Name: 중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 학습하세요 중단-흐름 분광 광도법을 사용하여 Aspergillus fumigatus SidA 플라빈 종속 모노옥시게나아제의 환원 및 산화 반반응을 분석하는 방법을. 효소 반응 중간체의 형성 속도 상수를 측정하여 항진균 치료 개발에 필요한 촉매 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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연구는 NSF 상을 MCB-1021384에 의해 지원.

1. 무산소 버퍼의 작성 <ol><li> 100 밀리미터 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5의 1 L를 준비합니다. 유나 바있는 500 ML Büchner 플라스크에 버퍼 250 ML 하거라. </li><li> 고무 마개로 플라스크를 밀봉하고 저어 접시에 배치하십시오. Schlenk 라인으로 플라스크의 짧은 튜브를 연결합니다. </li><li> 교반과 상온에서 5 시간 동안 진공 하에서 가스를 제거하다는 버퍼. 이 기간 동안 매시간마다 degassing과 아르곤과 세정 진공의 5 연속 라운드를 수행합니다. </li><li> 10 초 동안 아르곤과 플라스크를 플러시하고 진공 매니폴드에서 연결을 끊습니다. 글러브 박스 안쪽 플라스크를 놓습니다. </li><li> 활발한 교반과 함께 하룻밤 사이에 글러브 박스에서 술병을 열어 둡니다. </li></ol> 2. 중단 - 흐름 시스템에서 산소를 제거 <ol><li> 0.1 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.0의 1 L를 준비합니다. 250 ML Büchner 플라스크에이 버퍼 125 ML을 붓고 단계 1.2-1.4를 수행합니다. </li><li> 5 달아서 나누다Aspergillus 니제르 (181,300 U / g)과 0.9 g 포도당 1.5 ML Eppendorf 튜브 50 ML 팔콘 원뿔 튜브를 사용하여 각각의 MG 포도당 산화 효소. 글러브 박스에 모두 컨테이너를 배치합니다. </li><li> 무산소 0.1 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.0 (최종 18.13 U / ML의 농도에서 100 밀리미터, 각각) 50 ML에서 포도당 산화 효소와 포도당을 분해. 이 솔루션 (그림 1)과 저수지에 주사기를 채우십시오. </li><li> 드라이브 밸브가 &quot;로드&quot;위치에 있는지 확인하고 드라이브 주사기 (그림 1)을 입력합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 버퍼를 누르십시오. 이 단계에게 총 10 번 반복합니다. 다른 세 드라이브 주사기와 동일한 절차를 수행합니다. 한 시간 만요. </li><li> 동일한 버퍼 contai와 저수지의 주사기 솔루션을 교체포도당 산화 효소와 포도당을 닝. 단계 2.4 반복합니다. </li><li> 반복은 2.5 단계와 솔루션은 하룻밤 흐름 시스템에 서 수 있습니다. </li><li> 하룻밤 배양 후, 반복, 2.5 단계. </li></ol> 3. 산소 포화 버퍼의 작성 <ol><li> 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)을 준비하고 저어 막대와 50 ML 유리병에 50 ML을 붓는다. Wheaton의 스토퍼와 Wheaton의 알루미늄 도장 병을를 쏠. </li><li> 빙판에 병을 놓습니다. 솔루션으로 100 % 산소를 포함하는 탱크에 연결된 긴 바늘을 담가. 통풍구와 같은 유리병의 마개를 통해 또 다른 짧은 바늘을 삽입합니다. </li><li> 교반 : 1 시간 동안 100 % 산소로 거품이 솔루션입니다. </li><li> 먼저 유리병에서 짧은 바늘을 제거하고 긴 바늘을 제거하기 전에 10 초 기다립니다. 글러브 박스에서 닫힌 유리병를 놓습니다. </li></ol> 4. NADPH 솔루션의 작성 <ol><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 NADPH의 1 밀리그램을 무게와 내가 배치글러브 박스에 티. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5 300 μL의 NADPH를 해산. 분광 광도계 (ε 340 nm의 = 6270 M -1 cm -1)와 NADPH 농도를 결정하기 위해 장갑 상자에서이 솔루션의 30 μL를 제거합니다. </li></ol> 5. 효소 솔루션에서 산소의 제거 <ol><li> 글러브 박스에서 냉동고와 해동에서 효소 주식 용액 400 μL를 가져가라. 