중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

이 절차에서는 정지된 흐름 계측기를 사용하여 SID A의 다양한 스펙트럼 형태를 감지하고 속도를 측정합니다. SID A에 의해 촉매 된 반응은 FAD의 환원성 및 산화 반쪽 반응으로 나눌 수 있습니다. 산화된 flavin은 N-A-D-P-H에 결합하고 반응하여 감소된 flavin 및 NADP를 형성하고 분자 산소의 반응 및 ornithine의 결합은 C four를 형성합니다.

오르니틴의 히드록실화 후 하이드록시 플라빈, 하이드록시 플라빈은 탈수되어 산화 효소를 형성합니다. NA DP plus는 촉매 주기 전반에 걸쳐 결합된 상태로 유지되며 마지막으로 방출되는 기판입니다. Stopped Flow 기기는 소량의 반응물과 기록의 빠른 혼합을 용이하게 합니다.

시간 경과에 따른 스펙트럼 변화 : Stuff loss 분광 광도계를 사용하면 일시적인 중간체의 형성 속도 및 효소 촉매 반응 속도를 특히 측정 할 수 있습니다. 제 연구실의 두 구성원인 Rita Robinson과 Enviro Romero는 맛 모노 옥시게나제에서 세트 A를 모델 시스템으로 사용하여 이러한 실험을 시연할 것입니다. 250밀리리터의 100밀리몰 인산칼륨 완충액을 교반 막대가 들어 있는 500밀리리터 부흐너 플라스크에 붓습니다.

고무 마개로 플라스크를 밀봉한 다음 교반 플레이트에 놓고 플라스크의 짧은 튜브를 sch 측면 라인에 연결합니다. 진공 상태에서 실온에서 한 시간 동안 교반으로 완충액을 탈기한 다음 아르곤으로 세척합니다. 5회 반복합니다.

마지막으로 플라스크를 아르곤으로 10초 동안 플러시합니다. 진공 매니폴드에서 플라스크를 분리하고 글로브 박스 안에 넣습니다. 플라스크를 연 상태에서 계속 세게 저어줍니다.

저장소 주사기를 밀리리터당 18.13 단위의 포도당 산화효소와 100 밀리몰 포도당 용액으로 채웁니다. 이제 구동 밸브를 부하 위치로 설정합니다. 드라이브 주사기를 채웁니다.

그런 다음 F 밸브를 구동 위치로 돌립니다. pro data control 소프트웨어를 사용하여 스톱 시린지 비우기를 클릭한 다음 해당 드라이브 램을 수동으로 들어 올려 드라이브 시린지 F의 버퍼를 흐름 회로를 통해 밀어 넣습니다. 다른 세 개의 드라이브 주사기를 한 시간 동안 평형을 유지하며 계속합니다.

이제 저장소 주사기를 다시 채우고 중지된 흐름 시스템의 세척을 반복합니다. 산소 포화 완충액을 제조합니다. 교반과 함께 1 시간 동안 100 % 산소로 용액을 거품을 일으킵니다.

그런 다음 바이알에서 짧은 바늘을 제거하고 10초 동안 기다립니다. 긴 바늘을 제거하고 가까운 바이알을 글로브 박스에 넣습니다. N-A-D-P-H 솔루션의 경우.

N-A-D-P-H 1.5mg이 들어 있는 1리터 아이너 튜브를 글로브 박스에 넣습니다. 300 마이크로 리터의 혐기성 100 밀리 몰 인산칼륨 완충액에 용해시킵니다. 산도 7.5.

N-A-D-P-H 농도를 결정하기 위해 30마이크로리터를 제거합니다. 이제 효소 스톡에서 산소를 제거하기 위해 용액을 밀과 마개, 알루미늄 씰이 있는 교반 막대 캡이 들어 있는 25ml 바이알로 옮깁니다. 얼음 위에 놓습니다.

schlink 라인에 연결한 다음 20분 동안 진공 청소기로 가스를 제거한 다음 아르곤으로 세척합니다. 마지막으로 바이알을 아르곤으로 10초 동안 세척하고 진공 매니폴드에서 분리합니다. 글로브 박스 안의 얼음 위에 바이알을 놓습니다.

프로 데이터 제어 소프트웨어의 제어판 창에서. 포토 다이오드 어레이, 외부 트리거 및 로그 스케일을 선택합니다. 또한 pro data viewer 소프트웨어를 실행하고 데이터 파일 스토리지에 대한 디렉토리를 정의합니다.

이제 저장소 주사기 C 및 F의 용액을 혐기성 100밀리몰 인산칼륨 완충액, pH 7.5로 교체합니다. C 및 F 밸브를 구동 위치로 돌립니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 정지 주사기 비우기를 클릭합니다.

