동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

이 절차의 목적은 DAT 매개 D 방출을 측정하기 위해 동시 패치 클램프와 고온계를 사용하여 전압 클램핑된 뉴런에서 도파민의 역 수송을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 도파민으로 내화 전극의 무결성을 테스트하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 발화량 전극을 세포 근처에 놓고 패치 피펫으로 뉴런의 전체 세포 패치를 얻는 것입니다.

다음으로, 패치 피펫으로 셀의 전압을 제어하고 셀에서 방출되는 DAT 매개 도파민을 내열광 전극으로 동시에 기록합니다. 마지막 단계는 DAT 차단제를 추가하고 전체 세포와 고온계 전류를 다시 기록하여 도파민 수송체에 의해 특별히 매개되는 전류를 빼낼 수 있도록 하는 것입니다. 이 기술의 중요성은 도파민 수송체를 통한 도파민의 역수송을 측정하는 동시에 도파민 뉴런의 전압을 제어할 수 있다는 것입니다.

동시 패치 클램프 및 기압 기록 시스템에는 시스템을 위한 DC 광원을 생성하기 위해 우수한 DIC 광학 장치와 긴 작동 거리 렌즈를 갖춘 도립 현미경이 필요합니다. 전기 노이즈가 적어 현미경 등대를 자동차 배터리에 연결하십시오. 유압식 마이크로 매니퓰레이터는 구성의 소음 수준에 눈에 띄게 기여하지 않기 때문에 사용됩니다.

오른손잡이 매니퓰레이터는 전압 클램프, 전체 세포 기록에 사용되며 왼손잡이 매니퓰레이터는 고온계에 사용됩니다. 도매 기록을 위해 전극을 준비하려면 P 2000 풀러로 석영 피펫을 당깁니다. 일반적으로 우리는 저항이 3-4 메가 옴인 피펫을 사용합니다.

다음으로, 1밀리몰 도파민이 함유된 피펫 용액으로 전극을 채웁니다. 그런 다음 오른쪽 매니퓰레이터의 피펫 홀더에 장착합니다. 도파민이 들어있는 피펫 용액이 들어있는 용기는 알루미늄 호일로 싸서 얼음 위에 보관하십시오.

도파민은 산화될 수 있기 때문에 용액을 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하면 산화 속도가 감소합니다. 은선을 전극 홀더에 끼운 다음 am 파라메트릭 어댑터를 전극 홀더에 끼웁니다. 다음으로, tric 전극에 은선과 접촉하기에 충분한 수은을 채웁니다.

전극을 어댑터에 장착할 때 현미경으로 pro CFE 저노이즈 탄소 섬유 및 파라메트릭 전극을 검사하여 팁이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 탄소 섬유의 끝이 손상되지 않도록 보호하기 위해 탄소 섬유의 맨 끝을 잡으십시오. 그런 다음 pro CFE Tric 전극을 장착합니다.

그런 다음 조립된 전극을 왼쪽 유압 매니퓰레이터에 장착하여 tric 전극의 무결성을 검사합니다. 외부 용액이 들어 있는 유리 바닥 페트리 접시에 내립니다. 도파민이 없는 상태에서 기준선 전류를 기록합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 1밀리몰 도파민 용액을 접시에 추가합니다. 좋은 emper 미터 전극은 산화 전류의 증가를 기록해야 합니다. 실험 전후에 emper metric 전극의 무결성을 확인하십시오.

이 절차에서는 인큐베이터에서 유리 바닥 페트리 접시에 놓인 도파민 수송체를 발현하도록 조작된 도파민 뉴런 또는 세포를 회수합니다. 따뜻한 외부 용액으로 세포나 도파민 뉴런을 세 번 부드럽게 씻어냅니다. 세포를 시각화하고 실험을 수행하려면 유리 바닥의 페트리 접시를 현미경 스테이지에 장착하고 세포를 명확하게 시각화할 수 있는 올바른 초점을 찾습니다.

다음으로, 패치 전극에 양압을 가합니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 두 전극을 용액 안으로 부드럽게 내리고 마이크로 매니퓰레이터로 셀을 더 가깝게 만듭니다. 그런 다음 emper 미터법 전극을 셀의 왼쪽에 배치하고 패치 전극을 오른쪽에 배치합니다.

패치 전극이 세포에 닿을 때. 입이나 주사기로 가볍게 흡입하여 세포에 기가 씰을 형성합니다. 그 후, 흡입으로 씰을 파열하여 전체 세포 구성을 달성하고 내부 용액을 함유한 도파민을 세포로 투석할 수 있도록 5-8분 동안 기다립니다.

그런 다음 피펫을 통해 마이너스 40m볼트의 유지 전위에서 마이너스 60과 플러스 100밀리볼트 사이의 세포막 전압을 스테핑하여 DAT 매개 전류를 기록합니다. 특정 DAT 매개 도파민 flx를 결정하기 위해 DAT 길항제의 부재 및 존재 시 emper metric 전류를 기록합니다. 그런 다음 특정 DAT 매개 tric 전류는 길항제 없이 기록된 emper traces에서 DAT 길항제의 존재 하에 기록된 traces를 빼서 결정됩니다.

tric currents의 상향 편향은 여기에 표시된 도파민의 바깥쪽 플럭스에 해당합니다. DAT 매개 전류는 전체 세포 패치 모드에서 2 밀리몰 도파민을 포함하는 피펫을 사용하여 마이너스 4 C 밀리 볼트의 유지 전위에서 마이너스 60과 플러스 100 밀리 볼트 사이에서 멤브레인 전압을 20 밀리 볼트로 스테핑하여 기록되었습니다. 다음은 전체 셀 전류와 동시에 획득 된 Emper 메트릭 전류입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 전압 클램핑 뉴런에서 도파민 수송체를 통해 도파민의 역수송을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 실험 전후에 파라메트릭 전극의 무결성을 확인하는 것을 잊지 말고, 길항제 없이 기록된 tric traces에서 해당 길항제의 존재 하에 기록된 traces를 빼는 것을 잊지 마십시오.