효소 주식 솔루션은 (360 μm의) 이전에 100 밀리미터 NaCl을 포함하는 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)에 준비하고, 액체 질소에 냉동되었다. </li><li> 유나 바와 25-ML 유리병에 효소 솔루션을 전송, Wheaton의 스토퍼와 Wheaton의 알루미늄 도장 병을 모자하고 장갑 상자에서 제거합니다. </li><li> 빙판에 유리병을 넣고 유리병의 마개를 통해 바늘을 삽입하여 Schlenk 라인에 연결합니다. </li><li> 가스를 제거하다 5 연속 순찰을 수행하여 효소 용액1 시간 20 분마다 degassing과 아르곤과 세정 진공 청소기. </li><li> 10 초 동안 아르곤과 유리병을 소독하고 진공 매니폴드에서 연결을 끊습니다. 글러브 박스 안의 얼음 병을 놓습니다. </li></ol> 6. Reductive 하프 반응 : 모니터링 플라빈 감소 <ol><li> 정지 - 흐름 악기와 제조 업체의 프로토콜에 따라 단일 혼합 모드의 프로 데이터 컨트롤 소프트웨어를 준비합니다. </li><li> 순환 물 목욕 (15 ° C)를 켭니다. 20 분 동안 그것을 통해 질소를 꿈틀하여 물에서 산소를 제거합니다. 이것은 흐름 회로를 통해 산소 오염을 방지합니다. </li><li> 순환 목욕 정지 흐름의 물 목욕 주택을 연결하여 드라이브 주사기의 온도와 15의 관측 셀 ° C를 유지합니다. </li><li> 프로 데이터 컨트롤 소프트웨어 선택 Photodiode 배열, 외부 트리거 (중지 흐름 작업을 활성화하기 위해), 그리고 Logarit의 제어판 창에서hmic 스케일. </li><li> 프로 데이터 뷰어 소프트웨어를 실행하고 데이터 파일이 저장됩니다 디렉토리를 정의합니다. </li><li> 저수지 주사기 C와 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)와 F의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 C와 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동 (숫양의 각 운동하기 전에 비어 클릭) 총 숫양 다섯 번이나 해당 드라이브를 높여 흐름 회로를 통해 두 드라이브 주사기에서 버퍼를 누르십시오. </li><li> 그 포도당 산화 효소가 흐름 회로에서 완전히 제거되었는지 확인하기 위해서, 총 6.6 네 번 단계를 수행합니다. </li><li> 프로 데이터 제어 소프트웨어에 기준을 클릭합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (15 μm의의 정지 흐름에서 믹싱 후 최종 농도)의 1100 μL와 효소 주식 용액 100 μL를 섞습니다. </li><li> 저수지 SYR의 솔루션을 교체효소 솔루션 인게 F 조. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 효소 솔루션을 누르십시오. 총에서이 세 번 수행합니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 60 s의 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 두 드라이브 주사기가 드라이브 주사기 피스톤과 접촉에 해당 솔루션 및 드라이브 마리 가득 있는지 확인하십시오. &quot;드라이브&quot;위치로 두 밸브를 켜고 드라이브를 수행하기 위해 프로 - 데이터 관리 소프트웨어에서 가져오기를 클릭합니다. 세중의에있는 데이터를 얻기 위해 두 번 이상이 단계를 반복합니다. 효소의 산화 형태의 이러한 수율의 스펙트럼. </li><li> 드라이브에서 얻은 452 nm의 값을 사용하여 (ε 452 nm의 = 13,700 M -1 cm -1)을 혼합하기 전에 효소 농도를 결정하고 NADPH solutio 4 ML 준비N 1.5 배 더 집중. </li><li> NADPH 용액과 6.10에 설명된대로 빈과 리필 중지 주사기 세 번 함께 저수지 주사기 C의 솔루션을 교체합니다. </li><li> 6.11 단계를 반복합니다. 효소의 감소하는 동안 이러한 수율의 스펙트럼. </li></ol> 7. 산화 반 반응 : 모니터링 플라빈 산화 <ol><li> 정지 - 흐름 악기와 제조 업체의 프로토콜에 따라 이중 혼합 모드의 프로 - 데이터 관리 소프트웨어를 준비합니다. </li><li> 단계 6.2-6.5를 반복합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (산도 7.5)와 네 개의 저수지의 주사기에서 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 F 밸브를 켭니다. 프로 - 데이터 관리 소프트웨어에 빈을 클릭하여 중지 주사기 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 늘리면 흐름 회로를 통해 드라이브 주사기 F에서 버퍼를 누르십시오. 