Name: GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 레트로바이러스와 GFP 리포터 시스템을 이용해 인간 체세포를 유도만능줄기세포로 재프로그래밍하는 방법을. 면역형광염색과 RT-qPCR로 다능성 마커를 검증하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 찰스 후드 재단의 의학 및 아동 보건 연구 상을 예일 학원에 의해 재정 지원되었다.

1. 프로그래밍 요소를 표현 레트로 바이러스에 의해 프로그래밍 <ol><li> 인간 섬유아 세포는 fibroblast 매체 (10 % 펜 / Strep과 DMEM에 FBS)에서 배양해 있습니다. </li><li> 6 - 잘 접시들이 한에 감염 전에 언젠가, 플레이트 1x10 5 인간 섬유아 세포. </li><li> 죽은 세포를 제거하고 신선한 fibroblast 매체 2 ML을 추가하는 매체를 기음. 5 μg / ML의 최종 농도에서 프로타민 황산염을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 감염의 다수 (방어) 5 5에 해당하는 각 GFP-표현 바이러스의 적절한 금액을 추가합니다. </li><li> 두 ML의 fibroblast 매체를 추가 후, 어느 날 감염 후, 바이러스 표면에 뜨는을 제거 2 ML PBS로 세 번 씻는다. </li><li> 사흘 감염 후, GFP의 형광을 확인하고 두 ML의 fibroblast 매체와 우물을 보충. </li><li> 향해 fibroblast 매체에서 4 일 감염 후 접시 1x10은 조사 마우스 배아 fibroblast 4 / ㎝ 2 (MEFs) 피더 세포10 cm 배양 접시는 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C 하룻밤 사이에 알을 품다. </li><li> 닷새 감염 후, 1 ML 0.05 % typsin / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 15 분 37 ° C 및 200g에서 5 분간 원심 분리기에 감염된 인간의 섬유아 세포를 분리. 매체를 기음과 fibroblast 매체 10ml로 세포를 resuspend. 미리 코팅된 10-cm 판으로 세포를 전송합니다. </li><li> 24 시간 이내에, hESC 배양 매체 (20 % 노크 아웃 혈청 교체, DMEM/F12, 0.1 ML 비 필수 아미노산, 4 NG / ML bFGF, 펜 / Strep / 글루 탐 산염, 베타 merceptoethanol)로 매체를 교체하십시오. 매일 매체를 변경합니다. ESC와 같은 식민지 감염 후 20-27 일에 의해 나타나기 시작합니다. </li></ol> 2. iPSCs의 분리 및 확장 <ol><li> 형광 현미경에서 hESCs에 유사한 형태를 보여줍니다 식민지에서 GFP 형광의 부재를 확인한다. </li><li> 10 μl 피펫을 사용하여 개별 iPSC 식민지를 선택하고 젤라틴 및 MEF-COA 잘 하나에 넣어테드 12 잘 플레이트와 hESC 매체와 보충. 매일 매체를 변경합니다. </li><li> passaging 들어, DMEM/F12 1 ML과 접시를 씻으 다음, collagenase 0.5 ML을 추가, 37시 10 분 품어 ° C를 </li><li> DMEM/F12으로 두 세포를 씻으십시오. </li><li> 신선한 hESC 매체 2 ML을 추가합니다. 셀 리프터를 사용하여 작은 조각으로 식민지를 헤어지게하고 접시에서 남아있는 세포를 분리. </li><li> 젤라틴 및 MEF-코팅 6 - 잘 접시의 잘 하나에 콜로니 resuspended 조각을 전송합니다. </li></ol> 3. Pluripotent 마커 Immunofluorescence 분석 <ol><li> PBS로 세포가 세 번 씻어하고 실온에서 20 분에 대한 4 % paraformaldehyde로 고정시킨다. </li><li> 부드럽게으로 0.2 % Triton은 30 분 대한 PBS의 X-100. PBS로 세포가 세 번 씻고 permeabilize </li><li> 두 시간 동안 PBS에서 3 % BSA와 세포를 잠복기가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다. </li><li> 4에서 하룻밤 일차 항체와 세포를 품어 ° C. </li> &lt;리&gt; PBS로 세포가 세 번 씻고 빛으로부터 차폐, 실온에서 한 시간 만이라도 특정한 이차 항체와 세포를 품어. </li><li> 5 분간 실온에서 배양 다음 마지막으로 세척하는 동안 PBS와 추가 DAPI로 세포 세 번 씻는다. </li><li> 형광 현미경으로 염색법을 검색. </li></ol> 4. Pluripotent 마커에 대한 정량 실시간 PCR 분석 <ol><li> Qiagen의 RNeasy 키트를 사용하여 인간의 섬유아 세포에서 파생된 인간 iPSCs에서 총 RNA를 분리. </li><li> 윗첨자 II 역방향 Transcriptase를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성. </li><li> 이전에 보고된 primers를 사용하여 pluripotency 유전자를 검색할 qPCR을 수행 6. </li></ol> 5. 