입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복
2012년 4월 9일
특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 EAE 유도에 내성이 있는 것으로 알려진 마우스 균주를 포함하여 모든 마우스 균주에서 EAE를 일관되고 쉽게 유도하는 것입니다. 이는 먼저 공여자 마우스에 미엘린 특이적 단백질 또는 펩타이드 항원을 면역화하여 완전한 fres 보조제에서 유화함으로써 수행됩니다. 10일 후, 기증자 마우스의 림프절을 분리하고 림프절 세포를 4-5일 동안 동일한 항원으로 배양하여 시험관에서 다시 자극합니다.
그런 다음 세포는 순진한 수용 마우스로 채택되어 전달됩니다. 감수성이 있는 마우스 균주는 8일에서 14일 이내에 EAE가 발생하여 내성 균주에서 EAE를 유발합니다. 입양 이식 후 14일 후, 수혜 마우스는 CFA 항원으로 면역되었습니다.
이 방법을 사용하여 내성 마우스 균주에서 EAE를 유도할 수 있습니다. EAE를 유도하기 위한 적응형 전달 및 챌린지 프로토콜의 주요 장점은 신뢰할 수 있는 질병 유도를 허용한다는 것입니다. 100% 미만의 임상 질환을 보는 경우는 거의 없습니다.
질병 및 감염되기 쉬운 마우스 균주를 유도하기 위한 프로토콜을 조정할 수 있지만, 더 중요한 것은 이 프로토콜을 사용하여 이전에 질병에 내성이 있는 것으로 간주되었던 많은 마우스 균주에서 EAE를 유도할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연합니다. 오늘은 수석 연구원인 차칭입니다.
MBP의 밀리리터당 2밀리그램 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. PBS에서. 루어 잠금 장치가 장착된 접지 유리 주사기를 사용하여 면역할 마우스당 100마이크로리터의 항원 용액을 추출합니다.
별도의 주사기를 사용하여 동일한 부피의 Freud's adjuvant H 37 ra 전체를 수집합니다. 그런 다음 3방향 스톱콕으로 두 개의 주사기를 연결하고 플런저를 앞뒤로 밀어 에멀젼이 형성될 때까지 항원과 보조제를 혼합합니다. 이 경우에 해당하는지 확인하려면 용액을 주사기 중 하나로 옮기고 빈 주사기를 분리하십시오.
빈 주사기를 약간 뒤로 당긴 다음 잔류 혼합물 한 방울을 실온의 깨끗한 물이 담긴 비이커에 배출합니다. 방울이 흩어지면 주사기를 다시 연결하고 계속 혼합하십시오. 방울이 손상되지 않고 에멀젼을 수집하기 위해 에멀젼이 형성되었는지 테스트를 반복합니다.
면역을 위해. 플런저가 제거된 유리 주사기에 플라스틱 1ml 주사기를 연결합니다. 용액을 플라스틱 주사기에 조심스럽게 옮겨 가장자리에 채웁니다.
그런 다음 플라스틱 플런저를 삽입하고 정확히 1.2밀리리터가 남도록 약간의 에멀젼을 배출합니다. 주사기에 기포가 갇히지 않아야 합니다. 이 절차가 올바르게 수행되는 경우.
플라스틱 주사기를 분리합니다. 26 게이지 바늘로 끼우고 플런저를 1 밀리리터 표시로 밀어 바늘 빈 공간을 채 웁니다. 마우스를 단단히 긁고 약지와 새끼손가락 사이의 꼬리를 뒤로 잡고 흉부와 복부에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 피하.
오른쪽 겨드랑이 바로 위의 흉부에 50마이크로리터의 에멀젼을 주입합니다. 주사가 올바르게 수행되면 주사 부위에 약간 하얀 팽창이 보입니다. 왼쪽 겨드랑이 위의 절차를 반복한 다음 꼬리를 풀고 오른발을 잡고 마우스의 오른쪽 측면을 노출합니다.
흉곽 바로 아래에 50마이크로리터의 용액을 주입합니다. 오른발을 놓으십시오. 마우스를 반대 방향으로 돌리고 왼쪽에서 주입을 반복합니다.
