Name: 에 대한 간단한 마이크로 유체 장치 생체 내 이미징 C. elegans Drosophila와 Zebrafish (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 마취 없이 C. elegans, Drosophila, zebrafish를 고정하는 PDMS 멤브레인 기반 마이크로유체 장치 제작법. 시간 경과 이미징으로 심장 박동, 세포 분열, 신경 운반을 관찰합니다.

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우리는 C.에 nuIs25과 CGC를 들어, Drosophila 새장을 유지하기위한 Drosophila 주식, Tarjani Agarwal에 피터 Juo을 박사 Krishanu 레이 감사 elegans 긴장. SPK는 마이클 구 중창단의 연구실에서 jsIs609했다. 우리는 마이크로 유체 장치에서 jsIs609 동물의 미토콘드리아 교통 시간 경과 영상에서 자신의 도움을 Arpan Agnihotri (BITS Pilani)을 감사드립니다. 우리는 zebrafish 배아으로 우리를 제공하는 박사 Vatsala Thirumalai 및 Surya Prakash에 감사하고 있습니다. 우리는 나노 기술 (제 SR/55/NM-36-2005)의 과학 기술 - 센터의 부서에 의해 지원 회전 디스크 공 촛점 현미경의 사용에 대한 NCBS에서 박사 크리슈나와 CIFF 감사드립니다. 우리는 또한 토론을 Kaustubh Rau, V. Venkatraman과 Chetana Sachidanand 감사드립니다. 이 작품은 DBT 후 박사 휄로 십 (SM), DST 빠른 속도로 트랙 체계 (SM)와에 DBT 부여 (SPK)에 의해 재정 지원되었다. SA는 SPK에 DST와 CSIR 보조금에 의해 지원되었다.