각 드라이브 주사기로 총이 단계는 다섯번을 수행합니다. </li><li> 한잔에 7.3 네 번 단계를 수행알 완전히 흐름 회로에서 내용을 제거합니다. </li><li> 프로 데이터 관리 소프트웨어에 기준을 클릭합니다. </li><li> 무산소 100 밀리미터 칼륨 인산 완충액 (15 μm의의 정지 흐름에서 믹싱 후 최종 농도) 1000 μL와 효소 주식 용액 200 μL를 섞습니다. </li><li> 효소 솔루션 저수지의 주사기의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치로 밸브를 돌립니다. 프로 데이터 관리 소프트웨어에서 비우기를 클릭하여 중지 주사기를 비웁니다. 수동으로 해당 드라이브 램을 높이는하여 드라이브 주사기의 흐름이 회로를 통해 효소 솔루션을 누르십시오. 이 단계에게 총 세 번 수행합니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 0.5 s의 지연 시간을 60 s의 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 모든 드라이브 주사기가 드라이브 주사기 피스톤과 접촉에 해당 솔루션 및 드라이브 마리 채워져 있는지 확인하십시오. &quot;드라이브&quot;위치로 모든 밸브를 켜고 프로 DAT에서 수집을 클릭드라이브를 수행하는 제어 소프트웨어. 세중의에있는 데이터를 얻기 위해이 단계를 두 번 더 반복합니다. 효소의 산화 형태의 이러한 수율의 스펙트럼. </li><li> 주사기 A에서 효소 용액 &quot;드라이브&quot;위치와 빈과 리필 중지 주사기에게 같은 7.7에 설명된 세 차례에 B 밸브를 돌려보다 1.5 배 더 집중 NADPH 솔루션 저수지 주사기 B의 솔루션을 교체합니다. </li><li> 산소 버퍼와 저수지 주사기 C의 솔루션을 교체합니다. &quot;드라이브&quot;위치와 빈과 리필 중지 주사기에게 7.7에 설명된대로 세 차례에 C 밸브를 켭니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서는 각각 15, 900의에서 지연 및 수집 시간을 설정합니다. </li><li> 7.8 단계를 반복합니다. 완전히 감소 효소의 재산화 동안 이러한 수율의 스펙트럼. </li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 프로 데이터 컨버터 소프트웨어를 실행합니다. 옵션 아이콘을 클릭하고 ProDataCSV에 저장을 선택합니다. </li><li> 열기데이터 파일이 저장된 디렉토리. APL 프로 데이터 컨버터 창으로 파일을 끕니다. 데이터는 같은 디렉토리에 CSV 형식의 파일로 자동 저장됩니다. </li><li> 마이크로 소프트 엑셀 (마이크로 소프트, 레드 몬드, 워싱턴, 미국)를 사용하여 CSV 형식으로 파일을 엽니다. 700 nm의에 해당하는 흡수를 빼는 방법으로 정지 - 흐름 추적의 기준을 정상화. </li><li> 적절한 지수 함수에 시간 대 상응 최대의 흡광도의 음모를 맞추하여 KaleidaGraph을 (시너지 소프트웨어, 독해, PA)를 사용하여 수정된 흔적을 분석합니다. 그림 2B, 중지 흐름 악기의 효소와 NADPH를 혼합 후 플라빈 감소의 속도를 결정하기 위해서는 시간의 함수로 꾸몄다되었다 452 nm의 흡광도에서 표시. 이 경우, 데이터의 가장 적합한는 감소, 고해상도의 첫 번째와 두 번째 단계에 대해 계산되었다 이중 지수 방정식과 0.65와 0.23의 -1의 속도를 이용하여 얻은 것입니다pectively. C4a-hydroperoxyflavin 중급와 산소로 감소 효소 반응 후 재산화 형성의 속도를 확인하려면, 우리는 각각 380과 452 nm의, (그림 3B)에서 정지 - 흐름 추적을 분석했다. 단일 지수 방정식을 사용하여, 우리는 각각 하프 반응 산화의 첫 번째와 두 번째 단계 1.4 및 0.006의 -1의 속도를 계산. </li></ol> 9. 대표 결과 이전 섹션에서 설명한 실험의 결과는 F SidA의 reductive 하프 반응은 플라빈의 산화 환원 상태의 변화에 대응하는 452 nm의 흡광도에서의 변화를 측정하여 모니터링할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 단계의 속도는 적절한 방정식 (; 단계 8.4 그림 2)에 데이터를 맞추 의해 결정됩니다. 얻은 감소 속도 (0.65들 -1)로 계산 K 고양이 값과 비슷감소 반응의 속도 결정 단계 -임을 암시 정상 상태 실험 2. 정지 - 흐름의 이중 혼합 모드를 활용, 산화이 반 반응의 중간체의 속도는 (; 단계 8.4 그림 3) 결정하실 수 있습니다. F SidA하여 촉매 반응에서 C4a-hydroperoxyflavin 분명 (380 nm의 λ의 최대) 감지되고, 형성과 부식의 비율을 계산할 수 있습니다. 