Name: 인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 학습하세요 인간 피부 펀치 생검에서 섬유아세포를 유도하는 외식체 배양법을. 4-8주 내에 저대수로 1,500-2,000만 개의 세포를 냉동보관할 수 있는 이 방법은 피부 생물학 및 재생의학 연구에 필수적입니다.

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이 프로토콜의 개발은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM, TR1-01246)와 파킨슨 연합에 의해 투자되었다.

펀치 생검이 표준 절차 3 (예를 들어, 4mm 라운드 Visipunch 계기로 얻은)를 사용하여 얻은 피부는 얼음에 완전한 DMEM 20 % FBS 매체에 보관해야합니다. 일단 샘플을 실험실에 도착, 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다. 1. 피부 펀치 생검의 준비 단계 1.1-1.3는 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할 <ol><li> 사전 준비 : 6 잘 플레이트의 각 웰에 젤라틴 0.1 %의 1 ML을 추가합니다. 30-60 분 동안 옆에 접시를 설정합니다. 젤라틴 용액을 흡입하고 각 well에 완료 DMEM/20 % FBS 매체 800 μl를 추가합니다. 잘의 전체 표면은 매체와 적용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 멸균 10cm 조직 문화 접시의 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 중앙에 1.5 DMEM의 ML / 20 % FBS 미디어를 추가하고 혈청 피펫 팁 용지 드롭을 확산. </li><li> 멸균 집게를 사용하여, 장소 t그는 피부 접시에 미디어 조각을 생검. </li></ol> 2. 피부 펀치 생검의 해부 9 2.1-2.2 단계는 수평 층류 후드 안쪽에 수행해야 할 <ol><li> 거꾸로 뚜껑에 10cm 접시의 바닥 부분을 놓고, 피부가 층류 후드 해부 현미경 조직 검사 전송할 수 있습니다. </li><li> 장소에 생검을 보유하는 하나의 메스를 사용하여 한 방향으로 회전 운동으로 잘라 두 번째 메스 같은 반에서 조각을 절단하여 날카로운 모서리를 가진 12-15 균등하게 크기의 조각으로 4 mm 라운드 피부 생검을 해부하다. 비정형 가장자리와 조각이 좋지 첨부 / 세포 부산물에 기여한다. </li></ol> 3. 해부 피부의 전송 조직 배양 플레이트에 조각 생검 단계 3.1-3.6 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할 <ol><li> 10cm 조직 문화 접시의 바닥 부분을 배치거꾸로 뚜껑 및 전송 접시 위에 다시 생물 안전 캐비닛에에. </li><li> 마른 우물에 800 μL 및하지를 포함하는 준비된 6 잘 플레이트의 각 웰에 뾰족한 집게, 장소 2-3 생검 조각을 사용. 조각이 잘 하단에 부착 얻기 위해 운동을 도청하거나 슬라이딩을 사용합니다. 메스 집게에서 모든 생검 조각을 제거하는 데 유용합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 6 잘 플레이트를 놓습니다. 어떤 증발 매체를 대체하는 매 2 일 1 ~ 200 μl를 추가, 미디어 코팅 첫 주에 대한 우물의 바닥의 영화가 있는지 확인하기 위해 매일 모니터링합니다. </li><li> 일주일이 지난 뒤, 전체 DMEM/20 % FBS 및 변경 매체 2-3 일마다 2 ㎖에 미디어의 양을 증가시킵니다. </li><li> 일단 섬유 아세포는 섬유 아 세포 2X T75 플라스크 (통로 1)에 잘 trypsinize 및 통로 6 잘 플레이트의 가장자리에 도달하는 시점에 각 우물에 합류한다. 조직의 조각뿐만 아니라 전송할 수 있습니다. 그들은 (을)를 부착하지 않으며 세척 할 수다음 미디어의 변화 동안 유타. </li><li> 일단 섬유 아 세포가 합류하다, 배 T175 플라스크 (통과 2) 완전한 DMEM 매체 동결 플러스 1X10 6 세포 / 유리 병 ml 당 10 %의 DMSO로 전송할 수 있습니다. </li></ol> 4. 면역 염색을 통해 특성화 섬유 아세포를 <ol><li> 8 잘 챔버 슬라이드 문화 섬유 아 세포는 젤라틴으로 코팅. </li><li> 세포가 자랄 때 80 %에있을 때, 각 우물에서 매체를 대기음. </li><li> 상온에서 십분 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오. </li><li> 0.3 %의 150 μL와 세포를 Permeabilize 트리톤 실온에서 5 분간 X-100 (PBS)입니다. </li><li> 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 200 μL 차단 솔루션 (PBS + 5 % 정상 염소 혈청 (벡터, S-1000))를 추가합니다. </li><li> 솔루션을 차단하는 안티 SERPHIN-1 (안티 - 토끼, 단클론 항체, 시그마, S5950-200 μL)를 1:250 희석을 준비합니다. </li><li>차단 솔루션을 spirate 및 AntiSERPINH-1의 1:250 희석 150 μl를 추가합니다. 실온에서 1-2 시간을 품다, 4 ° C에서 하룻밤. </li><li> 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오. </li><li> 솔루션을 차단에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체 (알렉사 플 루어 염소 안티 - 토끼 IgG의 (H + L), Invitrogen의, A11008)를 준비합니다. </li><li> 각 well에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체의 150 μl를 추가합니다. 상온에서, 어둠 속에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 1XPBS 한 번 우물을 씻으십시오. </li><li> PBS를 대기음,주의 깊게 그냥 슬라이드를 나타 내기 위해 챔버를 들어 올립니다. </li><li> DAPI (벡터, H-1200)를 포함하는 설치 매체의 2 ~ 3 방울 슬라이드를 장착합니다. </li><li> 형광 현미경 슬라이드를 분석합니다. </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜을 통해 피부 섬유 아세포 상대적으로 순수 배양을 얻을 수 있습니다. 섬유 아세포는 타원형 세포 핵에 둥근 길쭉한, 스핀들 같은 세포 기관의 특성을 형태 학적 특징을 가지고 때 합류 섬유 아세포는 정렬 및 번들에서 성장. 매체는 섬유 아세포의 성장 예를 들어, 각질 추가 보충 및 성장 인자를 필요로하거나 세포 분열 덜 활성화되어 다른 세포 집단 반면이 상대적으로 순수한 섬유 아세포 배양을 허용을 지원합니다. 섬유 아세포는 이후 1:5 비율 1:3 트립신으로 계대 있습니다. 문화 4-8 주 이내에 섬유 아세포의 원하는 양 (15 ~ 20 백만)으로 확장됩니다. 이 기술을 사용하여, 우리의 실험이 성공적으로 70 섬유 아세포 회선을 통해 도출 하였다. 우리는 마이코 플라스마 오염 모든 라인을 테스트하고 다른 세균 오염을 방지하기 위해 성장 매체에 항생제를 추가했다. 나에 대한nitial explant의...