1. SU8 마스터 제작 <ol><li> Clewin 소프트웨어를 사용하여 마이크로 유체 구조를 설계하고 회로 기판 필름 8 μm의 최소 기능 크기 65,024 DPI 레이저 플로터를 사용하여 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 흐름 층과 상응하는 제어 계층에 대해 하나의 웨이퍼 각, 1 분 및 탈 이온수에 씻어 20 % 코에서 네이티브 산화를 2cm X 2cm 실리콘 웨이퍼를 청소합니다. </li><li> 질소 가스로 조각을 건조 4 시간에 120 ° C에서 핫 플레이트에 탈수 불어. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 장소 실리콘 조각 스피너 척에 한 번에 한하고 진공을 설정합니다. ~ 20 μl 헥사 메틸 디 실라 잔 - (HMDS)와 코트들을 사용하여 초, 30 초에 3,000 rpm에서 다음 5 500 rpm으로 SPIN150 회 전자.에게로 실리콘 표면을 커버 </li><li> SU8-2025의 ~ 1.5 ML (와 완전히 실리콘 웨이퍼를 커버 <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://를</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm)과 5 초 500 rpm으로 SPIN150 스피너를 사용하여 코트 웨이퍼는 30 초에 2,000 RPM이 나타납니다. 이 회전 프로토콜은 C.의 조기 애벌레의 단계에 대한 제어 및 흐름 층에 적합합니다 ~ 40 μm의 포토 레지스트 두께를 생산 elegans. </li><li> 스핀 ~ 5 500 rpm으로 SPIN150 스피너를 사용하여 1.5 ML SU8 - 2050 초는 C의 말 애벌레의 단계에 대한 흐름 계층 제조에 적합합니다 ~ 80 μm의 포토 레지스트 두께를 얻기 위해 30 초에 2,000 RPM 다음 elegans, Drosophila / zebrafish 애벌레와 해당 컨트롤 레이어에 대한 기저 유량 층. </li><li> 상단에있는 SU8 코팅 레이어와 핫 플레이트에 실리콘 조각을 놓으십시오. 소프트 베이킹 65 코팅 실리콘 조각 ° C 10 분 동안 95 ° C에 이어 1 분에. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> SU8-2025 코팅 쉬르로 노출 무대에서 부드러운 구운 실리콘 조각을 놓으십시오UV 램프를 직면 상단에있는 얼굴. C.의 조기 애벌레의 단계에 대한 각각의 흐름 계층과 제어 계층 패턴을 설계 I (L1, 그림 1B) 및 설계 II (L2, 그림 1b)와 사진 마스크를 사용하여 elegans. SU8 층의 상단에있는 사진 마스크​​를 놓고 마스크가 코팅 층에 대한 평평 보장합니다. UV 램프의 셔터를 열고 15 초 동안 사진을 마스크를 통해 200 와트 UV 램프에 부드러운 구운 SU8 웨이퍼을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> C. 월말 애벌레의 단계에 대한 흐름 계층과 제어 계층을 조작하는 (단계 1.6에서 작성) SU8-2050 코팅 조각에 설계 I (L1, 그림 1B) 및 설계 II (L2, 그림 1b)와 사진 마스크를 사용하여 elegans. (I을 준비 SU8-2050으로 코팅 웨이퍼에 Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 각각 기저 흐름 계층과 제어 계층을위한 디자인 I (L1, 그림 1C) 및 설계 II (L2, 그림 1C)와 사진 마스크를 사용하여N 단계 1.6). 15 초에 200 와트 UV 램프에 사진 마스크​​를 통해 SU8 표면을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 상단에 코팅 층과 핫 플레이트에 노출 된 실리콘 조각을 놓으십시오. 10 분 동안 95 ° C에 이어 1 분에 65 ° C에서 웨이퍼를 구워 게시합니다. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 20 분의 SU8 개발자 솔루션을 사용하여 조각을 개발할 수 있습니다. 이소 프로필 알코올 (IPA)의 조각을 씻어 건조하여 질소 가스를 불어. </li><li> 상단에있는 SU8 패턴으로 건조기의 실리콘 조각을 놓으십시오. tricholoro 50 μl (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 시간을위한 건조기에 실란 증기로 코팅 조각. </li></ol> 주의 사항 : 코 처리, 포토 레지스트 코팅 및 개발 기간 동안 화학 물질 취급에 대한 안전주의 사항을보십시오. 실란 증기 코팅은 통풍이 지역에서 건조기 내에서 수행해야합니다. 보호 SU8 빛에 노출 이상에서 저항. UV lig와 보호용 안경을 사용하여HT 소스. 2. PDMS 금형 제작 <ol><li> 플라스틱 컵에 경화 에이전트 5g과 Sylgard 184베이스 50g를 결합하여 10시 1분 PDMS를 준비합니다. ~ 3 분 동안 수동으로 내용을 섞는다. 혼합하는 동안 형성된 모든 기포를 제거 할 수있는 건조기 내부의 가스를 제거하다의 혼합물. </li><li> 기포 형성을 피하기 위해 부드럽게, 제어 계층을 위해, 디자인 II의 SU8 패턴을 실리콘 웨이퍼 위에 5mm 두께 PDMS 혼합물을 부어. 