취득 재산화 (0.006들 -1)의 느린 속도는 C4a-hydroperoxyflavin가 부재에서 ornithine 매우 안정을 나타냅니다. <img alt="계획 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> F SidA의 제도 1. 원리. 유행의 cofactor의 isoallozaxine 고리가 표시됩니다. 산화 플라빈 ()는 NADPH (B)에 바인딩하고 감소 플라빈와 NADP +를 (C) 형성 반응. 의 분자 산소와 결합과 반응 후ornithine, C4a-hydroperoxyflavin는 (D) 형성됩니다. 이것은 hydroxylating 수종입니다. ornithine의 hydroxylation 후 hydroxyflavin (E)는 산화 효소를 형성하여 수분이 있어야합니다. NADP +는 촉매주기 전반에 걸쳐 구속 남아 (F) 출시되는 마지막 제품입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> 그림 1. 정지 - 흐름 악기. ) 응용 Photophysics SX20의 구성 요소의 그림은 정지 - 흐름 분광 광도계를. B 샘플 처리 단위의) 그림. 이중 혼합 모드에서 흐름 회로의 C) 제도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> 그림 2. 정지 - 흐름 악기의 NADPH와 SidA의 무산소 감소. 30 μm의 SidA 45 μm의 제품 NADPH의 동등 권을 혼합 후 녹음) 스펙트럼 변경됩니다. 첫번째 스펙트럼 (SidA을 산화)와 마지막으로 스펙트럼은 (완전 시드에게 줄어) 청색과 적색, 각각으로 강조하고 있습니다. 시간의 함수로 기록 452 nm의시 B) 흡광도 추적. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> 정지 - 흐름 악기의 SidA의 그림 3. 산화. ) 완전히 감소 SidA와 산소 버퍼의 혼합 동등 권 이후 스펙트럼 변화를 기록했습니다. 최종 농도가 15 μm의 SidA, 22.5 μm의의 NADPH, 그리고 0.95 MM 산소 있었다. 스펙트럼은 0.034, 4.268로 기록하고, 727.494 S는 각각 완전 감소 효소, C4a-hydroperoxyflavin 중급 (380 nm의 최대의 λ) 및 산화 효소 (450 nm의 λ의 최대)에 해당합니다. B) 382과 452 nm의 흡광도에서 추적은 시간의 함수로 기록.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

산화 환원 반응을 catalyze 효소는 일반적으로 촉매주기 동안 중요한 흡광도 변화를 받아야 hemes 및 flavins 같은 cofactors가 포함되어 있습니다. 플라 빈의 산화 형태 ~ 360과 450 nm의 흡광도에서 맥시멈을 제시하며, 감소는 일반적으로 450 nm의 7시 흡광도 감소에 따라 감시하고 있습니다. 일반적으로 일부 과도 중간체가 존재하지만 정규 spectrophotometers로 측정되어야하는 형태와 부식이 너무 빠르다. 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계 (또는 이와 유사한 악기)를 사용하면, 그것은 밀리초 시간 척도에서 흡광도 변화 (죽은 시간, 2 MS) 측정이 가능하다. 여기 모델로 봉사, 플라빈 의존 monooxygenase F SidA의 reductive 및 산화 반 반응을 공부했습니다. 수소 전송 속도는 무산소 조건 하에서 NADPH과 효소를 혼합 후 452 nm의 흡광도에서의 변화를 측정에 의해 결정되었다. 그 후, advantag를 복용전체 감소가 달성되기 전까지 중지 흐름 악기의 이중 혼합 모드 E, 효소가 먼저 나서 할인 효소-NADP + 복잡한는 산소와 혼합되었다, NADPH로 반응했다. 이 절차에 따라 그것은 일시적인 산소 플라 빈의 중간체를 감지하고 형성과 붕괴의 속도를 측정할 수 있습니다. 이러한 중간체의 식별은 촉매의 반응 수종의 특성에 대한 실험 데이터를 제공합니다. F SidA, hydroxylating 수종입니다 C4a-hydroperoxyflavin (일반적으로 370-380 nm의에서 모니터)의 형성의 경우. 또한, 각 단계의 일정한 비율을 측정하는 것은 한 반응의 속도 - 결정 단계에 대한 정보를 얻고 효소의 운동 및 화학적 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 있습니다. 일반적으로 유사한 접근 방식은 같은 단백질과 같은 다른 flavoenzymes하거나, 발생한 변경되는 흡광도를 위해 단백질, 사용할 수있는 cont아무것도 헴, 피리 독살 인산, 또는 비 헴 철 8-10. 이 방법의 한계는 정화 효소의 대량이 필요한 것이지만, 이것은 높은 수율로 표현 시스템을 사용하여 극복할 수 있습니다. 