<table><tbody><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 조직 배양 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트 </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 일회용 멸균 메스(2), 15번 날, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>멸균된 뾰족한 팁의 포셉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리관</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 세롤로지컬 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 세롤로지컬 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다.&quot;&gt;&lt;강한&gt;표 A. 특정 시약 및 장비 표.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM: 고농도 포도당</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% 소태아혈청</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-글루타민</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM 비필수 아미노산 </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;JoVE 단계&quot;&gt;&lt;강한&gt;표 B. 시약.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

질병을 가진 개인에서 파생 된 조직 및 세포 라인 질병 관련 세포의 표현형을 연구하는 이상적인 소스입니다. 이 프로토콜에서 환자 유래 섬유 아세포가 성공적으로 모델 병 1 유도 만능 줄기 세포의 유도에 사용되었습니다. 이 섬유 아세포의 초기 구절은 특정 질병 경로, 기계 2 및 후속 약물 검사 방식을 연구하기 위해 셀 기반 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 효소 절차를 통해 제시된 프로토콜의 장점은 1) 효소 처리를하여 노인 환자, 파킨슨 병, 2에 영향을 예를 들면 환자) 더 도전적인 방법론을 통해 기술적으로 간단한 방법에서 파생 된 조직의 소량의 기술의 재현성 및 3아르 ) 시간 고려 사항 :이 프로토콜은 15 ~ 20 분을 소요하고 생검 도착 후 바로 수행 할 수 있습니다. 효소 처리는 4 시간까지 걸릴와의 문제가있을 수 있습니다세포 생존 제대로 처리하지 세포의 후속 첨부 overdigestion, 감소. 이 프로토콜은 4 mm 인간의 피부 섬유 아세포 문화 유도를위한 생검의 해부 및 준비를 설명하고 환자 파생 된 조직 샘플을 다룰 때 중요한 매우 높은 성공률을 가지고 있습니다. 이 문화에서는, 각질이 준비 후 첫 일주일 이내에 생검 조직에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 각질의 첫 번째 파생물 후에 7-10 일이 나타납니다. 20 % FBS와 보충 DMEM 높은 포도당 미디어 각질 섬유 아세포에 섬유 아세포의 성장 각질을 자랄 것입니다 하시 더군요. 이 구절 후 각질 섬유 아세포 마커 SERPINH1 (HSP-47)를 표현 비교적 균질 한 섬유 아세포 배양 결과 중 희석되었다. 이 방법을 사용하여 15-20000000 섬유 아세포는 세포 은행을위한 4-8 주 얻을 수 있습니다. 피부 절개는 15 ~ 20 분 소요, 세포는 다음 하루에 한 번 모니터링하는현미경, 미디어 2-3 일마다 부착과 세포의 파생물 후 변경됩니다.