경우 거품은 모든 거품을 제거하는 낮은 진공의 SU8 패턴에 가스를 제거하다 PDMS를 주입하는 동안 형성된다. </li><li> 스피너 척에 흐름 층을 위해 디자인 I의 SU8-2025 패턴으로 실리콘 웨이퍼를 배치하고 잡아 진공을 설정합니다. ~ 1 PDMS 믹스의 ML와 코트 5 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용하여 웨이퍼와 웨이퍼를 커버 초는 30 초에 1,500 RPM이 나타납니다. </li><li> 코트 ~ 디자인 I (L1, 그림 1b)의 SU8-2050 패턴 80 μm와 실리콘 웨이퍼에 1 ML PDMS 혼합, 용C. 월말 애벌레의 단계에 대한 흐름 층 5 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용 elegans는 30 초에 1,000 RPM이 나타납니다. 코트 35 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용 Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 흐름 계층 설계 I (L1, 그림 1C)의 SU8-2050 패턴과 실리콘 조각에 PDMS 믹스의 두꺼운 층. </li><li> 디자인의 굽 PDMS 코팅 실리콘 조각은 I 및 제어 계층에 대한 해당 디자인 II와 웨이퍼는 C.에 PDMS를 포함하는 50 뜨거운 공기 대류 오븐에 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레 ° 6 시간에 C. </li><li> C.에 대한 SU8 패턴 II를 포함하는 실리콘 기판에서 PDMS 조각을 잘라 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레는 날카로운 칼날을 사용합니다. 해리스 구멍을 뚫는를 사용하여 PDMS 금형의 주요 함정을 연결하는 저수지 상단에 ~ 1mm 직경의 작은 구멍을 펀치. </li><li> 천공 PDMS 블록을 (제어를위한 40 μm 두께의 금형을 포함하는 장소최대 직면하고있는 제어 계층의 성형면과 플라스틱 트레이에 레이어 L2). PDMS 코팅 표면이 위로 향한와 같은 트레이에 40 μm 두께의 SU8 디자인 I가 포함 된 PDMS 코팅 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 플라즈마 클리너의 챔버 내부 트레이를 넣고 2 분의 진공을 설정합니다. 그 후, 플라즈마 전원을 켜고 챔버 색 빛 핑크색을 화나게 할 때까지 챔버 압력을 낮 춥니 다. 2 분을위한 저 진공에서 18 와트 공기 플라즈마에 두 표면을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> C. 월말 애벌레의 단계에 두꺼운 SU8 마스터 포함하는 패턴 II 80 μm에서 제거 천공 PDMS 블록을 삽입합니다 최대 직면하고있는 제어 계층의 성형면과 플라스틱 트레이에 elegans 나 Drosophila / zebrafish 애벌레. 나중에 C.에 대한 I 80 μm 두께의 디자인을 포함하고있는 실리콘 웨이퍼에 코팅 해당 구운 PDMS 층 스핀을 놓습니다 elegans 단계 또는 평면 PDMS 코팅의와 동일한 트레이에서 동시에 Drosophila / zebrafish는 애벌레urface가 마주보고 있습니다. 같은 프로토콜을 사용 공기 플라즈마에 노출하기 위해 위에서 언급 한. </li><li> C.에 대한 두 개의 플라즈마 처리 표면을 배치 elegans 및 / 또는 함께 부드러운 압력과 2 시간에 50 ° C에서 그들을 뜨거운 공기의 대류 오븐에서 빵을 구워과 Drosophila / zebrafish 애벌레. </li><li> C.에 대한 SU8 디자인 I와 실리콘 기판에서 보세 장치를 잘라 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레. 펀치 액세스 유동 채널의 입구와 출구 저수지에서 구멍. </li><li> C.를위한 플라스틱 트레이에 보세 PDMS 금형을 배치 최대 직면하고있는 유동 레이어 디자인의 성형 측면과 elegans. 클린 유리 커버 슬립 (22 X 22mm, 제 1 두께) 같은 플라스틱 트레이에 놓습니다. PDMS 몰드와 플라즈마 챔버 내부에 유리 커버 슬립이 포함 된 트레이를 삽입합니다. 맨 아래 장치의 PDMS 표면과 유리 커버 슬립 18 2 분에 대한 낮은 압력의 와트 공기 플라즈마를 쉽게받을 수 있습니다. 세대와 함께 두 개의 플라즈마 처리 표면을 배치tle 압력과 2 시간에 50 ° C에서 그들을 뜨거운 공기의 대류 오븐에 구워. </li><li> 나중에 사용할 수 있도록 깨끗한​​ 환경에서 장치를 저장합니다. </li></ol> 3. Drosophila / Zebrafish 장치에 대한 추가 단계 <ol><li> 깨끗한 유리 크기의 표면 2cm tricholoro의 50 μl와 X 2cm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 시간을위한 건조기에 실란 증기.를 노출 </li><li> 스핀 ~ 35 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용하여 silanized 유리 표면에 단계 2.1 준비 10시 1분 PDMS 믹스 1 ML. 최대 직면하고있는 코팅면 6 시간 50 ° C의 뜨거운 공기 오븐에서 PDMS 코팅 유리 기판을 구워. PDMS 층이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 펀치 PDMS 스페이서 층을 형성하기 위해 PDMS의 중간에서 사용자 정의 구축 날카로운 금속 구멍을 뚫는를 사용하여 코팅 층. 금속 구멍을 뚫는의 모양은 Drosophila / zebrafish의 흐름 설계 (L1, 그림 1C와 비슷한 설계되어 있습니다 </str긴 사연&gt;). </li><li> PDMS 스페이서 층과 낮은 진공에서 플라즈마 클리너를 사용하여 단일 보세 블록 (Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 단계 2.9에서 만든 흐름 계층과 제어 계층) 18 와트 공기 플라즈마에 노출. 