하나는 강한 충분한 신호가 관찰 수 있도록 충분한 단백질을 사용하여 녹음 스펙트럼을위한 최적의 단백질 농도를 결정하지만, 너무 많은 그래서 효소가 낭비되지 않습니다. 일반적으로 정지 - 유동 실험에 사용 플라빈 함유 효소의 낮은 효소 농도는 6-10 μm의 (혼합 후)이고 효소의 해당 어금니 흡광 계수를 사용하여 결정됩니다. F SidA의 경우에는 효소 구속 유행의 비율 50~65% 2입니다. 바운드 유행의 cofactor는 촉매 작용에 필요한이므로 APO-단백질은 이러한 실험에서 비활성 상태로 간주됩니다. 이 방법의 또 다른 가능한 제한 효소의 프로세스가 발생할 경우 2보다 더 빠른 MS가 (정지 - 흐름의 죽은 시간) 그들이 관찰되지 않는 일이다오히려이 요금은이 문제를 극복하기 위해 감소 수있는 전략을보고됩니다. 이것에 대한 한 예로 ferredoxin-NADP + 환원 효소 11 반응에 높은 NaCl 농도를 사용하여 포함한다. 정지 - 흐름의 흐름 회로에서 산소 닦고는 종종 본 실험에서 복잡한 단계이며 특별한주의가 필요합니다. 그것이 효과적이고 저렴한 방법이기 때문에 여기에 설명된 포도당 산화 효소 포도당 시스템은 대부분의 실험실에서 성공적으로 사용됩니다. 그러나, H 2 O 2의 생산을 포함하고 어떤 어플 리케이션을 위해 protocatechuate dioxygenase-protocatechuate 시스템과 같은 다른 대안는 12 간주되어야하는 몇 가지 단점이 있습니다. 무산소 글러브 박스의 활용은 쉽게 무산소 조건을 보장하기 위해 만들지만, 필수가 아닙니다. 우리가 효소가 산소의 부재로 감소되고 싶어하거나 농도에서 산소와 반응으로 산소가 정지 흐름의 흐름 회로에서 제거되어야합니다우리가 지정한들. 정지 - 흐름 글러브 박스에 있지만 우리가 이전 실험에서 에어로빅 버퍼를 사용한 경우, 산소 유량 회로에 있습니다. 흡광도 측정뿐만 아니라, 형광 및 원형 dichroism의 assays는 해당 액세서리와 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계에서 수행할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 일반 실험실 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> 웨일스 사람 </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner flasks </td><td> 어부 </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> 막대를 저어 </td><td> 어부 </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> 번호판을 저어 </td><td> 어부 </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk 라인 </td><td> Kontes 유리 </td><td> - </td></tr><tr><td> 아르곤 탱크 </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> 질소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> 질소 탱크, 초고 순도 급 </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> 산소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5 % 수소 밸런스 질소 탱크 </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 세인트opped 흐름 분광 광도계 </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> 글러브 박스 </td><td> 수줍어하는 </td><td> - </td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 용품 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ML BD 팔콘 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ML BD 매가 원뿔 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 ML Eppendorf의 microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 및 25 ML 유리 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> 고무 stoppers </td><td> 어부 </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> 알루미늄 물개 </td><td> 어부 </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시약TS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 일염기의 </td><td> 어부 </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 이염 </td><td> 어부 </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> 아세트산 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A.