GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍
2012년 4월 3일
OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 GFP 리포터 시스템을 사용하여 OCT 4, SOX 2K LF 4 및 M의 레트로바이러스 매개 과발현을 통해 human IPS 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 레트로바이러스를 발현하는 개별 GFP를 적절량으로 첨가함으로써 이루어집니다. 다음으로, 바이러스에 감염된 세포를 발현하는 GFP는 마우스 배아 섬유아세포와 함께 0.1%젤라틴 코팅 플레이트로 옮겨집니다.
절차의 세 번째 단계는 배지를 인간 배아 줄기 세포 배양 배지로 교체하는 것입니다. 마지막으로, 인간 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 보이는 GFP 침묵 IPS 콜로니는 분리됩니다. 궁극적으로 결과는 면역형광 염색 및 R-T-Q-P-C-R을 통한 내인성 만능 마커의 발현을 보여줍니다.
라이프 스타일, 만능 표면 마커를 사용한 염색 및 형태 학적 변화 관찰과 같은 기존 방법의 주요 장점은 바람직한 iPad입니다. 세포 콜로니는 GFP 발현 손실을 만능 세포의 마커로 사용하여 배양을 시작하는 것을 사용하여 쉽게 분리할 수 있습니다. 감염 플레이트 하루 전에 섬유 아세포 배지의 인간 섬유 아세포, 1 배 10에서 5 번째 인간 섬유 아세포를 6 웰 플레이트의 1 웰에 다음 날 배지를 흡인하여 죽은 세포를 제거하고 2 밀리리터의 신선한 섬유 아세포 배지와 1 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 프로타민 설페이트를 첨가합니다.
그런 다음 5의 감염 다중도에 해당하는 바이러스를 발현하는 각 GFP의 적절한 양을 조심스럽게 첨가하십시오. 감염 후 하루 동안 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 바이러스성 상등액을 제거하고 PBS 2밀리리터로 세 번 세척합니다.
그런 다음 감염 3일 후 섬유아세포 배지 2ml를 추가합니다. GFP 형광을 확인하고 웰에 2밀리리터를 보충합니다. 섬유아세포 배지 다음날 0.1%젤라틴으로 코팅된 10cm 페트리 접시에 섬유아세포 배지의 방사선 조사된 마우스, 배아 섬유아세포 또는 필로폰 공급세포의 제곱센티미터당 4분의 1을 10배 도금합니다.
세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날, 감염된 인간 섬유아세포를 0.05%tripsin EDTA 1밀리리터로 섭씨 37도에서 5분 동안 분리하고 200G에서 5분 동안 원심분리.섬유아세포 배지 10밀리리터에 세포를 재현탁시키고 mfs로 사전 코팅된 0.1%젤라틴에 세포를 재생합니다. 24시간 후.
배지를 HESC 배양 배지로 교체하고 배지를 매일 교체하십시오. ESC와 같은 집락은 감염 후 20-27일 후에 나타나기 시작하며, 형광 현미경에서 ESC와 같은 집락이 나타나기 시작합니다. HSC와 유사한 형태를 보이는 콜로니에서 GFP 형광이 없는지 확인합니다.
10 마이크로 리터 피펫을 사용합니다. 개별 IPSC 콜로니를 선택하여 젤라틴과 필로폰으로 코팅된 12웰 플레이트의 한 웰에 넣고 HESC 배지를 보충합니다. 1 밀리리터의 DMM F 12로 플레이트를 세척하여 세포의 매체 일일 통로를 변경합니다.
그런 다음 0.5ml의 콜라겐 분해 효소를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. DM A MF 12로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 새로운 HESC 배지를 추가합니다.
그런 다음 세포 리프터를 사용하여 군체를 작은 조각으로 나누고 플레이트에서 나머지 세포를 분리합니다. 재부유된 군체 조각을 젤라틴과 MEF로 코팅된 6개의 웰 하나로 옮깁니다. 웰 플레이트에 담아 섭씨 37도에서 이틀 동안 배양합니다.
면역형광으로 세포를 확인합니다. PBS로 3회 세척하고 실온에서 4%파라알데히드로 20분 동안 고정합니다. PBS로 세포를 세 번 부드럽게 세척하고 PBS에서 30분 동안 0.2%tritton X 100으로 침투시킵니다.
PBS에서 3%BSA로 세포를 2시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. 다음으로, 1차 항체가 있는 세포를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세 번 세척하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 배양합니다.
마지막 세척 동안 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. dappy를 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 실시간 정량적 분석을 위해 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지
화합니다.PCR은 인간 섬유아세포에서 유래한 인간 IPC에서 총 RNA를 분리합니다. RNA 분리 키트 사용. 역전사효소를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성합니다.
그런 다음 QPCR의 템플릿으로 사용하여 다능성 유전자를 검출합니다. OCT 4를 운반하는 레트로바이러스 칵테일에 감염된 인간 섬유아세포, BJ 1, SOX 2, KLF 4, 그리고 여기에 나타난 Mick은 5일째부터 재프로그래밍하는 동안 관찰된 형태학적 변화입니다. 오늘의 10, 14, 21일에는 세포가 21일 후에 HESC와 같은 형태를 보이기 시작하고 IPC는 GFP 형광으로 인식됩니다.