함께 두 개의 플라즈마 처리 표면을 놓고 50 뜨거운 공기 오븐 ° C 2 시간 동안을 구워. </li><li> 유리 접합 장치를 잘라 입구와 출구 저수지와 단계 2.11에서 설명 드린 바와 같이 플라즈마 클리너를 사용하여 유리 커버 슬립 (22 X 22mm, 제 1 두께)에 본드를의 펀치 액세스 구멍. 이 ~ 500 μm의 채널 높이 첫번째 instar Drosophila의 애벌레에 고정 장치를 생산합니다. zebrafish의 애벌레를 들어, 추가 본딩 단계로 PDMS 스페이서 층 제조 공정을 복제. PDMS-S의 듀얼 레이어 30 hfp zebrafish의 애벌레 900 μm의 채널 높이를 생산하고 있습니다. </li></ol> 주의 사항 : 장치 제조 중에 먼지 입자를하지 마십시오. 두 플라즈마 표면을 청소s은 (는) 올바른 결합을 위해 무료 완전히 먼지가 있어야합니다. 특별한 클린 룸이 장치에서 먼지 입자의 축적을 최소화하기 위해 사용할 수없는 상황에서 건조기에 장치를 저장합니다. 4. PDMS 막 사용 <ol><li> 18 게이지 바늘 (외경 ~ 1.25 mm)를 통해 가압 질소 가스 공급 조정기와 주요 트랩 저수지에 다른 쪽 끝으로 마이크로 플렉스 튜브 (내경 ~ 1.6 mm, 외경 ~ 4.8 mm)의 한쪽 끝을 연결합니다 관에 접착. 튜브 연결의 중간에 사용되는 3 방향 꼭지는 막에 응용 프로그램 또는 압력을 릴리스 할 수 있습니다. </li><li> C.의 주요 트랩의 저수지에 연결하기 전에 증류수 10cm 열로 PDMS 장치에 연결된 관을 채우기 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레 장치. </li><li> 14 PSI를 읽고 일을 향해 편향의 주요 트랩의 멤브레인을 모니터링 할 질소 공급 장치의 밸브를 돌려역 현미경의 낮은 배율의 전자 흐름 채널. 마이크로 플렉스 관에서 물이 칼럼의 길이는 3 방향 꼭지가 열려있을 때마다 압축됩니다. 편향된 멤브레인의 가장자리는 전송 된 빛 (그림 1I 및 1J)에서 볼 수 있습니다. 막 편향은 PDMS 막 아래에 먼지 입자 / 기포의 변위가 발생하고 채널 경계로 등록합니다. </li><li> 액체 앞에 어떤 갇힌 공기없이 완전히 microchannel을 가득 때까지 기다립니다. </li><li> 의 휴식 위치로 막을 완화하기 위해 3 방향 꼭지를 사용하여 압력을 놓습니다. </li></ol> 5. C. 삽입 elegans, Drosophila와 Zebrafish 장치에 애벌레와 유연한 PDMS 막에서 그것들을 Immobilizing <ol><li> M9 버퍼와 흐름 채널을 채우기 [3 g KH 2 PO 4, 6g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 ML 1 M MgSO 4, L에 H 2 O는 AUT에 의해 소독oclaving] C.에 elegans 18 1X PBS하기 전에 10 분 동안 Drosophila / zebrafish 애벌레 19 번 좌석을 [8g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g 오세영 2 HPO 4, 0.24 g KH 2 PO 4, H 2 O 한 L로는 autoclaving하여 소독]를 실험. </li><li> 단일 C.를 찾습니다 낮은 배율 스테레오 현미경을 사용하여 NGM 플레이트 (18)에 필요한 단계 elegans (또는 한천 달걀 판이나 액체 배지 20 년 수동 dechorionated 30 hpf의 zebrafish 애벌레의 첫 번째 instar Drosophila의 애벌레). 마이크로 팁에 완충 용액의 작은 볼륨을 사용하여 하나의 동물을 선택하십시오. 그 끝 마이크로 팁을 사용 큰 Drosophila 또는 버퍼에 zebrafish의 유충을 수용 할 수 자른다. </li><li> 유동 채널 입구를 통해 하나의 유기체를 밀어 넣습니다. 메인 트랩에서 각각의 동물을 배치 할 수있는 pipetting 압력을 조정합니다. </li><li> 천천히 짱에 대한 동물을 위치로 PDMS 막에 압력을 증가nel 경계와 C. 14 PSI 압력으로 고정 elegans, Drosophila와 zebrafish 애벌레 3 PSI 7 프. </li><li> 뷰의 미세 분야의 중심에 고정 동물을 배치합니다. 고해상도 밝은 필드 또는 형광 이미징에 대한 원하는 설정의 역 현미경을 사용하십시오. 미리 정의 된 프레임 속도에서 단일 또는 시간 경과 형광 이미지를 취득. </li><li> 트랩 압력을 해제 낮은 배율에서 5-10 분을위한 동물의 운동을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 동물을 플러시하고 위​​의 단계를 반복 할 새로운 동물을 삽입합니다. </li><li> 주사기를 사용하여 적용 증류수를 사용하여 폐기물 저장소에서 모든 동물을 씻으십시오. 향후 재사용을 위해 주사기를 사용하여 공기를 밀어하여 채널을 말린다. </li></ol> 주의 사항 : 주 채널 내부의 흐름에 높은 pipetting 압력을 필요로하는 동물이 덫에서 출시 후 가난한 운동 / 건강을 표시하는 경향과 IMA를 위해 피해야한다ging. 결정에 의해 채널의 막힘을 방지하기 위해 버퍼의 흔적에 대한 흐름 채널을 청소하십시오. 기름은 고해상도 이미징에 사용되는 경우, 이후의 실험에 대한 잡음 비율에 좋은 신호를 유지 할 수 있도록 유리 커버 슬립을 청소.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