에서 포도당 산화 효소 니제르 </td><td> 시그마 </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-글루코스 </td><td> 어부 </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> 어부 </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithine 하이드로 클로라이드 </td><td> 어부 </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 monooxygenase의 reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore (SidA)는 (예 : ferricrocin 또는 N &#39;, N&#39;, N &#39;&#39; &#39;- triacetylfusarinine C) 1 독성에 필수적인 hydroxamate siderophores의 생합성에서 ornithine의 hydroxylation을 catalyzes 유행 함유 monooxygenase입니다. SidA에 의해 촉매 반응은 reductive 및 산화 반 반응 (제도 1)로 나눌 수 있습니다. 하프 반응 reductive에서 F SidA에 바인딩 산화 유행은, NADPH 2,3에 의해 감소됩니다. 하프 반응 산화에 , 감소 cofactor는 ornithine에 산소 원자를 전송 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하는 분자 산소와 반응. 여기, 우리가 속도를 측정하고에 설치되어 중지 흐름 악기를 사용 SidA의 다양한 스펙트럼 형태를 감지하는 절차를 설명 무산소 장갑 상자. 정지 - 흐름 악기에서 reactants 작은 볼륨이 빠른 속도로 혼합이며, 흐름 이후 번째로 정지전자 정류장 주사기 (그림 1), 관찰 전지에 배치 솔루션의 스펙트럼 변화는 시간이 지남에 기록됩니다. 실험의 첫번째 부분에서는, 우리는 NADPH에 의해 F SidA의 플라빈의 혐기성 환원 직접 측정 단일 모드에서 정지 - 흐름 악기를 사용하는 방법을 보여줍니다. 그러면 F SidA 처음 anaerobically 노화 루프의 시간을 지정된 기간 동안 NADPH에 의해 감소되는 이중 믹싱 설정을 사용하고 관찰 세포 (그림 1)에서 분자 산소와 반응. 오직 reductive 반 반응을 모니터링하는 경우, 솔루션의 모든 산소가 줄어든 플라 빈의 cofactor로 반응하고 궁극적으로 산화 플라 빈으로 다시 가옥 것이다 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하기 때문에이 실험을 수행하기 위해서는 무산소 버퍼가 필요 . enz의 전체 매상이있을 수도 있기 때문에 이것은 사용자가 정확하게 감소의 속도를 측정하는 것을 허용하지 것입니다yme. 하프 반응 산화가 연구중인 경우 효소가 감소하고 산화 사이 단지 단계가 관찰되고 있도록 산소의 부재로 감소되어야한다. 본 실험에 사용되는 버퍼 중 하나는 산소가 우리가 산소보다 높은 농도에서 하프 반응 산화를 공부할 수 있도록 포화 상태입니다. 이들은 종종 플라빈 함유 monooxygenases로 reductive이나 산화 반 반응 중 하나를 공부하면 수행 절차입니다. 정지 - 흐름으로 수행 미리 정상 상태 실험의 시간 척도는 고유 속도 상수의 결정 및 반응 4 중간체의 탐지 및 식별을 허용 초 밀리초입니다. 여기에 설명된 절차는 다른 플라빈 종속 monooxygenases에 적용할 수 있습니다. 5,6

우리는 reductive 및 산화 반 반응 모두를 조사하기 위해 중지 흐름 악기의 사용을 설명<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; siderophore (SidA), 플라빈 종속 monooxygenase. 그러면 SidA의 반응의 종류에 해당하는 스펙트럼을 보여 주며 우리는 그들의 형성에 대한 속도 상수를 계산합니다.

중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

Aspergillus fumigatus 시데로포어 A(SidA)는 ...의 생합성 과정에서 오르니틴의 히드록실화를 촉매하는 FAD 함유 모노옥시게나제입니다.

