Name: 동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 배우세요 전압 클램프된 뉴런에서 도파민 역수송을 측정하는 방법을, 동시 패치 클램프 및 암페로메트리를 사용하여 DAT 매개 도파민 방출을 정량화합니다. 이 기법은 도파민성 신호 전달 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는이 원고의 중요한 검토 박사 Sanika Chirwa 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DA026947, DA021471 및 NS071122)에 의해 지원되었다.

1. 장비 및 용품 <ol><li> 배경 잡음을 줄일 수있는 안티 진동 테이블 (TMI)의 상단에 패러데이 케이지를 탑재합니다. </li><li> 동시 패치 클램프 amperometry 기록 시스템은 우수한 DIC 광학 및 긴 작동 거리 렌즈와 역 현미경이 필요합니다. 자동차 배터리에 등대 현미경을 연결합니다. 시스템이 DC 광원은 또한 전기 노이즈를 감소합니다. </li><li> 유압 마이크로 (Siskiyou) 추가 감소 소음. 우리의 구성에서, 우리는 전체 셀 녹음 오른쪽 손잡이 속이는, 그리고 amperometry에 넘겨 왼쪽을 사용합니다. </li></ol> 2. 녹음을위한 전극을 준비 <ol><li> P-2000 풀러 (셔터)에 석영 피펫을 사용하여 패치 전극을 당겨. 우리 풀다운 두 열 사이클과 함께 약 5 초 정도 소요됩니다. 이 열 시간은 우리의 전체 세포 패치 피펫에 일관성 저항 (MΩ 3-4) 결과입니다. </li><li> 로 전극을 기입2 밀리미터 도파민과 오른쪽 속이는에 마운트를 포함하는 피펫 솔루션입니다. 알루미늄 호일로 DA를 포함하는 피펫 솔루션을 가지고있는 용기를 넣어. 얼음 계속. 도파민은 oxidizable입니다. 빛으로부터 보호 얼음에 솔루션을 유지하는 것은 도파민의 산화 속도를 감소합니다. </li><li> 부드럽게, 저장 상자에서 ProCFE (Dagan) 저소음 탄소 섬유 amperometric 전극을 제거 amperometric 어댑터 (그림 1에 묘사)에 수은, 마운트로 입력하고 다음 오른쪽 maniupulator에 탑재합니다. 탄소 섬유의 맨 끝을 잡고 손상에서 탄소 섬유의 끝을 보호합니다. 끝이 깨끗하고 손상되지 않도록하기 위해 실험실 현미경으로 전극을 검사합니다. </li><li> 외부 솔루션을 포함하는 유리 바닥 배양 접시에 전극을 넣어 amperometric 전극의 무결성을 검사합니다. 도파민의 부재에서 기준 전류를 기록합니다. 요리에 1mM DA 솔루션 10 μl를 추가합니다. 좋은 amperometric 전극 재코드 산화 현재의 증가. 특정 amperometric 전극이 제대로 작동하기 위해 각 실험의 시작과 끝에서이 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 유리 바닥 배양 접시에 도파민 전송을 표현하는 엔지니어링 도파민 뉴런 또는 셀의 기본 Neuronal 문화 준비 <ol><li> 부드럽게 따뜻한 외부 솔루션을 셀이나 도파민 뉴런을 세 번 씻는다. </li><li> 현미경 단계에 유리 바닥 페트리 접시를 탑재합니다. </li></ol> 4. 셀을 시각화 및 실험을 수행 <ol><li> 명확하게 세포를 시각화 할 수있는 올바른 초점을 찾아보세요. 패치 전극에 긍정적 인 압력을 넣습니다. 그런 다음, 부드럽게 솔루션으로 두 전극을 가지고 있으며, 셀을 닫습니다. </li><li> 셀 (왼쪽), 그리고 오른쪽에있는 패치 전극 옆에있는 amperometric 전극을 배치합니다. </li><li> 패치 전극과 같은 감방에 gigaohm 인감을 충족해야합니다. 에 흡입과 파열 인감전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다. </li><li> 셀에 도파민을 포함하는 내부 솔루션의 투석을위한 5-8 분 소요됩니다. </li><li> 원하는 전압 단계 또는 램프 프로토콜을 사용합니다. 막 가능성이 패치 피펫을 통해 제어되는 동안 동시에 패치 피펫 및 전체 셀 전류를 측정하고 도파민 수송을 통해 도파민의 전송을 바꿀 수있는 amperometric 전극 모두에서 데이터를 수집. </li></ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