PDMS 마이크로 유체 장치는 따라서 모든 반투명 / 투명 모델 생물의 생체 이미징의 높은 해상도에 사용할 수 있습니다 광학적으로 투명합니다. 우리 디자인은 그대로 살아있는 동물의 세포와 하위 세포 사건의 높은 배율 spatio - 시간적 이미지에 적합합니다. 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 Microfabrication 모델 생물의 다양한 크기 장치 크기를 쉽게 조작 할 수 있습니다. 다양한 크기의 디바이스는 C.의 다른 단계에 대한 제조된다 elegans, Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 자신의 흐름 레이어 채널 40 μm 80 μm의 다른 높이와 장치 개선 고정하고 나중에 모두 (L1) 초기 및 더 나은 후 이미징 건강 (말 L4) C.의 단계를 보여 각각 elegans. 우리는 C.에 대한 장치 제조에서 100 % 성공률을 달성 결함 장치없이 elegans와 Drosophila /...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 실리콘 웨이퍼 </td><td> 대학 웨이퍼 </td><td> 150mm (100) Mech 학년 SSP시 </td><td></td></tr><tr><td> Clewin 소프트웨어 </td><td> WieWeb 소프트웨어 </td><td> 버전 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> 레이저 플로터 </td><td> 파인 선 영상 </td><td> 65,024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> 개발자 </td><td> Microchem </td><td> SU8 개발자 </td><td></td></tr><tr><td> 실란 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> UV 램프 </td><td> 출창 </td><td> 66,943 </td><td> 200W HG 출창 빛 </td></tr><tr><td> 뜨거운 공기 오븐 </td><td> 울트라 악기 </td><td> 사용자가 만든 </td><td> 50 ° C로 설정 </td></tr><tr><td> 핫 플레이트 </td><td> IKA 연구실 장비 </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> 플라즈마 청소기 </td><td> Harrick 플라즈마 </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> 스피너 </td><td> 반도체 생산 시스템 </td><td> SPIN150 - NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS - Europe.com</a> </td></tr><tr><td> 유리 커버 슬립 </td><td> 골드 인감 </td><td> 22 X 22mm, 두께 1 위 </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> 블루밍턴 </td><td> P {chaGAL4} / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafish </td><td> 인도 야생 유형 </td><td> 야생 유형 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon 관 </td><td> 시그마 </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 바늘 </td><td> 시그마 </td><td> Z118044 </td><td> 1cm의 조각으로 잘라 내기 </td></tr><tr><td> 3 방향 꼭지 </td><td> 시그마 </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> 해리스 구멍을 뚫는 </td><td> 시그마 </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> 압축 질소 가스 </td><td> 지역 가스 공급 업체 </td><td></td><td> 압력을 제어하는​​ 조절기를 사용하여 </td></tr><tr><td> 스테레오 현미경 &lt;/ TD&gt; <td> 니콘 </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> ANDOR 및 올림푸스 </td><td> 요코가 회전 디스크 공 촛점 현미경 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 건강의 국립 연구소 </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / 엘 제이</a> </td><td> 자바 기반의 이미지 처리 프로그램 </td></tr></tbody></table>

