Drosophila melanogaster를위한 지구력 훈련 프로토콜과 세로 성능 Assays

다음 실험의 목적은 새로운 지구력 운동 프로그램을 사용하여 Dsof 및 Melanogaster를 훈련시키고 운동 훈련의 효과를 평가하는 것입니다. 이는 파리가 담긴 여러 개의 바이알을 반복적으로 들어 올렸다가 떨어뜨려 파리의 본능적인 등반 반응을 활성화함으로써 파리에게 운동 세션을 제공하는 자동화된 장치를 사용하여 수행됩니다. 파리들은 3주간의 훈련 기간 동안 하루 2~3시간의 점진적 일정에 따라 매일 훈련을 받습니다.

다음으로 운동의 효과를 측정하기 위해 초파리를 다양한 행동 분석 실험에 투입합니다. 결과에 따르면, 급격히 유도된 음성 지오액시스(negative geo axis) 또는 링 분석(ring assay)으로 측정했을 때 운동을 한 초파리가 더 빠르게 상승하는 것으로 나타납니다. 다른 동물을 대상으로 하는 지구력 훈련과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 초파리 유전학 조작을 위해 사용할 수 있는 방대한 도구들이 갖춰져 있다는 점입니다.

지구력 운동 연구에서, 저희는 많은 단일 음성 지오택시스(negative geotaxis) 분석을 수행하던 중 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 저희는 파리가 얼마나 오랫동안 계속해서 오를 수 있는지, 그리고 이러한 방식으로 지구력 훈련을 시킬 수 있을지 궁금했습니다. 파워 타워(power tower)는 테이블에 고정된 직사각형 합판 위에 구축됩니다.

분당 4.5회전(rpm)입니다. 기어 모터는 여러 개의 보드 위에 놓여 있으며, 속도 조절기, 퓨즈 및 전원 스위치에 연결되어 있습니다. 정션 박스 내의 금속 튜브에 고정된 3인치 팬이 모터의 냉각을 위해 모터 방향으로 작동합니다.

모터에는 롤러가 달린 회전 암이 연결되어 있습니다. 모터와 암이 회전하면 합판에 부착된 굽은 막대의 한쪽 끝을 아래로 밀어내게 됩니다. 막대의 반대편에는 도어 힌지가 있으며, 플랫폼에 맞닿아 구를 수 있도록 바퀴가 부착되어 있습니다.

모터가 회전함에 따라 위아래로 움직이며, 모터의 출력은 전체 회전 주기가 15초가 되도록 조정됩니다. 플랫폼 위에는 초파리 바이알 랙이 번지 코드로 고정되어 있으며, 이 랙에 배치된 바이알들은 역시 플랫폼에 부착된 스크린으로 고정됩니다. 플랫폼은 번지 코드를 통해 표준 서랍 슬라이더를 따라 위아래로 미끄러지듯 이동할 수 있으며, 스티로폼 쿠션이 하강 시의 충격을 완화합니다. 파워 타워는 동물이 사육되는 조건과 일치하도록 온도 조절실에서 작동됩니다.

운동 실험을 수행하려면 지구력과 음의 지오축(negative geo axis) 또는 등반 능력을 종단적으로 모니터링하기 위해 연령이 일치하는 수컷 초파리가 최소 240마리 필요합니다. 초파리를 바이알당 20마리씩 군집으로 유지하십시오. 바이알을 동일한 크기의 두 그룹으로 나누는데, 그중 한 그룹은 운동 그룹으로 설정하여 플러그(flugs)로 막고, 대조군 그룹의 바이알은 스펀지 마개로 막아야 합니다.

스펀지는 크기 조절이 가능하여 바이알 바닥 근처에 쉽게 배치할 수 있으므로 고정용으로 사용됩니다. 또한, 더 부드러운 스펀지 재질은 더 단단한 플러그로 인해 발생하는 부상을 줄여줍니다. 먹이 바이알은 테스트 전 격일로 교체해야 합니다.

훈련 과정 동안 초파리는 먹이가 들어 있는 바이알에 그대로 둡니다. 빈 바이알을 사용할 경우 훨씬 더 많은 초파리가 훈련과 관련된 부상을 입기 때문입니다. 대조군 초파리가 담긴 바이알을 파워 타워에 올릴 때, 스펀지 마개를 먹이 표면에서 약 3mm 높이까지 눌러 초파리의 이동 범위를 제한하십시오.

일관된 결과를 위한 이동. 매주 5일 연속으로 두 그룹의 초파리를 테스트하며, 3주 동안 세션당 시간을 하루 2시간에서 3시간으로 점진적으로 늘리는 일정을 활용하십시오. 물론, 어떠한 체계라도 적용할 수 있습니다.

