비했습니다. 그림 4는 지배적인 이온의 질량 변화를 보여주는 비 라벨 대리인, D-아세트산 경석고 및 U -13 C, 글루코사민 사용한 세 개의 시나리오에서 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 M / Z 187.에게 기타 자세한 정보 및 설명은 우리의 최근 출판물 8, 11 참조된 수 있습니다. 이 전략은 파생 화학을 연구하는 모델이 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 글루코사민의 분석 및 토양의 muramic 산성에 대한 프로토콜의 그림 1. 측정 플로우 차트샘플. 산성 소화, 정화, Derivati​​zation 및 GC 결정 : 프로토콜은 주로 4 단계가 포함되어 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> 그림 2. 표준 및 토양에 대한 이노시톨, 글루코사민, muramic 산, mannosamine, galactosamine 및 methylglucamine의 aldononitrile의 acetates의 GC-FID chromatograms. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> 그림 3. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 형성 구성표. 숫자 1은 nitrile 반응을 나타냅니다. 숫자 2는 아세틸화를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> 그림 4. 지배 이온 structur와 관련된 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 질량 스펙트럼EI 모드 하에서 네;은 ()가 아닌 라벨이 대리인으로 준비, (B) D-아세트산 경석고, (C) U -13 C-글루코사민. 스타가 무거운 동위 원소 원자 또는 동위 원소 그룹을 나타냅니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

aldononitrile 아세트산 derivati​​zed 글루코사민과 muramic 산성의 분석을 위해 제시 GC 기반 방식은 토양에서 추출한 이러한 아미노산 설탕을 계량하기 위해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 파생 상품은 화학적으로 안정, 한 분석에서 확인할 수 있습니다. 방법은 토양 샘플에 국한되지 않고, 비 토양 매트릭스에서 샘플에 대해 간단하게 할 수 있습니다. 이 방법에 사용되는 진공 펌프는 산성에 강한 것으로 만들어졌습니다. 우리는 더 6M HCL 솔루션을 증발 때 펌프를 보호하는 기본 트랩을 설정하는 것이 좋습니다. 케어는 시약과 유리 모두를 위해 엄격하게 무수 조건을 유지하기 위해 derivati​​zation 단계 동안 촬영해야합니다. 작품은 지체없이 실시하여야한다. 유리도 550 ° C에서 muffling 또는 용매와 rinsing하여, 가끔 표시되는데, 깨끗한 있어야합니다. 안전 조치는 산, 그리고 증발하는 동안 강한 산성 증기의 취급을 위해 촬영해야합...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Muramic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-글루코사민 염산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-메틸-D-glucamine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Myo - 이노시톨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> 메탄올 (건조) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC3269500​​10 </td></tr><tr><td> 4 - 디메틸 아미노 - 피리딘 </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> 에틸 아세테이트 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine 하이드로 클로라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> 피리딘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td> &lt;TD&gt; 피셔 과학 </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Dichloromethane (메틸렌 클로라이드) </td><td> 피셔 과학 </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> 헥산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> 염산의 산성 (6M) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 -15 N </td><td> 아이콘 서비스 </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-글루코오스-U -13 C </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> 암모늄 sufate -15 N </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td></tr><tr><td> 급속 Vap </td&gt; <td> LabConco </td><td> 790,002 </td></tr><tr><td> Vacum 펌프 </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> 가수 분해 플라스크 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Derivati​​zation의 microvial </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> 애질런트 </td><td> 애질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템은 애질런트 LC / MSD-TOF로 결합 </td></tr></tbody></table>