동시 전압 클램프와 amperometry은 다음과 같은 이점이 있습니다. 모든 세포 유형은 액세스 할 수 있습니다 및 녹음에 사용할 수 있습니다. 녹음이 완료되어있는 셀이나 신경 세포의 식별은 간단하고 간단합니다. 셀이 휘황 관심 단백질에 형광 태그를 추가하여 표시하는 경우 특히, 실험 쉽게 대상 셀이나 신경을 선택할 수 있습니다. 실험 구성은 패치 피펫을 통해, 또는 목욕 솔루션 10이 요원의 추가에 의해 어느 약리 대리인의 균일하고 제어 전송을 할 수 있습니다. 동시 패치 클램프 amperometry 기술은 밀리 초 시간 해상도로 oxidizable 송신기의 릴리스에 다른 채널과 수송의 역할에 대한 조사를 허용하는 동안 막 잠재력은 제어됩니다. 동일한 정보는 생화학 방법 8를 통해 얻을 수 없습니다. 이 approac의 독특한 측면 중 하나H는 패치 피펫 7,11 통해 투석에 의해 세포 내 환경의 조작을 할 수 있다는 것입니다. 그...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 방진 테이블 w / 패러데이 케이지 </td><td> 기술 제조 기업 </td><td> 63-500 시리즈 </td><td> 우리는 모델 63-543를 사용 </td></tr><tr><td> 역 현미경 니콘 TE-2000 </td><td> 니콘 </td><td> 중단 </td><td> 지금 이클립스 티 </td></tr><tr><td> 두 로우 노이즈 앰프 axopatch 200b </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1 CV 203 BU의 headstage </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U 피펫 홀더 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D 변환기 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> 두 manipulators Siskyou, 왼쪽으로오른쪽 넘겨 </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> 레이저 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 낮은 소음 탄소 섬유 amperometric 전극 </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> 낮은 소음 석영 피펫 </td><td> 셔터 악기 </td><td> QF100-70-7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12 볼트 자동차 배터리 </td><td></td><td></td><td> 널리 사용되는 </td></tr><tr><td> 자동차 배터리 충전기 </td><td></td><td></td><td> 널리 사용되는 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> 우선 당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> 황산 마그네슘 (MgSO 4) </td><td> 시그마 </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 (KH 2 PO 4) </td><td> 시그마 </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼륨 (KCl) </td><td> 시그마 </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 이수화 (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> 시그마 </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 hexahydrate (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> 시그마 </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

동시 전압 클램프 및 amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

시냅스 갈라진 틈, 도파민에 출시 된 이후의 사전 및 사후 신경 목표 1을 통해 자사의 생물학적 특성을 발휘. 도파민 신호는 확산 2-3, 세포 효소 4, 막 수송 (5)에 의해 종료됩니다. 도파민 뉴런의 사망시 신경 분열에 위치한 도파민 수송은 안쪽 도파민 유량 (통풍 관)를 통해 출시 아민을 지 웁니다. 도파민 수송은 바깥쪽으로 교통이나 도파민 5 유출이라는 프로세스에서 내부에서 외부로 아민을 공개 역방향으로 작업 할 수 있습니다. . 앞으로 (통풍 관) 및 역방향 (유출) 5 : 20 년 이상 전 Sulzer 외는 도파민 수송이 두 활동의 모드에서 작동 할 수 있습니다 발표했다. 전송을 통해 유출을 통해 발표 신경 전달 물질은 세포 공간으로 도파민 많은 양의 이동 할 수 있으며, 세포 도파민 H의 주요 규제 역할을 보여왔다omeostasis 6. 여기 동시 패치 클램프 및 amperometry 녹음이 막 잠재력이 통제 밀리 초 시간 해상도 유출 메커니즘을 통해 출시 도파민을 측정하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 경우 전체 세포 현재와 산화 (amperometric) 신호는 Axopatch 200B 앰프 (분자 장치, 전체 셀 현재 기록은 1,000 Hz에서 로우 패스 베셀 필터가 설정된)를 사용하여 동시에 측정합니다. 탄소 섬유 전극을 기록 amperometry는 두 번째 앰프 (Axopatch 200B)에 연결되어 있고 플라즈마 막에 인접 배치하고 700 뮤직 비디오에서 개최 때문입니다. 전체 셀과 산화 (amperometric) 전류가 기록 할 수 있으며, 전류 전압 관계는 전압 단계 프로토콜을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 농도로 변환을 필요로하는 일반적인 amperometric 보정 달리, 현재는 효과적인 볼륨 7 고려하지 않고 직접보고됩니다. 따라서, 결과 데이터일부 송신기는 대량 솔루션으로 손실되기 때문에 도파민 유출에 하한을 나타냅니다.