대표 결과 <ol><li> 프로그래밍 중에 형태학의 변화 우리는 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC 들고 retroviruses의 칵테일과 함께 인간의 섬유아 세포에게 BJ1와 디트로이트 551 감염,하고 (그림 1) 프로그래밍을하는 동안 형태학의 변화를 감지할 수 있었다. 스물 일일 감염 후, 우리는 그들의 hESC 같은 형태로 작은 iPSC 식민지 인식하고 있습니다. 더욱이, 우리는 GFP의 형광에 의해 iPSCs을 인식하고 있습니다. 이러한 ESCs 및 iPSCs 같은 Pluripotent 줄기 세포는 proviral 유전자 발현에게 7-9을 주체할하는 분자 기계를 표현. 우리 고유의 retroviral 벡터는 retroviral LTR에 의해 유전자 프로그래밍을 함께 GFP를 표현합니다. 따라서 지속적으로 GFP를 표현하는 세포 proviral 유전자 입을없이 transgenes을 표현하는 것으로 간주됩니다. pluripotency 분자 네트워크를 취득 충실하게 다시 프로그램 iPSC 식민지는 GFP 표현식 (그림 2) 10의 부재를 보여줍니다. </li><li> 인간 iPSCs의 pluripotency의 특성화 우리는 Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 및 NANOG의 항체 (과 immunohistochemistry를 통해 디트로이트-551 섬유아 세포에서 파생된 식민지를 분석 <stroNG&gt; 표 2). 성공적으로 다시 프로그램 iPSCs 이러한 마커 (그림 3A)을 모두 표현. 우리는 또한 정량 RT-PCR 분석을 통해 유전자 발현을 분석했다. 우리는 OCT4의 표현은, SOX2, KLF4, MYC와 NANOG 크게 부모 fibroblast 세포에 비해 증가했지만 H9 hESCs (그림 3B)의와 상응하는 것을 관찰했다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> 1 그림. 레트로 바이러스에 감염된 인간 섬유아 세포의 형태학의 변경됩니다. (AD) 프로그래밍 요소에 감염된 디트로이트 - 551 섬유아 세포에서 식민지의 프로 그레시브 형태학의 변화. 5 일 (A), 10 일째 (B) 일 14 (C) 일 21 (D). 셀은 21 일 후에 hESC 같은 형태를 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> 그림 2. 언어학 재활 치료를 받고 셀에 대표 GFP 형광 표현. </strong&gt; BJ와 디트로이트 551 섬유아 세포가 레트로 바이러스 네 개의 프로그래밍 요소에게 4 표현에 감염, 그리고 4 주 동안 hESC 매체에 incubated했다. BJ 섬유아 세포 (A, B)와 디트로이트 551 (C, D)는 형태학의 유사한 표시됩니다. 일 21 일부터, GFP 부정적인 식민지는 타고난 iPSCs 10을 대표하는 형성되기 시작합니다. (E, F)의 적절한 언어학 재활 치료를받은하지 않은 디트로이트 551 세포를 변형 보여줍니다. 위상 콘트라스트보기 미만 (A, C, E) 식민지. (B, D) 제대로 GFP의 입을 보여주 세포를 다시 프로그램. 변환 콜로니 (F) 밝은 GFP 발현. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> 그림 3. 인간 유도된 pluripotent 줄기 세포의 특성화. () 휴먼 551-IPS-K1 세포 식민지는 pluripotent 세포에 공통 마커를 표현. DAPI의 염색법, 분야마다 전체 셀 내용을 나타냅니다. 부모 F의 (B)를 정량 실제 OCT4 표현을위한 시간을 PCR (RT-qPCR), SOX2, KLF4, MYCibroblast, 551-IPS-K1의 iPSCs하고, H9 인간 배아 줄기 세포 (hESCs). 데이터는 β-actin의 가사 유전자에 대한 정규화와 부모 fibroblast 세포 4의 표현 수준에 상대적으로 꾸몄다되었다.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
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<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; 우리는 공개 할게 없다.</p

