에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

안녕하세요, 저는 인도 국립생물과학센터(National Center for Biological Sciences India)의 TUR Kika 연구실 박사후 연구원인 Shamal입니다. 이 영상에서는 일반적인 실험실 환경에서 소프트 리소그래피 기술을 이용하여 바이오 칩 마이크로 장치를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 이 장치들을 유전자 모델 생물체의 고해상도 세포 및 세포 내 이미징에 사용할 예정입니다.

본 프로토콜을 통해 연구자들은 마취제를 사용하지 않은 온전한 생체 내에서 타임랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 당사는 *C. elegans*, 온전한 초파리 및 제브라피쉬 배아와 같은 유전자 모델 생물의 마취제 없는 생체 내 이미징을 수행하기 위한 간단한 마이크로포닉 장치를 개발하였습니다.

본 연구에서는 PDMS의 소프트 몰딩 기법을 통해 제작된 막 기반의 투명 고정 장치를 선보입니다. 단일 유기체를 고정하기 위해, 실체 현미경 하에서 개별 동물을 찾아 마이크로피펫을 이용해 소량의 완충 용액 방울로 동물을 집어 올린 후, 개별 동물을 유로 채널에 삽입하여 PDMS 막 아래에 고정합니다. 3방향 볼 밸브를 통한 가압 질소 가스 연결을 사용하여 작동시킵니다.

클리닝 소프트웨어를 사용하여 마이크로 유체 구조를 설계합니다. 2 cm x 2 cm 크기의 실리콘 웨이퍼를 20% KOH 용액에서 1분 동안 세척하고 초순수로 헹굽니다. 질소 가스로 조각들을 건조시킨 후 122 °C에서 4시간 동안 탈수시킵니다.

실리콘 조각 위에 hexa metal을 500 RPM에서 5초 동안, 이어서 3000 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 실리콘 웨이퍼 위에 SU 8 2 0 2 5를 500 RPM에서 5초 동안, 이어서 2000 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 코팅된 실리콘 조각을 65 °C에서 1분 동안, 이어서 95 °C에서 10분 동안 소프트 베이크합니다.

베이킹된 SU-8 코팅 웨이퍼를 포토마스크를 통해 200W UV 램프에 노출시켜 각각 유동층(flow layer)과 제어층(control layer)을 위한 디자인 1과 디자인 2를 형성합니다. 웨이퍼를 65°C에서 1분 동안, 그리고 95°C에서 10분 동안 포스트 베이킹(post bake)합니다. SUA 현상액을 사용하여 20분 동안 조각들을 현상합니다.

데시케이터 내에서 tri chloro per fluoro CET seline 증기로 피스들을 코팅합니다. poly dyl xox 베이스와 경화제를 중량 기준 10:1 비율로 혼합합니다. 혼합 과정에서 발생한 모든 기포를 제거하기 위해 혼합물을 탈기합니다.

디자인된 SC 무게 패턴이 있는 실리콘 웨이퍼 위에 5mm 두께의 PDMS 혼합물을 붓습니다. 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 붓습니다. 유동층용 디자인이 된 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS를 균일하게 도포하기 위해 500 RPM에서 5초 동안, 그리고 1,500 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다.

PDMS가 포함된 디자인 1과 디자인 2 조각을 모두 50 °C에서 6시간 동안 굽습니다. SCH 패턴 2가 포함된 서브 블레이드를 사용하여 실리콘 기판에서 PDMS 조각을 잘라냅니다. PDMS 몰드의 메인 트랩과 연결되는 리저버 상단에 작은 구멍을 뚫습니다.

가장 얇은 펑처 니들 또는 18 gauge 니들을 사용합니다. 제어층의 바닥면과 유동층의 윗면을 18 wat 공기 플라스마에 2분 동안 노출시킵니다. 플라스마 처리된 두 표면을 가벼운 압력으로 맞닿게 놓은 후, 50 °C에서 2시간 동안 베이킹합니다.

SUH design one을 사용하여 실리콘 기판에서 접합된 소자들을 잘라내고, 유로의 입구와 출구 저장조에 액세스 홀을 뚫습니다. 소자의 바닥 PD 부분을 노출시키고 유리 커버를 세척합니다. 18 V 공기 플라스마로 2분 동안 처리합니다.

플라즈마 처리된 두 표면을 가볍게 압력을 가해 밀착시킨 후, 50 °C에서 2시간 동안 베이킹합니다. 장치는 향후 사용을 위해 깨끗한 환경에 보관하십시오. 장치 제작이 완료되면, PDMS 막을 사용하여 c. elegans를 장치 내에 고정시키는 방법을 보여드리겠습니다. 마이크로플렉스 튜브의 한쪽 끝을 가압 질소 가스 공급 레귤레이터에 연결하고, 다른 쪽 끝은 18게이지 바늘을 통해 메인 트랩 저장조에 연결합니다.

튜브 연결 중간에 사용되는 3방향 스톱콕(three-way stop cock)을 통해 멤브레인에 가해지는 압력을 조절하거나 해제할 수 있습니다. 메인 트랩의 저장소에 연결하기 전, PDMS 장치로 연결되는 튜브에 10 centimeter 높이의 증류수 기둥을 채웁니다. 질소 공급 밸브를 열어 protein PSI를 읽고, 도립 현미경의 저배율로 메인 트랩의 멤브레인이 흐름 채널 방향으로 휘어지는지 관찰합니다.

3방향 콕밸브를 열고 멤브레인을 휴지 상태로 둡니다. 유로에 버퍼를 채우고 10분 동안 유지합니다. 실험 전, 저배율 스테레오 현미경을 사용하여 단일 sea elegance를 찾습니다.

소량의 완충 용액을 사용하여 마이크로 팁으로 동물 한 마리를 선택합니다. 선택한 개체를 유로 입구로 밀어 넣습니다. 피펫팅 압력을 조절하여 개별 동물을 메인 트랩 아래에 위치시킵니다.

PDMS 막의 압력을 천천히 높여 동물을 채널 경계면에 밀착시키고 7~14 PSI의 압력으로 고정합니다. 도립 현미경을 사용하여 고해상도 명시야 또는 형광 이미징을 위한 원하는 설정으로 맞춥니다. 미리 정의된 프레임 속도로 단일 또는 시계열 형광 이미지를 획득합니다.

트랩 압력을 해제하고 동물의 운동 행동을 관찰합니다. 저배율에서 5분 동안 동물을 세척하고 새로운 동물을 삽입합니다. DevOp 단계를 반복하려면, 절단된 마이크로피펫 팁을 사용하여 단일 oph 유충을 집어 더 큰 크기의 마이크로 페릭 장치에 삽입합니다.

단일 유충을 유로 입구로 밀어 넣습니다. PDMS 막의 압력을 천천히 높여 7 ESI 압력으로 유충을 고정합니다. 저배율 형광 이미징을 위해 도립 현미경을 사용하고, 수송 이미징을 위한 타임랩스 형광 이미지를 획득합니다.

트랩 압력을 해제하고 저배율에서 유충의 운동성을 관찰하십시오. 동일한 장치 원리를 사용하여 수정 후 30시간이 지난 제브라피쉬 배아를 고정시키고 타임랩스 이미지를 획득하십시오. Val heart.

이 영상을 시청한 후, 귀하의 실험실에서 유사한 마이크로 소자를 제작하고, 이를 활용하여 고해상도의 놀라운 실험을 위한 생물체 고정 작업을 성공적으로 수행할 수 있을 것입니다. 영상을 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.