ESC 및 IPC와 같은 만능 줄기 세포는 프로비랄 유전자 발현을 억제하기 위해 분자 메커니즘을 발현합니다. 그러나 여기에 사용된 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 LTR에 의한 유전자 재프로그래밍과 함께 GFP를 발현합니다. 따라서, GFP를 지속적으로 발현하는 세포는 여기에서 충실하게 보이는 바와 같이 proviral gene silencing 없이 transgenes를 발현하는 것으로 간주되며, Pluripotency Molecular Network를 획득하는 재프로그래밍된 IPSC 콜로니는 GFP 발현의 부재를 보여줍니다.
이 그림은 TRA 180 1, TRA 1, 60, SSEA 4, T 4 및 nano에 대한 항체를 가진 Detroit 5 51 섬유아세포에서 유래한 콜로니의 면역조직화학 분석을 성공적으로 보여줍니다. 재프로그래밍된 IPC는 이러한 모든 마커를 표현합니다. 또한, 유전자 발현을 분석하기 위해 정량적 R-T-P-C-R을 실시한 결과, T 4 SOX 2, KLF 4 M 및 nano가 부모 섬유아세포 세포에 비해 유의하게 증가하였으나, H 9 HSCs와 동일한 것으로 밝혀졌다.
이 비디오를 시청한 후에는 바이러스를 감염시키는 방법, 형광 현미경을 사용하여 완전히 입술로 프로그래밍된 IPA 세포를 식별하고 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 주요 전능성 인자의 레트로바이러스 매개 발현을 사용하여 인간 유도 전능 줄기 세포(iPSCs)를 생성하는 방법을 설명합니다. 또한 GFP 발현을 통해 iPSC 군집을 식별하는 실용적인 접근 방법에 대해 논의합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기 세포 생물학
- 세포 재프로그래밍
- 재생 의학
배경
- 유도 전능 줄기 세포(iPSCs)는 연구 및 치료 응용을 위해 중요합니다.
- 레트로바이러스 벡터는 줄기 세포 연구에서 유전자 전달에 일반적으로 사용됩니다.
- GFP(녹색 형광 단백질)는 성공적으로 재프로그래밍된 세포를 식별하기 위한 마커로 사용됩니다.
- 전능성 이해는 재생 의학의 발전에 필수적입니다.
연구 목적
- 신뢰할 수 있는 인간 iPSCs 생성 방법을 확립하는 것.
- GFP 보고자 시스템을 이용한 iPSC 군집 식별.
- 생성된 iPSCs에서 전능성 마커의 발현을 시연하는 것.
사용된 방법
- GFP 발현 레트로바이러스를 이용한 표적 세포의 감염.
- 감염된 세포를 마우스 배아 섬유아세포가 코팅된 젤라틴 판으로 이전.
- 배지를 인간 배아 줄기 세포 배양 배지로 교체.
- 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 나타내는 GFP 양성 iPSC 군집의 분리.
주요 결과
- GFP 발현으로 확인된 iPSCs의 성공적인 생성.
- 인간 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 나타내는 군집의 분리.
- 면역형광 염색을 통해 검증된 내인성 전능성 마커의 발현.
- RT-qPCR을 통한 전능성 마커의 정량적 분석.
결론
- 기술된 방법은 효과적으로 인간 iPSCs를 생성합니다.
- GFP 발현은 iPSC 군집을 식별하는 신뢰할 수 있는 마커로 역할합니다.
- 이 접근 방법은 줄기 세포 생물학 및 재생 의학 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reprogramming human somatic cells into iPSCs using retroviral vectors with GFP enables robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a reproducible platform for generating pluripotent cells, supporting predictive confidence in disease modeling and translational research. The method's quantitative outputs and marker-based selection streamline portfolio triage and accelerate preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of reprogramming hypotheses and pluripotency pathway activation.
- Enables biological de-risking by confirming endogenous pluripotency marker expression.
- Supports predictive confidence for downstream disease modeling and cell-based assays.
- Provides a standardized system for functional target validation in regenerative research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated iPSC lines for scalable compound screening and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of pluripotency via immunofluorescence and RT-qPCR.
- Supports reliable evaluation of reprogramming efficiency and transgene silencing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns iPSC generation with disease-relevant model development for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of cell-based therapies and biomarker studies.
- Provides mechanistic de-risking for preclinical validation of pluripotency and differentiation potential.
Pipeline & Workflow Integration
This iPSC reprogramming protocol integrates from early discovery through preclinical model development, supporting lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct assessment of pluripotency induction.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated iPSC lines for downstream assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via immunofluorescence and RT-qPCR for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by generating disease-relevant pluripotent cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating iPSCs from diverse somatic sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pluripotency induction.
- Operational Value: Standardizes iPSC generation and selection for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cell-based programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative and disease modeling initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retroviral transduction and stem cell culture techniques.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative PCR infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of marker validation and colony selection criteria.
- Adaptation may be needed for different somatic cell sources or feeder systems.
- Potential limitations include retroviral integration and transgene silencing variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Infecting Cells with Retrovirus Expression Reprogramming Factors
3:31
Isolation and Expansion of Induced Pluripotent Stem Cells
4:42
Analysis of Pluripotent Markers by Immunofluorescence and Quantitative Real-time PCR
6:06
Representative Cell-reprogramming Results
8:03
Conclusion