토양에 미생물 잔류 결정을위한 aldononitrile 아세트산 derivati​​zed 글루코사민과 muramic 산성의 gc 기반 탐지

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

특성화 미생물에 대한 양적 접근 방식은 생태계 내에서 미생물의 상태와 기능의 폭넓은 이해를위한 열쇠입니다. 미생물 분석을 위해 현재의 전략은 전통적인 실험실 문화에 종속적인 기술과 직접 추출 및 특정 생체 1, 2의 결정을 바탕으로 이들을 모두 포함합니다. 흙을 거주 미생물 종의 다양성 가운데 몇몇은 배양해 때문에 문화 종속적인 방법은 상당한 편견, biomarker 분석의 부재 제한을 소개합니다. 글루코사민, mannosamine, galactosamine 및 muramic 산성이 잘 토양 시스템 3의 가장 중요한 성분은 이러한 글루코사민 (가장 풍부)와 muramic 산성 (고유 세균 세포에서)으로 인해 생활과 죽은 미생물의 질량 모두 대책을 역임했습니다 4. 그러나 분석에 대한 지식의 부족은 과학적인 또래 간의 폭넓은 보급을 제한합니다. 모든 exi 중에서aldononitrile로 derivatization를 분석 방법을 아프게하는 것은 GC 기반의 분석을 다음 acetates 최적의 정밀도를 균형에 관하여 좋은 옵션으로 떠오르고, 감도, 단순, 샘플 보관 5시 좋은 색층 분리, 안정성. 여기서는 aldononitrile의 acetates에 대한 그들의 변환 후 토양에서 글루코사민과 muramic 산성의 안정적이고 비교적 간단한 분석을 위해 상세한 프로토콜을 소개합니다. 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivati​​zation 및 GC 결정합니다. 단계별 절차는 옛 간행물 6, 7에 따라 수정됩니다. 또한 구조적으로 전자 이온화에 따라 형성 유도체와 그 이온 조각의 분자 이온의 유효성을 검사하기위한 전략을 제시한다. 우리는 aldononitrile 아세테이트 derivati​​zed 글루코사민과 mur의 분자량을 결정하기 위해 GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS 및 isotopically 분류된 시약을 적용amic 산은, 우리는 각 파생 상품 8 이온 조각을 조사하기 위해 이온 스펙트럼에서 동위 원소 라벨이 표시된 파생 상품의 대량 교대를 사용했습니다. 이론적 해설과 더불어, 파생 및 이온 조각의 분자 이온의 유효성 검사 δ 13 C 또는 biogeochemical 연구 9, 10에서 이러한 생체 이온 조각을 사용하여 연구자에게 도움이 될 것입니다.

우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

미생물을 특성화하기 위한 정량적 접근 방식은 생태계 내 미생물의 상태와 기능에 대한 폭넓은 이해를 위해 매우 중요합니다.

