중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

본 절차에서는 stopped flow 장비를 사용하여 SID A의 서로 다른 스펙트럼 형태를 검출하고 반응 속도를 측정합니다. SID A에 의해 촉매되는 반응은 FAD의 환원 반쪽 반응과 산화 반쪽 반응으로 나눌 수 있습니다. 산화된 플라빈은 N-A-D-P-H와 결합하여 반응함으로써 환원된 플라빈과 NADP를 형성하며, 분자 산소와의 반응 및 오르니틴의 결합을 통해 C four가 형성됩니다.

오르니틴의 수산화 이후 생성된 하이드록시 플라빈은 탈수되어 산화된 효소를 형성합니다. NADP⁺는 촉매 주기 내내 결합되어 있으며 마지막으로 방출되는 기질입니다. 정지 흐름 장치는 적은 부피의 반응물을 빠르게 혼합하고 기록하는 것을 가능하게 합니다.

분광 광도계를 이용한 시간에 따른 스펙트럼 변화 측정은 효소 촉매 반응, 특히 일시적 중간체의 생성 및 소멸 속도를 측정할 수 있게 해줍니다. 본 연구실의 구성원인 Rita Robinson과 Enviro Romero가 flavor mono oxygenase를 모델 시스템으로 하여 세트 A를 이용한 이 실험들을 시연하겠습니다. 마그네틱 바가 들어 있는 500 milliliter 뷰히너 플라스크에 100 millimolar 인산칼륨 완충액 250 milliliters를 붓습니다.

플라스크를 고무 마개로 밀봉한 후, 교반기 위에 놓고 플라스크의 짧은 튜브를 sch flank 라인에 연결합니다. 실온에서 교반하며 진공 상태로 한 시간 동안 버퍼의 가스를 제거한 다음, argon으로 퍼징합니다. 이 과정을 5회 반복합니다.

마지막으로 플라스크를 Argonne으로 10초 동안 퍼지합니다. 진공 매니폴드에서 플라스크를 분리하여 글로브 박스 내부에 넣습니다. 플라스크를 연 상태로 계속해서 격렬하게 교반합니다.

저장조 시린지를 18.13 units per milliliter glucose oxidase와 100 millimolar glucose 용액으로 채웁니다. 이제 구동 밸브를 로드 위치로 설정하십시오. 구동 시린지를 채웁니다.

다음으로, F 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다. pro data 제어 소프트웨어를 사용하여 'empty the stop syringe'를 클릭한 다음, 해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 버퍼를 유로 회로로 밀어냅니다. 나머지 세 개의 드라이브 시린지에도 동일하게 수행한 후 1시간 동안 평형화합니다.

이제 리저버 시린지를 다시 채우고 정지된 유동 시스템의 플러싱을 반복합니다. 산소 포화 버퍼를 준비하려면, 용액에 100% oxygen을 1시간 동안 교반하며 버블링합니다.

그 다음 바이알에서 짧은 바늘을 제거하고 10초 동안 기다립니다. 이어서 긴 바늘을 제거하고 닫힌 바이알을 글로브 박스에 넣습니다. N-A-D-P-H 용액의 경우입니다.

1 mg의 NADPH가 들어 있는 1.5 mL 에пor 튜브를 글로브 박스에 넣습니다. 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 300 µL에 용해시킵니다.

NADP H 농도를 결정하기 위해 30 µL를 취합니다. 이제 효소 스톡에서 산소를 제거하기 위해, 솔루션을 마그네틱 바, 스토퍼 및 알루미늄 씰이 포함된 25 mL 바이알로 옮깁니다. 이를 얼음에 놓아 보관합니다.

슐링크 라인(schlink line)에 연결한 후 20분 동안 진공 탈기하고, 이어서 argon으로 퍼지합니다. 마지막으로 바이알을 10초 동안 argon으로 퍼지한 후 진공 매니폴드에서 분리합니다. 바이알을 글로브 박스 내의 얼음 위에 둡니다.

pro data 제어 소프트웨어의 제어 패널 창에서 photo diode array, external trigger 및 logarithmic scale을 선택하십시오. 또한 pro data viewer 소프트웨어를 실행하고 데이터 파일 저장 디렉토리를 지정하십시오.

이제 저장조 시린지 C와 F의 용액을 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액(pH 7.5)으로 교체하십시오. C와 F 밸브를 구동 위치로 돌립니다. pro data 제어 소프트웨어에서 정지 시린지 비우기(empty the stop syringe)를 클릭하십시오.