amperometry와 함께 패치 클램프 전압에 따라 달라 DAT로 인한 DA 유출. 그림 2A는 세포 내 환경과 막 잠재력이 전체 셀 패치 피펫으로 고정 아르 DAT로 인한 DA 유출의 대표 실험 구성 및 기록을 보여줍니다 측정 할 수 있습니다. 이 기법 사용, YFP - DAT 단백질을 표현 세포는 전압 고정 amperometric 전극이 플라즈마 막 (그림 2A)에 위치하는 동안 전체 세포 패치 피펫으로. 전체 전지 전극은 2 MM DA를 포함하는 피펫 솔루션으로 가득합니다. 플라즈마 막을 터치 amperometric 전극은 700 뮤직 비디오, DA의 산화 환원 전위보다 더 큰 가능성에서 개최됩니다. DAT로 인한 전류는 (전체 셀 - 그림 2C와 amperometric - 그림 2D) -40 mV의 개최 가능성 (그림 2B에서 -60 및 100 뮤직 비디오 사이의 막 ...

amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의​​ 규제 역할의 전체 &#39;활동&#39;사이의 기계론의 관계를 알 수있다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

시냅스 틈으로 방출된 후, 도파민은 시냅스 전 및 후 표적을 통해 생물학적 특성을 나타냅니다1. 도파민 신호는...