예방 접종 후 7-10일. 안락사된 동물의 림프절을 적출합니다. 먼저 팔다리를 쭉 뻗고 마우스를 등에 눕히고 핀으로 해부 보드에 고정합니다.
마우스에 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 멸균 도구를 사용합니다. 하복부에서 턱까지 마우스의 피부를 세로로 절개합니다.
복부에서 한쪽 다리를 다시 절개합니다. 그런 다음 다른 하나를 아래로 내려갑니다. 마우스에서 피부를 벗겨내고 해부 보드에 고정합니다.
또한 네 팔다리를 따라 피부를 자릅니다. 그런 다음 피부 피판의 윗부분을 벗겨내고 양쪽에 핀으로 고정하면 일반적으로 사타구니나 겨드랑이에 가까운 서혜부 림프절과 겨드랑이 림프절이 피부 바로 아래에 작고 불투명한 덩어리로 보여야 합니다. 두 개의 가는 집게를 사용하여 첫 번째 림프절 위의 결합 조직을 부드럽게 제거합니다.
이 과정에서 혈관이 파괴되지 않도록 주의합니다. 결합 조직이 제거되면 림프절 아래에 집게 한 쌍을 놓고 몸에서 당겨 빼냅니다. 멸균 PBS가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 림프절을 옮기고 다른 3개의 림프절도 같은 방법으로 채취합니다.
모든 림프절을 채취한 후 페트리 접시를 생물 안전 후드로 옮깁니다. 멸균 주사기 플런저의 뒷면을 사용합니다. 림프절을 균질화하여 세포를 해방시켜 파편을 제거하고 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 원뿔형 튜브로 여과합니다.
그런 다음 멸균 PBS로 부피를 50ml로 조정하고 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후, 소량의 예열 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하고 생존 가능한 세포를 계수합니다. 농도를 밀리리터당 6개 셀의 4배, 10으로 조정합니다.
그런 다음 24웰 플레이트에서 웰당 2밀리리터로 셀을 플레이트합니다. 밀리리터당 100마이크로그램의 최종 농도를 얻기 위해 각 웰에 MVP 항원을 추가합니다. 일단 항원이 추가되면.
세포를 섭씨 37도에서 5일 동안 배양합니다. 세포가 다시 자극되면 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 채취하여 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 1000RPM에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 소량의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
그런 다음 세포를 계수하고 생존 가능한 세포 농도를 PBS를 사용하여 밀리리터당 8번째 세포의 2.5배로 10으로 조정합니다. 세포를 주사기로 끌어당겨 26게이지 바늘에 끼워 넣어 입양 이식을 수행합니다. 각 마우스의 꼬리에 0.2ml의 세포를 정맥 주사하여 내성 마우스가 입양 이식 후 몇 주까지 도전
하도록 합니다.공여자 마우스의 면역 접종을 수행 한 것과 동일한 방식으로 200 마이크로 리터의 에멀젼 부피에 200 마이크로 그램의 항원을 동물에게 주입합니다. 챌린지 후 7-10일 후에 마비 질환이 발생하고 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다. 질병은 꼬리가 약해지는 것에서 시작됩니다.
꼬리가 약하면 질병이 등급이 매겨지고 하나의 질병이 등급이 매겨집니다. 둘째는 쥐가 한쪽 뒷다리에 마비가 생기는 경우이고, 셋째는 양쪽 뒷다리가 마비된 경우입니다. 4등급은 양쪽 앞다리가 마비되는 경우입니다.
5 등급, 마우스가 더 풍부합니다. 그리고 6등급, 쥐는 죽었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 챌린지 후 7일에서 14일 후에 마우스는 단상 마비 질환에 걸리며, 이는 고전적인 EAE 기준을 사용하여 등급을 매길 수 있습니다.
생쥐는 회복될 수 있지만 자발적으로 재발하지는 않습니다. 질병의 유도에는 항원 특이적 도전이 필요합니다. CFA만 있거나 관련 없는 항원으로 인한 챌린지는 질병을 유발하지 못합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 EAE를 유도하기 위한 입양 전달 및 챌린지 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 항원 특이적 림프절 세포의 적응형 전달과 항원 챌린지를 결합하면 모든 마우스 균주에서 EAE를 쉽게 유도할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 일부 마우스 균주에 내재 된 내성 메커니즘을 극복 할 수 있으므로 질병 저항성에 대한 연구를 할 수 있습니다. 또한.