이 비디오의 전체적인 목적은 토양에서 추출한 글루코사민과 뮤이산(muic acid)의 Aldon nitrile acetate 유도체에 대한 GC 기반 분석의 상세한 설명을 제공하는 것입니다. 이 과정은 유기 폴리머를 분해하여 글루코사민과 뮤이산을 방출시키는 산 분해 단계로 시작됩니다. 그 후, 혼합 용액으로부터 단량체 아미노당을 분리 및 정제합니다.이어지는 유도체화 단계에서는 이러한 아미노당을 가스 크로마토그래피 분석이 가능한 휘발성 알돈 니트릴 아세테이트로 전환합니다. 절차의 마지막 단계는 액체-액체 추출 및 GC 측정입니다. 최종적으로, 불꽃 이온화 검출기를 이용한 GC 분석을 통해 myo 및 acetol과 methyl glutamine 표준물질 사이에서 용출되는 알돈 니트릴 아세테이트 아미노당의 기선 분리 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술이 다른 방법보다 갖는 주요 장점은 정밀도, 민감도, 간편함, 우수한 색도 그래픽 분리능 및 시료 보관 시의 안정성 사이의 균형이 최적화되어 있다는 점입니다. 이 방법은 안정적인 토양 탄소 풀에 대한 SSE 미생물의 기여도와 같이 전 지구적 탄소 순환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 토양 내 미생물 잔해의 축적에 대한 통찰과 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 해양 시스템, 생물학적 조직, 그리고 외계 샘플과 같은 다른 매질에도 적용 가능합니다.본 프로토콜을 시작하려면 현장 수집 후 토양 시료를 동결 건조하고, 볼 밀 토양 분쇄기나 막자와 유발을 사용하여 토양 시료를 분쇄 및 균질화하십시오. 분쇄된 토양 시료를 25 milliliter 가수분해 플라스크에 정량하여 넣습니다. 각 가수분해 플라스크에 6 molar 염산 10 milliliters를 넣고, 질소 가스로 채운 후 캡을 단단히 닫으십시오.인큐베이터에서 105°C로 8시간 동안 가수분해합니다. 자동 타이머 스위치를 사용하여 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내어 실온까지 냉각합니다.각 플라스크에 내부 표준 물질인 myo acetol 100 µL를 첨가합니다. 플라스틱 깔때기가 200 mL 배형 플라스크로 배수되도록 설치한 후, 가볍게 흔들어 섞어줍니다. 이때 안정성을 위해 표준 테이퍼 사이즈 24 40 지상 유리 조인트를 플라스틱 컵 위에 거치합니다.Watman 2번 정성 분석용 원형 여과지를 4등분으로 접어 깔때기에 넣습니다. 각 가수분해 플라스크를 가볍게 흔든 후 슬러리를 깔때기에 붓습니다. 각 시료를 여과하려면 약 45°C에서 진공 회전 증발기를 사용하여 여과액을 건조하십시오.각 페어 플라스크의 건조 잔해물을 3~5 mL의 물로 현탁시켜 40 mL 테플론 튜브에 붓습니다. 두 번째 물 분량을 사용하여 각 플라스크를 세척합니다. 금속 이온과 기타 유기 분자를 침전시키기 위해 1 M 수산화칼륨 용액을 사용하여 시료의 pH를 6.6에서 6.8로 조정합니다. 그다음 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다.상층액을 40 mL 유리 튜브에 붓고 튜브 입구를 파라필름으로 덮어 상층액을 동결시킨 후, 파라필름에 구멍을 뚫습니다. 동결된 상층액을 동결 건조하여 모든 액체를 제거합니다. 상층액이 건조되면, 잔류물을 3 mL의 건조 메탄올로 용해합니다.튜브 캡을 단단히 닫고 충분히 볼텍싱한 후, 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 염을 침전시키기 위해 상층액을 3 mL 원추형 반응 바이알로 옮기고, 45 °C의 급속 진공 농축기(VA machine) 또는 완만한 질소 가스 흐름 하에서 완전히 증발시킵니다. 증발이 완료되면, 각 바이알에 회수 표준물질과 methyl glutamine 100 µL 및 물 1 mL를 첨가합니다.그 다음 유도체화 작업을 시작하기 전에 시료를 동결하십시오. 서면 프로토콜에 기술된 대로 표준물질을 제조한 후, 시료와 표준물질을 모두 동결 건조하십시오. 32 mg/mL의 hydroxyl amine hydrochloride와 40 mg/mL를 포함하는 유도체화 시약을 준비하십시오.퓨린 메탄올에 용해된 4-디메틸아미노퓨린입니다. 유도체화 시약 300 µL를 각 반응 바이알에 넣고, 뚜껑을 단단히 닫은 후 완전히 볼텍싱합니다. 밀폐된 바이알을 75~80 °C의 항온수조에 35분 동안 둡니다.