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; c. elegans</em&gt;<em&gt; drosophila</em&gt;와 zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

마이크로 가공 유체 장치는 작은 생물의 생체 연구에 대한 접근 마이크로 환경을 제공합니다. 간단한 제조 공정은 소프트 리소그래피 기술 1-3을 사용하여 마이크로 유체 장치에서 사용할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 생체 레이저 미세 2,6 및 셀룰러 이미징 4,7에서 하위 세포 이미징 4,5에 사용되었습니다. 생체에서 영상이 생물의 고정이 필요합니다. 이것은 흡입 5,8을 사용하여 달성되었습니다 테이퍼 채널 6,7,9, 변형 멤브레인 2-4,10, 추가 냉각 5, 마취 가스 11, 온도에 민감한 젤 12, 시아 노 아세틸렌 접착제 13 등 levamisole 14 등 anesthetics와 흡입 15. 일반적으로 사용 anesthetics는 시냅스 전송 16,17 영향을 미치는와 하위 세포 neuronal 교통 4 해로운 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 이 성에서udy 우리는 Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레로 그대로 유전 모델 생물의 마취 무료로 고정 할 수 있습니다 폴리 디메틸 실록산 - (PDMS) 장치 기반 멤브레인을 보여줍니다. 이 모델 생물로 인해 자신의 작은 직경과 광학적 투명 또는 반투명 기관의 마이크로 유체 장치에서 생체의 연구에 적합합니다. 바디 직경은 C.의 조기 애벌레의 단계에 대해 ~ 10 μm ~ 800 μm의에 다양 elegans와 zebrafish 애벌레와 고해상도 시간 경과 영상에 대한 완전한 고정을 달성하기 위해 서로 다른 크기의 마이크로 유체 장치가 필요합니다. 이 생명체는 액체 열을 통해 압축 된 질소 가스에 의해 적용 역 현미경을 사용하여 이미지로 압력을 사용하여 고정합니다. 함정에서 출시 된 동물은 10 분 이내에 정상 운동으로 돌아갑니다. 우리는 C.에 시간 경과 영상의 네 개의 응용 프로그램을 보여줍니다 elegans즉, 뉴런의 이미지 mitochondrial 교통, 교통 - 결함이있는 돌연변이, glutamate 수용체 운송 및 Q의 neuroblast의 세포 분열에 미리 신경 소포 전송. 같은 영화에서 얻은 데이터는 마이크로 유체 고정이 anesthetized 동물 (그림 1J와 3C-F 4)에 비해 휴대 및 하위 세포 사건의 생체 데이터를 수집하는 유용하고 정확한 방법입니다 보여줍니다. 장치 크기가 C. 서로 다른 단계의 시간 경과 영상을 허용하도록 변경되었습니다 elegans 먼저 instar Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 감각 뉴런에 GFP (syt.eGFP)로 태그를 synaptotagmin로 표시 소포의 운송은 그대로 첫번째 instar Drosophila의 애벌레의 cholinergic 감각 뉴런으로 표현 시냅스 소포 마커의 이동 움직임을 보여줍니다. 유사한 장치 ~ 30 시간 게시물 수정을 (hpf)에 심장 박동의 시간 경과 영상을 수행하는 데 사용되었습니다애벌레를 zebrafish. 이러한 데이터는 우리가 개발 한 간단한 장치가 생체에 여러 세포 생물학 및 발달 현상을 연구하는 모델 시스템의 다양한에 적용 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다.