이 기술은 모든 자가면역 질환 과정을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있어야 합니다.
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개요
이 기사는 일반적으로 저항성이 있는 마우스 계통에 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에는 흰 마우스를 마이엘린 특이적 단백질로 면역화하고 순수한 수용자 마우스에 림프절 세포를 이전하는 과정이 포함됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 자가면역
배경
- 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증을 연구하는 모델입니다.
- 일부 마우스 계통은 EAE 유도에 저항성을 나타냅니다.
- EAE 유도를 이해하는 것은 자가면역 질환 연구에 도움이 될 수 있습니다.
- 마이엘린 기본 단백질은 EAE 연구에서 주요 항원입니다.
연구 목적
- 저항성 마우스 계통에 EAE를 유도하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발하기 위함입니다.
- EAE 감수성 뒤의 면역학적 메커니즘을 조사하기 위함입니다.
- 다양한 유전적 배경에서 자가면역 반응에 대한 연구를 촉진하기 위함입니다.
사용된 방법
- 완전한 Freund's 접종제로 마이엘린 특이적 단백질로 공여 마우스를 면역화합니다.
- 면역화된 공여 마우스에서 10일 후 림프절을 분리합니다.
- 동일한 항원으로 림프절 세포를 체외에서 재자극합니다.
- 자극된 세포를 순수한 수용자 마우스로 채택 이전합니다.
주요 결과
- 감수성 마우스 계통은 이전 후 8일에서 14일 이내에 EAE를 발병합니다.
- 저항성 계통에 EAE 유도가 성공적으로 이루어집니다.
- 이 프로토콜은 EAE 유도를 위한 일관된 방법을 제공합니다.
- 결과는 EAE에서의 면역 반응 이해에 기여합니다.
결론
- 기술된 면역화 프로토콜은 저항성 마우스 계통에 효과적으로 EAE를 유도합니다.
- 이 방법은 자가면역 질환의 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
- 향후 연구는 이 프로토콜을 기반으로 치료 개입을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reliable induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in genetically resistant mouse strains enables robust modeling of central nervous system autoimmunity for early-stage drug discovery. This adoptive transfer and antigenic challenge protocol overcomes biological resistance barriers, supporting mechanistic de-risking and target validation in preclinical neuroimmunology pipelines. The approach enhances predictive confidence for translational research in multiple sclerosis and related autoimmune disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of autoimmune disease mechanisms in previously inaccessible genetic backgrounds.
- Supports functional validation of immune targets by inducing disease in resistant strains.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of antigen-specific T cells in disease onset.
- Improves predictive confidence for target selection in neuroinflammatory pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible model for evaluating immunomodulatory compounds.
- Enables quantitative grading of disease progression for assay readouts.
- Supports scalability and platform reuse across diverse mouse strains.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease heterogeneity by overcoming genetic resistance.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in neuroimmunology.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling disease in multiple genetic contexts.
- Provides a foundation for translational biomarker exploration in CNS autoimmunity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling EAE induction in resistant strains, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on immune cell involvement and disease triggers.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative disease grading for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of disease incidence and severity across conditions.
- Translational Research: Models genetic diversity relevant to human autoimmune disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for autoimmune disease modeling across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes disease induction and grading for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroimmunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, animal handling, and adoptive cell transfer techniques.
- Needs access to cell culture, animal facilities, and quantitative disease scoring infrastructure.
- Demands cross-team standardization of antigen preparation and disease grading protocols.
- Adaptation may be needed for different antigens or autoimmune disease models.
- Practical limitations include the need for precise timing and dose control in antigenic challenge.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Preparing CFA-emulsified Antigen
3:08
Immunization of Donor Mice
3:51
Isolation of Lymph Node Cells after Immunization and Re-stimulation with Antigen
6:07
Harvest of Re-stimulated Lymph Node Cells and Adoptive Transfer
6:47
Antigenic Challenge of Recipient Mice and Development of Disease
7:31
Results: Kinetics of Disease Progression Following Immunization, Adoptive Transfer and Challenge
7:58
Conclusion