바이알을 항온수조에서 꺼내 실온으로 식힙니다. 그런 다음 3 mL 반응 바이알 각각에 무수초산 1 mL를 첨가하고, 뚜껑을 단단히 닫은 후 볼텍스 믹서로 충분히 혼합합니다. 이어서 75~80 °C 항온수조에서 25분 동안 2차 배양을 수행합니다.바이알을 항온수조에서 꺼내 실온으로 냉각합니다. 분리와 측정을 시작하려면 각 튜브에 1.5 milliliters 디클로로메탄을 첨가한 후 볼텍싱합니다. 각 바이알에 1 molar 염산 1 milliliter를 첨가하고 충분히 볼텍싱한 다음, 두 층이 분리될 때까지 용액을 그대로 둡니다.상층의 수성층을 흡입하여 제거합니다. 1000 µL 피펫을 사용하여 동일한 방식으로 유기층을 3회 추출하되, 마지막 세척 단계에서는 1 mL의 물을 사용합니다. 모든 상층 수성층이 완전히 제거되었는지 세심하게 확인하십시오.45°C의 급속 VAP 또는 질소 가스 기류를 사용하여 최종 용액을 건조하고, 각 시료를 300 µL의 ethyl acetate hexane에 용해합니다. 이를 소량 인서트가 포함된 2 mL 호박색 스크류 캡 바이알로 옮기고 캡을 단단히 닫아, 서면 프로토콜에 명시된 대로 DB five와 같은 퓨즈드 실리카 비극성 모세관 칼럼과 불꽃 이온화 검출기를 이용한 가스 크로마토그래피로 정량 분석합니다. 표준 분석 및 가동 후, acetol glucosamine 및 mu amic acid 유도체는 250°C에서 용리되고 end methyl glutamine은 270°C에서 용리되도록 운반 가스의 유량을 조정합니다.가스 크로마토그래피 분석 후, GC 주입구를 250 °C로 설정하고 오토샘플러를 사용하여 1 µL의 30:1 분할 주입을 수행합니다. 이 절차의 마지막 단계로, 서면 프로토콜에서 논의된 크로마토그래피 및 분광법 방법을 사용하여 유도체 검증을 수행합니다. 표준 줄기 및 토양 시료에서 추출한 글루코사민과 요산의 분석 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 글루코사민과 뮤산 외에도, 적용된 표준물질의 정확한 양과 두 가지 내부 표준물질 각각의 반응 계수를 기반으로 하는 이 방법을 통해 글루코사민의 두 이성질체인 오사민과 갈락토사민을 동시에 정량할 수 있습니다.토양 시료 내 이러한 바이오마커의 양을 측정할 수 있습니다. 또한 유도체화 과정을 정성적으로 모니터링하기 위해 회수 표준물질(recovery standard)이 사용되었습니다. 알돈 니트릴 아세테이트(aldon nitrile acetate), 유도체화된 글루코사민(derivate glucosamine) 및 뮤산(muic acid)의 형성 계획도가 여기에 제시되어 있습니다.1번은 니트릴 반응을 나타내며, 2번은 아세틸화를 나타냅니다. 전자 이온화 시 형성되는 이온 파편의 제안된 구조는 다양한 동위원소가 도입된 시료들의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었습니다. 여기에서는 글루코사민 알돈 니트릴 아세테이트 유도체의 주요 이온이 서로 다른 시나리오에서 나타내는 질량 이동을 보여줍니다.본 예시에서는 표지되지 않은 시약뿐만 아니라 동위원소 표지된 무수 아세트산 및 동위원소 표지된 글루코사민을 사용하여 준비하였습니다. 화학 구조식의 별표는 중동위원소 원자 또는 동위원소 그룹을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, 유도체화 과정 동안 엄격하게 무수 조건을 유지하는 것이 중요합니다.이 단계에서 사용하는 유기 용매와 유리 기구는 모두 건조된 상태여야 합니다. 많은 업체에서 무수 용매를 판매하고 있지만, 보유 중인 용매는 황산마그네슘과 같은 건조제 가 포함된 컬럼을 통과시켜 건조할 수 있습니다. 이 절차 이후, 거대 생물의 발달 후 생존 개체와 사후 개체를 구분함으로써 거대 생물이 어떻게 반응하는지, 또는 토양 내 탄소나 질소의 회전 및 축적이 어떻게 이루어지는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 비율 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 거시 생태학, 토양 생물학 및 화학 분야의 연구자들이 자연 또는 관리되는 육상 시스템에서 토양 유기물에 대한 거시적 기여와 탄소 격리를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

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