이 절차에서는 stopped flow 장비를 사용하여 SID A의 서로 다른 스펙트럼 형태를 검출하고 반응 속도를 측정합니다. SID A에 의해 촉매되는 반응은 FAD의 환원 및 산화 반쪽 반응으로 나눌 수 있습니다. 산화된 flavin은 N-A-D-P-H와 결합하여 환원된 flavin과 NADP를 형성하며, 분자 산소와의 반응 및 ornithine의 결합은 C four의 형성으로 이어집니다.오르니틴의 수산화 이후 생성된 하이드록시 플라빈은 탈수되어 산화된 효소를 형성합니다. NA DP plus는 촉매 주기 전반에 걸쳐 결합된 상태를 유지하며, 가장 마지막에 방출되는 기질입니다. stopped flow 장치는 적은 양의 반응물을 빠르게 혼합하고 기록하는 것을 용이하게 합니다.시간에 따른 스펙트럼 변화를 측정하는 분광광도계는 효소 촉매 반응, 특히 일시적 중간체의 생성 및 소실 속도를 측정할 수 있게 해줍니다. 저희 연구실의 구성원인 Rita Robinson과 Enviro Romero가 flavin monooxygenase를 모델 시스템으로 하여 세트 A를 이용해 이 실험들을 시연하겠습니다. 마그네틱 바가 들어 있는 500 mL 뷰흐너 플라스크에 100 mM 인산칼륨 완충액 250 mL를 붓습니다.플라스크를 고무 마개로 밀봉한 후, 교반판 위에 놓고 플라스크의 짧은 튜브를 슐렝크 라인(schlenk line)에 연결합니다. 상온에서 교반하며 진공 상태로 한 시간 동안 버퍼의 가스를 제거한 다음, 아르곤으로 퍼징합니다. 이 과정을 5회 반복합니다.마지막으로 플라스크를 Argon으로 10초 동안 퍼지합니다. 진공 매니폴드에서 플라스크를 분리하여 글로브 박스 내부에 넣습니다. 플라스크를 연 상태로 계속해서 격렬하게 교반합니다.저장조 시린지를 18.13 units per milliliter glucose oxidase와 100 millimolar glucose 용액으로 채웁니다. 이제 구동 밸브를 로드 위치로 설정하십시오. 구동 시린지를 채웁니다.다음으로 F 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다. pro data 제어 소프트웨어를 사용하여 stop syringe 비우기를 클릭한 다음, 해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 버퍼를 유로 회로로 밀어냅니다. 나머지 세 개의 드라이브 시린지에도 동일하게 수행하고 1시간 동안 평형화합니다.이제 리저버 시린지를 다시 채우고 정지된 유동 시스템의 플러싱을 반복합니다. 산소 포화 완충액을 준비하려면, 용액을 100% oxygen으로 한 시간 동안 교반하며 버블링합니다.그 다음 바이알에서 짧은 바늘을 제거하고 10초 동안 기다립니다. 이어서 긴 바늘을 제거하고 닫힌 바이알을 글로브 박스에 넣습니다. N-A-D-P-H 용액의 경우입니다.1 mg의 NADPH가 들어 있는 1.5 mL 에펜도르프 튜브를 글로브 박스에 넣습니다. pH 7.5의 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액 300 µL에 용해시킵니다.N-A-D-P-H 농도를 결정하기 위해 30 µL를 제거합니다. 이제 효소 스톡에서 산소를 제거하기 위해, 용액을 교반 바 캡과 마개 및 알루미늄 씰이 포함된 25 mL 바이알로 옮깁니다. 얼음 위에 둡니다.Schlenk 라인에 연결한 후 20분 동안 진공 탈기를 수행하고, 이어서 argon으로 퍼지합니다. 마지막으로 바이알을 argon으로 10초 동안 퍼지한 다음 진공 매니폴드에서 분리합니다. 바이알을 글로브 박스 내의 얼음 위에 둡니다.pro data 제어 소프트웨어의 제어 패널 창에서 포토다이오드 어레이(photo diode array), 외부 트리거(external trigger) 및 로그 스케일(logarithmic scale)을 선택하십시오. 또한 pro data 뷰어 소프트웨어를 실행하여 데이터 파일 저장 디렉터리를 지정하십시오.이제 저장조 시린지 C와 F의 용액을 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액 pH 7.5로 교체하십시오. C와 F 밸브를 구동 위치로 돌리십시오. pro data 제어 소프트웨어에서 stop 시린지 비우기를 클릭하십시오.그런 다음, 해당 구동 램(drive ram)을 수동으로 들어 올려 두 구동 주입기에서 버퍼를 유로 회로로 밀어 넣습니다. 저장 주입기 C와 F를 사용하여 세척 과정을 세 번 더 반복합니다. 유로 회로에서 glucose oxidase가 완전히 제거되었는지 확인하려면, pro data 제어 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.리저버 시린지 F의 용액을 효소 용액으로 교체하십시오. F 밸브를 구동 위치로 돌리십시오. pro data 제어 소프트웨어에서 stop 시린지 비우기(empty the stop syringe)를 클릭하십시오.