iPSCs 내지 네 전사 요인 reprograms 인간 섬유아 세포의 표현. 많은 시도가 임상적으로 안전 iPSCs을 생성하는 비 통합 또는 비 유전자 접근 방법을 사용하여 인간 iPSCs를 생성하는 데 있었다. 지금까지 이러한 방법은 매우 낮은 효율을 보여 주며 재현성 11-14 향상을 위해 더욱 최적화가 필요합니다. 레트로 또는 lentiviral 방식은 쉽게 도출 및 바이러스성 통합으로 인한 안전 문제에 덜 의존 체외 질환 모델에서 인간에 대한 iPSCs를 적용하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 방법을 프로그래밍하는 것은 인간 iPSCs의 효율적인 유도에 사용할 수 있습니다. 인간 iPSCs의 선정은 주로 인간 ESCs 유사한 식민지의 형태에 따라 달라집니다. 더 중요한 건, 우리의 방법은 pluripotent 줄기 세포 7,15에 retroviral 긴 터미널 반복 (LTR)의 입을의 기능을 활용합니다. 이 프로토콜에서 사용 retroviral 벡터는 언어학에 링크...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol (14.3 M) 또는 MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 1. 배양 배지&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin, Porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>MEF feeder cells</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경: GFP 필터가 장착된 도립 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 2. 시약 및 장비&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

gfp와 retroviral 벡터를 사용하여 유도 pluripotent 줄기 세포 (ipscs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

인간 배아 줄기 세포는 (hESCs) pluripotent 및 체외 질병 모델링과 의학 1 재생에 대한 소중한 휴대 소스입니다. 그것은 이전에 인간의 체세포은 4 전사 요인 자궁외 표현 (Oct4, Sox2, Klf4과 Myc)에 의해 pluripotency로 다시 프로그램 및 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs에게) 2-4이 될 수있는 것으로 나타났습니다. hESCs 마찬가지로, 인간 iPSCs는 pluripotent과 autologous 세포에 대한 잠재적인 소스입니다. 여기 GFP 함유 retroviral 등뼈 네에 복제된 네 개의 프로그래밍 요소와 인간 fibroblast 세포를 재설 정할 프로토콜을 설명합니다. 다음과 같은 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간 ESC의 배양 조건 하에서 3~4주 인간 iPSCs를 생성합니다. 인간 iPSC의 식민지가 밀접한 형태의 hESCs 닮은 및 retroviral transgene의 입을의 결과로 GFP 형광의 손실을 표시합니다. iPSC의 식민지는 형광 microsco하에 기계적으로 분리PE는 hESCs과 비슷한 방식으로 동작합니다. 이러한 세포에서는 여러 pluripotency 유전자 및 표면 마커의 표현을 감지.

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

인간 배아줄기세포(hESCs)는 다능성을 가지며, 인 비트로(in vitro) 질병 모델링 및 재생 의학을 위한 매우 가치 있는 세포원입니다1. 이는...

