입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

본 절차의 전반적인 목표는 EAE 유도에 저항성이 있는 것으로 알려진 계통을 포함하여, 모든 마우스 계통에서 EAE를 일관되고 용이하게 유도하는 것입니다. 이는 우선 공여 마우스에 완전 프레온(complete fres) 보조제로 유화시킨 수초 특이적 단백질 또는 펩타이드 항원을 면역함으로써 수행됩니다. 10일 후, 공여 마우스로부터 림프절을 분리하고, 림프절 세포를 동일한 항원과 함께 4~5일 동안 배양하여 체외(in vitro)에서 재자극합니다.

그 다음으로 세포를 나이브 수용 마우스에 입양 전이합니다. 감수성 마우스 계통은 8~14일 이내에 EAE가 발생하며, 저항성 계통에서도 EAE를 유발하게 됩니다. 입양 전이 14일 후, 수용 마우스에 CFA 내의 항원을 면역시켰습니다.

이 방법을 사용하여 저항성 마우스 계통에서도 EAE를 유도할 수 있습니다. EAE 유도를 위한 적응 전이 및 챌린지 프로토콜의 주요 장점은 질병 유도가 신뢰성 있게 이루어진다는 것입니다. 임상적 질병 발생률이 100% 미만인 경우는 매우 드뭅니다.

질환 유도 프로토콜을 특정 마우스 계통 및 감수성 계통에 맞게 조정할 수 있으며, 더욱 중요한 점은 이 프로토콜을 사용하여 이전에는 질환에 저항성이 있다고 여겨졌던 많은 마우스 계통에서 EAE를 유도할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연해 보겠습니다. 오늘의 시연자는 수석 연구원인 cha ching입니다.

먼저 PBS 내에 2 mg/mL 농도의 MBP 용액을 준비합니다. 루어 락(lure lock)이 장착된 지상 유리 주사기를 사용하여 면역화할 마우스 한 마리당 100 µL의 항원 용액을 흡입합니다.

별도의 주사기를 사용하여 동일한 부피의 complete Freud's adjuvant H 37 ra를 수집합니다. 그다음 3방향 스톱콕(three-way stopcock)을 사용하여 두 주사기를 연결하고, 항원과 보조제가 혼합되어 유탁액이 형성될 때까지 플런저를 앞뒤로 밀어 혼합합니다. 유탁액 형성을 확인한 후, 용액을 한쪽 주사기로 옮기고 빈 주사기는 분리합니다.

빈 주사기의 플런저를 약간 뒤로 당긴 다음, 실온의 깨끗한 물이 담긴 비커에 잔류 혼합물 한 방울을 떨어뜨립니다. 방울이 확산되면 주사기를 다시 연결하여 혼합을 계속합니다. 방울이 형태를 유지하여 에멀젼이 형성되었다면, 에멀젼을 수집하기 위해 이 테스트를 반복합니다.

면역화를 위해, 플런저를 제거한 유리 주사기에 1 mL 플라스틱 주사기를 연결합니다. 용액을 플라스틱 주사기에 조심스럽게 옮겨 끝까지 채웁니다.

그런 다음 플라스틱 플런저를 삽입하고 에멀젼을 일부 배출하여 정확히 1.2 milliliters만 남깁니다. 주사기 내에 기포가 갇혀 있어서는 안 됩니다. 이 절차가 올바르게 수행되었다면.

플라스틱 주사기를 분리합니다. 26 gauge 바늘을 장착하고 플런저를 1 mL 표시선까지 밀어 바늘의 데드 볼륨을 채웁니다. 마우스를 단단히 잡고 흉부와 복부에 쉽게 접근할 수 있도록 꼬리를 약지와 새끼손가락 사이에 고정합니다. 피하 주사합니다.

에멀젼 50 µL를 오른쪽 겨드랑이 바로 위 흉부에 주입합니다. 주입이 올바르게 수행되었다면 주입 부위에 작은 흰색 돌출부가 보일 것입니다. 왼쪽 겨드랑이 위에도 동일한 절차를 반복한 다음, 꼬리를 놓고 오른쪽 뒷발을 잡아 마우스의 오른쪽 옆구리가 드러나게 합니다.

늑골 바로 아래에 용액 50 µL를 주입합니다. 오른쪽 뒷발을 놓습니다. 마우스를 반대 방향으로 돌려 왼쪽에도 동일하게 주입합니다.

면역 후 7~10일이 지나면, 안락사시킨 동물로부터 림프절을 채취합니다. 먼저 마우스를 등으로 눕히고 사지를 뻗게 한 뒤, 핀으로 해부판에 고정합니다.