해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 효소 용액을 유로 회로로 밀어 넣습니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어로 돌아가 획득 시간을 60초로 설정합니다. 두 드라이브 시린지에 각각의 용액이 채워져 있는지, 그리고 드라이브 램이 드라이브 시린지 피스톤에 접촉해 있는지 확인합니다.두 밸브를 모두 구동 위치로 돌리고, pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하여 구동을 수행합니다. 구동을 통해 얻은 452 nanometer 흡광도 값을 사용하여 산화 형태 효소의 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정합니다. 혼합 전의 효소 농도를 결정하고 4 milliliters의 N-A-D-P-H 용액을 준비합니다.N-A-D-P-H 용액을 사용하여 충전 저장조 주사기 C를 1.5배 더 농축하여 채우고, 앞서 설명한 대로 정지 주사기를 세 번 비우고 다시 채우십시오. 이제 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액 pH 7.5로 유로 회로에서 효소 세척액의 성분을 씻어내는 동안 스펙트럼을 획득하십시오. 그런 다음 pro data 제어 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.그런 다음 효소 스톡 용액 200 µL를 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 1000 µL와 혼합합니다. 저장조 시린지 A의 용액을 해당 효소 용액으로 교체합니다.pro data 제어 소프트웨어에서 A 밸브를 drive 위치로 전환하십시오. stop syringe empty를 클릭하십시오. 해당 drive 램을 수동으로 올려 drive 시린지 A로부터 효소 용액을 유로 회로로 밀어내십시오.지연 시간을 0.5초로, 획득 시간을 60초로 설정하십시오. 모든 구동 시린지에 해당 용액이 채워져 있는지, 그리고 구동 램이 구동 시린지 피스톤에 닿아 있는지 확인하십시오. 그런 다음 모든 구동 밸브를 구동 위치로 돌리고 pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하십시오.산화 형태 효소의 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정하여 얻습니다. 다음으로, 리저버 시린지 B의 용액을 시린지 A의 효소 용액보다 1.5배 더 농축된 N-A-D-P-H 용액으로 교체합니다. B 밸브를 드라이브 위치로 돌리고, 앞서 제어판 창에서 보여준 것과 같이 스톱 시린지를 세 번 비우고 다시 채웁니다.지연 시간을 0.5초로 설정하십시오. 20초에 획득이 시작되면, 리저버 시린지의 용액을 산소화된 버퍼로 교체하십시오. C 밸브를 드라이브 위치로 돌리십시오.pro data 제어 소프트웨어에서 세 번 플러싱하십시오. 지연 시간은 15초, 획득 시간은 900초로 설정합니다. stopped flow 장치 내에서 완전히 환원된 효소의 재산화가 일어나는 동안 계속해서 스펙트럼을 획득하십시오.N-A-D-P-H를 이용한 SID A의 혐기성 환원은 452 nm에서의 흡광도를 통해 플라빈의 산화환원 상태 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있습니다. 산화된 SID A부터 완전히 환원된 SID A의 마지막 스펙트럼까지 시간에 따른 스펙트럼 변화를 기록합니다. 이 효소 단계의 속도는 데이터를 적절한 방정식에 피팅하여 결정할 수 있습니다. 산화 속도 및 반응 중간체 또한 AF Sid A에 의한 이 반응에서 stopped flow의 double mixing 모드를 사용하여 결정할 수 있습니다. C4a-hydroxyflavin 중간체는 380 nm의 최대 흡수 파장(lambda max)으로 명확하게 검출되며, 산화된 효소는 450 nm의 최대 흡수 파장을 가집니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4~6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 용액이 혐기성 상태를 유지하도록 주의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는, 신속 화학 분석과 같은 후속 실험과 독립적으로 FLA의 상대적 및 궤양성 이온을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.Quentin은 중간체들의 슬픈 특성을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

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