그런 다음 해당 드라이브 램을 수동으로 들어 올려 흐름 회로를 통해 두 드라이브 주사기의 버퍼를 밀어 넣습니다. 리저버 주사기 C와 F로 플러싱을 세 번 더 반복합니다. 흐름 회로에서 포도당 산화효소를 완전히 제거하려면 pro data control 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.

저장소 주사기 F의 용액을 효소 용액으로 교체하십시오. F 밸브를 구동 위치로 돌립니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 정지 주사기 비우기를 클릭합니다.

해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 주사기 F의 효소 용액을 흐름 회로를 통해 밀어 넣습니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어로 돌아가서 수집 시간을 60초로 설정합니다. 두 드라이브 주사기가 해당 솔루션으로 채워져 있고 드라이브 램이 드라이브 주사기와 접촉하고 있는지 확인합니다. 피스톤.

두 밸브를 모두 드라이브 위치로 돌리고 pro data control 소프트웨어에서 acquire를 클릭하여 드라이브를 수행합니다. 드라이브에서 얻은 A 4 52 나노미터 값을 사용하여 산화된 형태의 효소에 대한 스펙트럼 데이터를 3회 획득합니다. 혼합하기 전에 효소 농도를 결정하고 4 밀리리터의 N-A-D-P-H 용액을 준비합니다.

1.5배: 더 농축된 저장 용기 실린지 C를 N-A-D-P-H 용액으로 채우고 앞과 같이 정지 주사기를 비우고 다시 채웁니다. 이제 혐기성 100 밀리몰 인산칼륨 완충액 pH 7.5로 흐름 회로에서 효소 플러시 함량을 줄이는 동안 스펙트럼을 획득합니다. 이제 프로 데이터 제어 소프트웨어에서 기준선을 클릭하십시오.

그런 다음 200 마이크로 리터의 효소 원액을 1000 마이크로 리터의 혐기성 100 밀리 몰 인산칼륨 완충액과 혼합합니다.산도 7.5. 저장소 주사기 A의 용액을 효소 용액으로 교체하십시오.

A 밸브를 pro data control 소프트웨어의 드라이브 위치로 돌립니다. 정지 주사기를 비우십시오를 클릭합니다. 해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 주사기 A의 효소 용액을 흐름 회로를 통해 밀어 넣습니다.

지연 시간을 0.5초로, 획득 시간을 60초로 설정합니다. 모든 드라이브 주사기가 해당 솔루션으로 채워져 있고 드라이브 램이 드라이브 주사기 피스톤과 접촉하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 모든 드라이브 밸브를 드라이브 위치로 돌리고 pro data control 소프트웨어에서 acquire를 클릭합니다.

효소의 산화된 형태의 스펙트럼 데이터를 삼중으로 얻습니다. 다음으로, 저장소 주사기 B의 용액을 N-A-D-P-H 용액으로 교체합니다. 주사기에 있는 효소 해결책 보다는 더 집중된 1.5 겹: A.Turn, B 벨브를 드라이브 위치로 바꾸고 제어반 창에서 이전에 보이는 것과 같이 정지 주사기를 3 번 비우고 다시 채웁니다.

지연 시간을 0.5초로 설정합니다. 20초에 획득, reservoir syringe sea의 용액을 산소가 함유된 완충액으로 교체합니다. C 밸브를 구동 위치로 돌립니다.

프로 데이터 제어 소프트웨어에서 세 번 플러시합니다. 지연 시간을 15초로, 획득 시간을 900초로 설정합니다. stopped flow instrument에서 완전히 감소된 효소의 재산화 동안 스펙트럼을 계속 획득합니다.

N-A-D-P-H를 사용한 SID A의 혐기성 감소는 여기서(452)의 흡수제를 사용하여 플라빈의 산화환원 상태의 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 스펙트럼 변화는 산화된 SID A에서 완전히 감소된 SID A의 마지막 스펙트럼까지 시간에 따른 기록되며, 이 효소 단계의 속도는 데이터를 적절한 방정식에 피팅하여 결정할 수 있습니다. 산화 속도 및 반응 중간체는 또한 AF Sid, A.The C, 4 개의 A Hydroxi 플라빈 중간체에 의해이 반응에서 정지 된 흐름의 이중 혼합 모드를 사용하여 결정할 수 있으며, 3 개의 80 나노 미터의 람다 최대로 명확하게 검출되고 산화 효소는 450 나노 미터의 람다 최대를 갖는다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다. 용액이 혐기성인지 확인하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 빠른 화학 물질과 같은 FLA 독립 모노 추가 다운스트림 실험의 상대 이온과 궤양 이온을 모두 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

쿠엔틴은 중간체의 슬픈 본질을 밝히는 데 도움을 줄 수 있다.