그런 다음, 해당 구동 램(drive ram)을 수동으로 올려 양쪽 구동 시린지에서 버퍼를 유동 회로로 밀어냅니다. 저장 시린지 C와 F를 사용하여 세척 과정을 세 번 더 반복합니다. 유동 회로에서 glucose oxidase가 완전히 제거되었는지 확인하려면, pro data 제어 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.

리저버 시린지 F의 용액을 효소 용액으로 교체하십시오. F 밸브를 구동 위치로 돌리십시오. pro data 제어 소프트웨어에서 stop 시린지 비우기(empty the stop syringe)를 클릭하십시오.

해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 효소 용액을 유체 회로로 밀어 넣습니다. Pro data 제어 소프트웨어로 돌아가 수집 시간을 60초로 설정합니다. 두 드라이브 시린지에 각각의 용액이 채워져 있는지, 그리고 드라이브 램이 드라이브 시린지 피스톤과 접촉하고 있는지 확인하십시오.

두 밸브를 모두 drive 위치로 돌리고, pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하여 drive를 수행합니다. drive를 통해 얻은 452 nanometer에서의 A 값을 사용하여 효소 산화형의 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정합니다. 혼합 전의 효소 농도를 결정하고 4 milliliters의 N-A-D-P-H 용액을 준비합니다.

N-A-D-P-H 용액을 사용하여 충전 저장조 시린지 C를 1.5배 더 농축하여 채우고, 앞서 설명한 대로 스톱 시린지를 세 번 비우고 다시 채웁니다. 이제 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액 pH 7.5를 사용하여 유로 회로에서 효소 플러시 내용물을 씻어내는 동안 스펙트럼을 얻습니다. 이제 pro data 제어 소프트웨어에서 베이스라인을 클릭하십시오.

그 다음, 효소 스톡 용액 200 µL를 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 1000 µL와 혼합합니다. 리저버 시린지 A의 용액을 이 효소 용액으로 교체합니다.

pro data 제어 소프트웨어에서 A 밸브를 드라이브 위치로 전환하십시오. stop syringe empty를 클릭하십시오. 해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 A의 효소 용액을 유로 회로로 밀어내십시오.

지연 시간을 0.5초로, 획득 시간을 60초로 설정하십시오. 모든 구동 시린지에 해당 용액이 채워져 있는지, 그리고 구동 램이 구동 시린지 피스톤과 접촉해 있는지 확인하십시오. 그 다음 모든 구동 밸브를 구동 위치로 돌리고 pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하십시오.

산화된 형태의 효소에 대한 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정하여 얻습니다. 다음으로, 리저버 시린지 B의 용액을 시린지 A에 들어있는 효소 용액보다 1.5배 더 농축된 N-A-D-P-H 용액으로 교체합니다. B 밸브를 구동 위치로 돌리고, 제어 패널 창에 표시된 대로 스톱 시린지를 세 번 비우고 다시 채웁니다.

지연 시간을 0.5초로 설정하십시오. 20초에 획득을 수행하며, 리저버 시린지 sea의 용액을 산소화된 버퍼로 교체하십시오. C 밸브를 구동 위치로 돌리십시오.

pro data 제어 소프트웨어에서 세 번 세척(flush)하십시오. 지연 시간은 15초로, 획득 시간은 900초로 설정하십시오. stopped flow 장치 내에서 완전히 환원된 효소가 재산화되는 동안 계속해서 스펙트럼을 획득하십시오.

N-A-D-P-H를 이용한 SID A의 혐기적 환원은 452 nm에서의 흡광도를 통해 플라빈의 산화환원 상태 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있습니다. 산화된 SID A부터 완전히 환원된 SID A의 마지막 스펙트럼까지 시간에 따른 스펙트럼 변화를 기록합니다. 이 효소 단계의 속도는 데이터를 적절한 방정식에 피팅하여 결정할 수 있습니다. 또한, AF Sid A에 의한 이 반응에서 stopped flow의 이중 혼합 모드를 사용하여 산화 속도와 반응 중간체를 결정할 수 있습니다. C4a-히드록시플라빈 중간체는 380 nm의 λmax에서 명확하게 검출되며, 산화된 효소는 450 nm의 λmax를 갖습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4~6시간 내에 완료할 수 있습니다. 용액이 혐기성 상태를 유지하도록 주의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 rapid chemical과 같은 후속 실험에 앞서 FLA 독립 단량체의 상대적 및 궤양성 이온을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

Quentin은 중간체의 슬픈 성질을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.