각질 박리 후 48 시간 자마자 생검 조각의 성장. 처음으로 섬유 아세포의 파생물은 주일 정도 처리 한 후 관찰 할 수있다. 우물 confluency에 도달하면, 섬유 아세포는 세 150cm 플라스크 (T150)에 도달하기 위해 두 개 더 구절에 대한 계대하고 세포를 냉동 보존됩니다. 우리는이 방법 15-20000000 세포를 생성합니다. 섬유 아세포는 소포체로 번역 콜라겐 특정 분자 보호자입니다 안티 SERPINH1 (또한 HSP-47라고도 함) (그림 1)에 대한 긍정적이다. HSP47은 피부 섬유 아세포의 콜라겐 생합성 (구로다, 외, 2004)에서 중요한 역할을한다. 타임 라인 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 하루 </td><td fo:width="3in"> 기대 </td></tr><tr><td> 3 일 ...

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

질환이 있는 개인으로부터 유래한 조직과 세포주는 질환 관련 세포 표현형을 연구하기 위한 이상적인 자원입니다. 환자 유래 섬유아세포는...

안녕하세요. 피부 생검 처리 비디오 튜토리얼에 오신 것을 환영합니다. 먼저 필요한 재료들을 조직 배양 후드 안에 배치하십시오. 후드 내부로 들어가는 모든 물품은 70% ethanol로 분무하고 닦아내야 합니다. 플레이트에 PI 번호, 날짜, 이니셜, 배지 종류를 표시하고, 0.1% gelatin 1 mL를 각 벽면에 넣은 뒤, 플레이트를 돌려 바닥면이 gelatin으로 코팅되도록 하십시오.사용 전 플레이트를 1시간 동안 그대로 둡니다. 첫 번째 단계는 튜브에서 생검 조직을 절단 접시로 옮기는 것입니다. 절단 접시는 생검 조직을 박절할 10 centimeter 페트리 접시의 뚜껑입니다.절단 접시의 중앙에 1.5 milliliter의 DMEM 20%FBS를 추가합니다. 배지를 중앙에서부터 바깥쪽으로 펼쳐 줍니다. 여기서 피부 생검 조직을 확인할 수 있습니다.다음 단계는 튜브에서 생검 조직을 절단 접시 중앙으로 옮기는 것입니다. 멸균 핀셋을 사용하여 피부 생검 조각을 중앙에 놓습니다. 이 과정에서 무균 상태를 유지하는 것이 필수적이므로 주의하십시오.절단 접시를 덮고 층류 후드 내의 해부 현미경으로 옮깁니다. 다음 단계는 생검 조직을 12~18개의 균일한 크기의 조각으로 해부하는 것입니다. 메스 사용 시 주의하십시오.준비가 되면 생검 조직을 덮고 있던 것을 제거하십시오. 하나의 메스를 사용하여 생검 조직을 고정합니다. 두 번째 메스를 사용하여 한 방향으로 위아래로 써는 동작을 취하십시오.생검 조직을 반으로 자릅니다. 12~18개의 조각이 될 때까지 각 조각을 계속해서 반으로 자릅니다. 각 생검 조각의 이상적인 크기는 도립 현미경의 왼쪽 접안렌즈 마이크로미터의 약 70~80%를 차지하는 정도입니다.마이크로미터 측정값의 50%보다 작은 조각은 제외하십시오. 조각의 수가 12개에서 18개가 되도록 확인하십시오. 다음 단계는 조직 배양 후드 내에서 진행합니다.커팅 디쉬를 덮고 조직 안으로 다시 옮깁니다. 조직 배양 후드에서 6-웰 플레이트의 젤라틴을 흡입하여 제거하고, 각 웰에 700 µL의 DMEM 20% FBS를 첨가합니다. 배지는 용기 벽면을 따라 첨가하는 것이 좋습니다.웰이 배지의 얇은 막으로 덮여 있는지 확인하십시오. 포셉을 사용하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 2~3개의 생검 조각을 넣습니다.두드리는 동작이나 미끄러뜨리는 동작을 사용하여 조각들이 벽 바닥에 부착되도록 합니다. 포셉에 걸린 생검 조각은 메스를 사용하여

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파킨슨 병을 일으키는 유전자에 변이를 가지고 환자의 섬유 아세포가 쉽게 접근 할 수를...

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.

피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

학습하세요 인간 피부 펀치 생검에서 섬유아세포를 유도하는 외식체 배양법을. 4-8주 내에 저대수로 1,500-2,000만 개의 세포를 냉동보관할 수 있는 이 방법은 피부 생물학 및 재생의학 연구에 필수적입니다.

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