마우스에 에탄올을 분사합니다. 그다음 멸균된 도구를 사용하여 마우스의 하복부부터 턱까지 피부를 세로로 절개합니다.

복부에서 한쪽 다리 방향으로 다시 절개합니다. 그런 다음 다른 쪽 다리 방향으로도 절개합니다. 생쥐의 피부를 벗겨 해부판에 핀으로 고정합니다.

또한 네 다리를 따라 피부를 절개합니다. 그 다음 피부 플랩의 상단 부분을 벗겨내어 양측에 핀으로 고정합니다. 보통 서혜부나 겨드랑이 근처에 위치한 서혜 림프절과 액와 림프절이 피부 바로 아래에 작은 불투명한 덩어리로 보여야 합니다. 두 개의 미세 핀셋을 사용하여 첫 번째 림프절 위의 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.

이 과정에서 혈관이 손상되지 않도록 주의합니다. 결합 조직을 모두 제거한 후, 포셉 한 쌍을 림프절 아래에 놓고 몸체에서 떼어냅니다. 림프절을 멸균 PBS가 담긴 35 millimeter 페트리 접시에 옮기고, 나머지 세 개의 림프절도 동일한 방식으로 채취합니다.

모든 림프절을 채취한 후, 페트리 접시를 생물 안전 작업대(biosafety hood)로 옮깁니다. 멸균된 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 림프절을 균질화하여 세포를 분리하고, 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 원심분리 튜브(conical tube)에 여과하여 잔해물을 제거합니다.

그 후 멸균된 PBS로 부피를 50 milliliters로 맞춘 다음, 세포를 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 미리 데워둔 세포 배양 배지 소량에 세포를 재현탁하고 생존 세포 수를 측정합니다. 농도를 milliliter당 4 × 10⁶ cells로 조정합니다.

그 다음 24웰 플레이트의 웰당 2 mL씩 세포를 분주합니다. 각 웰에 MVP 항원을 첨가하여 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 합니다. 항원 첨가가 완료되면.

세포를 37 °C에서 5일 동안 배양합니다. 세포가 재자극되면, 파이펫으로 부드럽게 상하 혼합하여 수확한 뒤 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 1000 RPM에서 10분 동안 원심 분리하고, 펠릿을 소량의 멸균 PBS에 재현탁합니다.

그 다음 세포 수를 측정하고 PBS를 사용하여 생존 세포 농도를 2.5 × 10⁸ cells/mL로 조정합니다. 입양 이식을 수행하기 위해 세포를 시린지에 흡입하고 26 gauge 바늘을 장착합니다. 각 마우스의 꼬리 정맥에 세포 0.2 mL를 정맥 주사하여 입양 이식 2주 후 저항성 마우스에 챌린지를 수행합니다.

공여 마우스의 면역화와 동일한 방식으로, 200 µL 부피의 에멀션에 포함된 200 µg의 항원을 동물에게 주입합니다. 챌린지 후 7~10일이 지나면 마비성 질환이 발생하며 그 진행 과정을 모니터링할 수 있습니다. 질환은 꼬리의 무력감부터 시작됩니다.

꼬리가 늘어졌을 때 질병 단계는 1단계로 분류하며, 마우스의 뒷다리 한쪽으로 마비가 진행되면 2단계, 양쪽 뒷다리 모두 마비되면 3단계로 분류합니다. 앞다리 양쪽 모두 마비된 상태는 4단계입니다.

5등급은 마우스의 증상이 더 심해진 상태이며, 6등급은 마우스가 사망한 상태입니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 챌린지 후 7~14일이 지나면 마우스에게 단상성 마비성 질환이 발생하며, 이는 전형적인 EAE 기준으로 등급을 매길 수 있습니다.

마우스가 회복될 수는 있으나, 자발적으로 재발하지는 않습니다. 질병 유도를 위해서는 항원 특이적 자극이 필요합니다. CFA 단독 또는 무관한 항원으로 자극하는 것만으로는 질병을 유발할 수 없습니다.

이 영상을 시청한 후에는 EAE 유도를 위한 입양 전이 및 챌린지 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 항원 특이적 림프절 세포의 입양 전이와 부스팅 항원 챌린지를 결합함으로써, 어떤 마우스 계통에서도 EAE를 쉽게 유도할 수 있습니다. 이 방법은 일부 마우스 계통에 내재된 저항성 기전을 극복할 수 있게 해주며, 따라서 질병 저항성에 대한 연구를 가능하게 합니다.

이 기술은 모든 자가면역 질환 과정을 연구하는 데 쉽게 적용될 수 있을 것입니다.