이 절차의 목적은 동시 패치 클램프 및 파이로메트리(pyrometry)를 사용하여 DAT 매개 도파민 방출을 측정함으로써, 전압 클램프가 적용된 뉴런 내 도파민의 역수송을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 도파민으로 파이로메트릭 전극의 무결성을 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 파이로메트릭 전극을 세포 근처에 배치하고 패치 피펫으로 뉴런의 홀셀 패치(whole cell patch)를 형성하는 것입니다.다음으로, 패치 피펫으로 세포의 전압을 조절함과 동시에 파이로메트릭 전극을 사용하여 세포에서 방출되는 DAT 매개 도파민을 기록합니다. 마지막 단계는 DAT 차단제를 첨가하고 전세포 및 파이로메트리 전류를 다시 기록하여, 도파민 운반체에 의해 특이적으로 매개되는 전류를 뺄 수 있게 하는 것입니다. 이 기술의 의의는 도파민성 뉴런의 전압을 동시에 조절하면서 도파민 운반체를 통한 도파민의 역수송을 측정할 수 있다는 점에 있습니다.동시 패치 클램프 및 기압 측정 기록 시스템에는 시스템을 위한 DC 광원을 생성하기 위해 우수한 DIC 광학계와 긴 작동 거리 렌즈를 갖춘 도립 현미경이 필요합니다. 전기적 노이즈를 낮추기 위해 현미경 조명을 자동차 배터리에 연결하십시오. 본 구성에서는 유압 마이크로 조작기가 노이즈 수준에 거의 영향을 주지 않기 때문에 이를 사용합니다.전압 클램프, 전체 세포 기록(whole cell recording)을 위해서는 우측 조작기를 사용하고, 파이로메트리(pyrometry)를 위해서는 좌측 조작기를 사용합니다. 전체 세포 기록용 전극을 준비하려면, P 2000 풀러(puller)를 사용하여 쿼츠 파이펫을 뽑아냅니다. 일반적으로 3~4 MΩ의 저항을 가진 파이펫을 사용합니다.다음으로, 1 mM 도파민이 포함된 피펫 용액으로 전극을 채웁니다. 그런 다음 이를 우측 매니퓰레이터의 피펫 홀더에 장착합니다. 도파민 함유 피펫 용액이 담긴 용기는 반드시 알루미늄 호일로 감싸고, 사용하지 않을 때는 얼음 위에 보관하십시오.도파민은 산화될 수 있으므로, 용액을 얼음 위에 두고 빛으로부터 차단하여 보관하면 산화 속도를 낮출 수 있습니다. 은선을 전극 홀더에 끼운 다음, 전극 홀더에 파라메트릭 어댑터를 장착하십시오. 그다음, 은선과 접촉할 수 있을 만큼 충분한 양의 수은을 삼전극 전극에 채우십시오.전극을 어댑터에 장착할 때, 현미경으로 pro CFE 저노이즈 탄소 섬유 및 파라메트릭 전극을 검사하여 팁이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 탄소 섬유의 팁이 손상되는 것을 방지하기 위해 탄소 섬유의 끝부분을 잡으십시오. 그런 다음 pro CFE Tric 전극을 장착하십시오.이어서 조립된 전극을 왼쪽 유압 조작기에 장착하여 tric 전극의 무결성을 검사합니다. 이를 외부 용액이 담긴 유리 바닥 페트리 접시 속에 내립니다. 도파민이 없는 상태에서 기선 전류를 기록합니다.그런 다음 10 µL의 1 mM 도파민 용액을 디시에 추가합니다. 성능이 좋은 암페로메트릭 전극(amperometric electrode)이라면 산화 전류의 증가가 기록될 것입니다. 실험 전후에 암페로메트릭 전극의 무결성을 반드시 확인하십시오.본 절차에서는, 유리 바닥 페트리 접시에 담겨 배양기에서 도파민 운반체를 발현하도록 제작된 도파민 뉴런 또는 세포를 꺼냅니다. 따뜻한 외부 용액으로 세포 또는 도파민 뉴런을 세 번 부드럽게 세척합니다. 세포를 시각화하고 실험을 수행하기 위해, 유리 바닥 페트리 접시를 현미경 스테이지 위에 설치하고 세포가 명확하게 보이도록 정확한 초점을 맞춥니다.다음으로, 패치 전극에 양압을 가합니다. 1mL 시린지를 사용하여 마이크로 조작기로 두 전극을 모두 용액 안으로 천천히 내리고 셀에 더 가깝게 이동시킵니다. 그런 다음 전위 측정 전극을 셀의 왼쪽에, 패치 전극을 오른쪽에 배치합니다.패치 전극이 세포에 닿았을 때, 입이나 시린지를 이용해 가볍게 흡입하여 세포에 기가 씰(giga seal)을 형성합니다. 그 후, 흡입을 통해 씰을 파괴하여 whole cell 구성을 구현하고, 도파민이 포함된 내부 용액이 세포 내로 투석될 수 있도록 5분에서 8분 동안 기다립니다.그 후 피펫을 통해 유지 전위 -40 mV에서 세포막 전압을 -60 mV에서 +100 mV 사이로 단계적으로 변화시켜 DAT 매개 전류를 기록합니다. 특이적 DAT 매개 도파민 유출을 결정하기 위해, DAT 길항제 부재 시와 존재 시의 실험적 전류를 기록합니다. 특이적 DAT 매개 전류는 길항제 없이 기록된 실험적 트레이스에서 DAT 길항제 존재 시 기록된 트레이스를 뺌으로써 결정합니다.tric 전류의 상향 편향은 여기서 보여주는 도파민의 외부 유출에 해당합니다. 전체 세포 패칭 모드에서 2mM 도파민이 포함된 피펫을 사용하여, -60mV에서 +100mV 사이로 막 전압을 20mV씩 단계적으로 변화시켜 기록한 -4C mV 유지 전위에서의 DAT 매개 전류입니다. 여기는 전체 세포 전류와 동시에 획득한 앰페로메트릭 전류입니다.이 영상을 시청한 후, 전압 고정된 뉴런에서 도파민 운반체를 통한 도파민의 역수송을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 실험 전후에 파라메트릭 전극의 무결성을 확인하는 것을 잊지 마십시오. 또한, 길항제가 없는 상태에서 기록한 트레이스에서 길항제가 있는 상태에서 기록한 트레이스를 차감하는 것을 잊지 마십시오.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 쥐의 뇌 조각의 전체 세포 구성에 기록된 dopaminergic 신경 세포로 전도성을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 기법은 동적 클램프라고합니다.

동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

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이 비디오는 마취된 쥐에 전극과 캐뉼라를 이식하여 전위차점 측좌핵의 도파민 방출을 측정하고 복부 피개 영역의 도파민 활성을 조절하기 위한 약물 주입을 보여줍니다.

VTA 도파민 뉴런 수용체 조작을 사용한 쥐 모델에서 도파민 방출 모니터링

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

빠른 스캔 순환 voltammetry 약물, 질병 및 기타 실험 조작의 맥락 에서 생체 내 도파민 신경 전달을 모니터링 할 수 있습니다. 이 연구는 도파민 방출 및 재 흡수 역학의 평가를 정량화하기위한 양적 신경 생물학 모델에 따라 전기 자극 된 도파민 반응을 모델링하는 소프트웨어 인 QNsim1.0의 구현을 설명합니다.

QNsim1.0을 이용한 전기 자극 도파민 신경 전달 데이터의 고속 스캔 순환 전압 측정 데이터 모델링

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

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인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

배우세요 전압 클램프된 뉴런에서 도파민 역수송을 측정하는 방법을, 동시 패치 클램프 및 암페로메트리를 사용하여 DAT 매개 도파민 방출을 정량화합니다. 이 기법은 도파민성 신호 전달 연구에 필수적인 도구입니다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

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