흐름 층 (레이어 1) 및 제어 계층 (레이어 2) 그림 1과 같이 : 고정 장치는 본딩 두 레이어에 의해 제조 이중층 PDMS 블록입니다. 주요 트랩이 레귤레이터와 액체 열 (그림 1A)를 통해 막 위에 필요한 (3-14 PSI) 압력을 적용 할 수있는 3 방향 스톱 콕을 통해 질소 가스 실린더에 연결되어 있습니다. 편향 멤브레인은 C.를 움직이게 다른 크기 (그림 1B와 1C)와 설계 흐름 채널에 elegans, Drosophila 또는 zebrafish 애벌레. 사진 마스크는 C.에 대해 서로 다른 형상으로 고정 장치 레이어를 설계하는 데 사용됩니다 elegans (그림 1D), Drosophila의 애벌레 (그림 1 층)와 zebrafish의 애벌레 (그림 1G).</stron...

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해 개발되었습니다<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;, 그대로<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 이 장치는 심장 박동, 세포 분열 및 하위 세포 neuronal 교통 등 다양한 과정의 시간 경과 영상을 수행하기 위해이 모델 생물을 고정 할 수있는 변형 PDMS 막을 활용합니다. 우리는이 장치의 사용을 설명하고 다른 모델 시스템에서 수집 된 데이터의 다양한 유형의 예를 보여줍니다.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

미세 가공 유체 소자는 소형 생물체에 대한 생체 내(in vivo) 연구를 위한 접근 가능한 미세 환경을 제공합니다. 간단한 제작 공정은...

안녕하세요, 저는 인도 국립생물과학센터(National Center for Biological Sciences India)의 TUR Kika 연구실 박사후 연구원인 Shamal입니다. 이 영상에서는 일반적인 실험실 환경에서 소프트 리소그래피 기술을 이용하여 바이오 칩 마이크로 장치를 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 이 장치들을 유전자 모델 생물체의 고해상도 세포 및 세포 내 이미징에 사용할 예정입니다.본 프로토콜을 통해 연구자들은 마취제를 사용하지 않은 온전한 생체 내에서 타임랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 당사는 *C. elegans*, 온전한 초파리 및 제브라피쉬 배아와 같은 유전자 모델 생물의 마취제 없는 생체 내 이미징을 수행하기 위한 간단한 마이크로포닉 장치를 개발하였습니다.본 연구에서는 PDMS의 소프트 몰딩 기법을 통해 제작된 막 기반의 투명 고정 장치를 선보입니다. 단일 유기체를 고정하기 위해, 실체 현미경 하에서 개별 동물을 찾아 마이크로피펫을 이용해 소량의 완충 용액 방울로 동물을 집어 올린 후, 개별 동물을 유로 채널에 삽입하여 PDMS 막 아래에 고정합니다. 3방향 볼 밸브를 통한 가압 질소 가스 연결을 사용하여 작동시킵니다.클리닝 소프트웨어를 사용하여 마이크로 유체 구조를 설계합니다. 2 cm x 2 cm 크기의 실리콘 웨이퍼를 20% KOH 용액에서 1분 동안 세척하고 초순수로 헹굽니다. 질소 가스로 조각들을 건조시킨 후 122 °C에서 4시간 동안 탈수시킵니다.실리콘 조각 위에 hexa metal을 500 RPM에서 5초 동안, 이어서 3000 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 실리콘 웨이퍼 위에 SU 8 2 0 2 5를 500 RPM에서 5초 동안, 이어서 2000 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 코팅된 실리콘 조각을 65 °C에서 1분 동안, 이어서 95 °C에서 10분 동안 소프트 베이크합니다.베이킹된 SU-8 코팅 웨이퍼를 포토마스크를 통해 200W UV 램프에 노출시켜 각각 유동층(flow layer)과 제어층(control layer)을 위한 디자인 1과 디자인 2를 형성합니다. 웨이퍼를 65°C에서 1분 동안, 그리고 95°C에서 10분 동안 포스트 베이킹(post bake)합니다. SUA 현상액을 사용하여 20분 동안 조각들을 현상합니다.데시케이터 내에서 tri chloro per fluoro CET seline 증기로 피

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

대규모 2D 전자 현미경(EM) 또는 나노토미는 나노 단위 해상도 EM의 조직 전체 응용 분야입니다. 여기에서는 제브라피시 유충의 뇌의 건강과 비침습적 뇌 손상을 조사하기 위해 적용되는 보편적인 나노절개술 방법을 설명합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

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이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 적층을 사용하여 미세유체 장치를 제조하는 혁신적인 방법은 여러 개의 살아있는 제브라피시 배아를 포획하고 이미징하는 비용과 복잡성을 크게 줄여줍니다.

저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

배우세요 마취 없이 C. elegans, Drosophila, zebrafish를 고정하는 PDMS 멤브레인 기반 마이크로유체 장치 제작법. 시간 경과 이미징으로 심장 박동, 세포 분열, 신경 운반을 관찰합니다.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

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