3주간의 기간 동안 처치, 수행 시간 및 분석 방법의 일관성을 유지하는 것이 필수적입니다. 세심한 일정 계획과 절차 연습을 통해 피로로 인한 오류 가능성을 줄일 수 있습니다. 분석은 훈련 체계 전, 후 또는 도중에 초파리를 대상으로 종단적으로 수행할 수 있습니다.

또한 이를 통해 환경 변수에 대한 더 안전한 반응을 평가할 수 있습니다. 훈련이 진행되지 않는 날에 피로도 분석(fatigue assay)을 수행하십시오. 하루의 시작 단계에서 두 그룹의 초파리를 파워 타워(power tower)에 올리십시오.

장치를 활성화하고 10분마다 각 바이알을 관찰합니다. 4회 연속 측정 시, 바이알 내의 초파리 5마리 이하만이 2인치보다 높게 올라간다면 해당 코호트는 피로한 상태로 간주합니다. 장치가 작동하는 동안 피로한 초파리들을 파워 타워에서 제거하고 제거된 시간을 기록합니다.

모든 바이알을 최대 10시간 동안 관찰하고 결과를 수집하십시오. 정량을 위한 한 번의 분석을 수행합니다. 훈련의 효과는 달리기 속도를 매일 측정하여 확인하며, 이는 훈련 기간 전체와 그 이후에도 수행할 수 있습니다.

훈련의 장기적인 효과를 측정하기 위해서입니다. 등반 속도 또는 링 분석(ring assay)을 시작하려면, 먼저 초파리를 새로운 빈 바이알로 옮긴 다음 바이알 랙에 바이알 6개를 한 줄로 배치합니다. 바이알을 랙에 고정하기 위해 말아놓은 테이프 조각을 사용합니다.

그런 다음 vial들을 고르게 조명할 수 있는 x-ray 뷰 박스와 같은 광원 앞에 랙을 배치합니다. 이제 각 vial 내의 파리 위치가 보일 수 있도록 랙을 촬영할 카메라를 설치합니다. 그다음 6개의 vial을 톡톡 쳐서 모든 파리를 vial 바닥으로 떨어뜨린 후, 시간을 맞춰 사진을 촬영합니다.

초파리가 모두 마취되어 쓰러진 후 2초 뒤에 측정합니다. 카메라 플래시를 사용하는 경우, 모든 측정에 일관되게 사용해야 합니다. 파워 타워(power tower) 단계를 진행하기 전에 각 바이알 세트마다 이 과정을 4회 반복하십시오.

데이터를 분석하기 위해, 소프트웨어를 사용하여 각 사진의 바이알 상단 및 하단 경계를 찾아 개별적으로 점수를 매깁니다. 그런 다음 각 초파리의 등반 높이를 측정합니다. 이후 측정된 등반 높이를 Excel로 복사합니다.

각 바이알의 초파리마다 사분면의 높이에 해당하는 0점에서 4점까지의 점수를 부여합니다. 가장 높은 사분면까지 올라가면 4점을 부여하고, 전혀 올라가지 못하면 0점을 부여합니다. 각 바이알에 대해 초파리 20마리 각각의 점수를 계산하고, 해당 그룹의 평균 점수를 구합니다.

이를 등반 지수라고 합니다. 해당일의 각 코호트별 4회 등반 지수의 평균값이 데이터 분석에 사용됩니다. 이미지 처리 소프트웨어를 사용할 수 없는 경우, 빈 바이알에 사분면 선을 그려 초파리를 수동으로 사분면 값에 할당할 수 있으며, 특정 유형의 초파리는 연령 증가에 따른 등반 능력 저하가 감소한 상태로 지구력 프로토콜에 반응했습니다.

이는 5주령까지 5주 동안 진행된 종단적 링 분석(ring assay)에서 나타난 것과 같이 훈련 종료 후에도 지속되었습니다. 따라서 파워 타워 프로그램을 통한 운동 유도는 행동학적 입력으로 사용될 수 있으며, 유전적 또는 환경적 요인이 이러한 효과를 조절하는 능력을 평가할 수 있습니다. 반대로, 파워 타워는 출력으로도 사용될 수 있습니다.

예를 들어, 식이 내 sucrose 함량이 서로 다른 초파리들을 대상으로 피로 도달 시간을 테스트했을 때, sucrose 함량이 증가함에 따라 지구력 또한 증가하는 상관관계가 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 초파리 코호트의 연령을 일치시켜야 하며, 실험 전 과정에 걸쳐 방법론이 일관되게 적용되도록 주의하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청하고 나면, 모든 유전형의 초파리를 대상으로 지구력을 측정하고, 훈련시키고, 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.