이 절차의 전반적인 목표는 GFP 리포터 시스템을 통해 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC를 레트로바이러스 매개로 과발현시켜 인간 iPS 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 양의 개별 GFP 발현 레트로바이러스를 첨가함으로써 수행됩니다. 그다음, GFP 발현 바이러스에 감염된 세포를 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트로 옮깁니다.절차의 세 번째 단계는 배지를 인간 배아줄기세포 배양 배지로 교체하는 것입니다. 마지막으로, 인간 배아줄기세포와 유사한 형태를 보이는 GFP 억제 IPS 콜로니를 분리합니다. 최종적으로, 면역형광 염색과 R-T-Q-P-C-R을 통해 내인성 다능성 마커의 발현을 확인합니다.다능성 표면 마커를 이용한 라이프스타일 염색 및 형태학적 변화 관찰과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 바람직한 iPad입니다. 다능성 세포의 마커로 GFP 발현 소실을 이용하여 세포 콜로니를 쉽게 분리함으로써 배양을 시작할 수 있습니다. 감염 하루 전, 섬유아세포 배지에 인간 섬유아세포를 1 × 10⁵ cells/well 농도로 6-well 플레이트의 한 웰에 분주합니다. 다음 날, 배지를 흡입하여 죽은 세포를 제거하고 5 µg/mL의 protamine sulfate가 포함된 신선한 섬유아세포 배지 2 mL를 첨가합니다.그런 다음 감염다중도(multiplicity of infection) 5에 해당하는 적정량의 각 GFP 발현 바이러스를 조심스럽게 첨가합니다. 감염 1일 후, 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 상층액을 제거하고 2 mL PBS로 3회 세척합니다.그 후 감염 3일 뒤에 섬유아세포 배지 2 mL를 추가합니다. GFP 형광을 확인하고 웰에 섬유아세포 배지 2 mL를 보충합니다. 다음 날, 0.1% Gelatin이 코팅된 10 cm 페트리 접시에 조사된 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 피더 세포를 섬유아세포 배지 내에서 1 × 10⁴/cm² 밀도로 플레이팅합니다.세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 감염된 인간 섬유아세포를 1mL의 0.05% trypsin EDTA로 37°C에서 5분 동안 처리하여 떼어낸 후, 200 G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 세포를 10mL의 섬유아세포 배지에 재현탁하고, 0.1% gelatin이 사전 코팅된 mfs에 세포를 다시 접종합니다. 24시간 후에 처리합니다.배지를 HESC 배양 배지로 교체하고 매일 배지를 갈아줍니다. 감염 후 20~27일이 지나면 형광 현미경 하에서 ESC 유사 콜로니가 나타나기 시작합니다. HSC와 유사한 형태를 보이는 콜로니에서 GFP 형광이 없는지 확인하십시오.10 µL 피펫을 사용하여 개별 IPSC 콜로니를 선택하고, HESC 배지가 보충된 젤라틴 및 meth 코팅 12-웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 매일 배지를 교체하고, 1 mL의 DMM F 12로 플레이트를 세척하여 세포를 계대 배양합니다.그 다음 collagenase 0.5 mL를 첨가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. DM A MF 12로 세포를 두 번 세척합니다. 이어서 신선한 HESC 배지 2 mL를 첨가합니다.그 다음 셀 리프터를 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 분쇄하고 플레이트에 남아 있는 세포들을 떼어냅니다. 재현탁된 콜로니 조각들을 젤라틴과 MEF가 코팅된 6-well 플레이트의 한 웰로 옮기고 37°C에서 2일 동안 배양합니다.면역형광법으로 세포를 확인합니다. PBS로 세포를 3회 세척하고, 실온에서 4%paraldehyde로 20분 동안 고정합니다. PBS로 세포를 조심스럽게 3회 세척한 후, PBS에 희석된 0.2%tritton X 100로 30분 동안 투과화합니다.PBS 내 3% BSA로 2시간 동안 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. 다음으로, 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 그 후 PBS로 세포를 3회 세척하고, 2차 항체와 함께 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다.마지막 세척 단계에서 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. DAPI를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 정량적 실시간 분석을 위해 형광 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 획득합니다.RNA 분리 키트를 사용하여 인간 섬유아세포 유래 인간 IPC에서 총 RNA를 PCR로 분리합니다. 역전사 효소를 사용하여 1차 가닥 cDNA를 합성합니다.그다음, 이를 템플릿으로 사용하여 QPCR을 통해 다능성 유전자를 검출합니다. OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC를 포함하는 레트로바이러스 칵테일이 감염된 인간 섬유아세포(BJ)의 모습입니다. 여기에는 리프로그래밍 5일째부터 관찰된 형태학적 변화가 나타나 있습니다. 10일, 14일, 21일째의 모습이며, 21일 이후부터 세포들이 HESC와 유사한 형태를 보이기 시작하고, iPSCs는 GFP 형광으로 식별됩니다.ESC 및 IPC와 같은 다능성 줄기세포는 프로바이러스 유전자 발현을 억제하는 분자 기전을 발현합니다. 하지만 본 실험에서 사용된 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 LTR에 의해 리프로그래밍 유전자와 함께 GFP를 발현합니다. 따라서 GFP를 지속적으로 발현하는 세포는 프로바이러스 유전자 사이런싱 없이 외래 유전자를 발현하고 있는 것으로 간주되며, 여기서 보는 바와 같이 다능성 분자 네트워크(Pluripotency Molecular Network)를 획득하여 충실히 리프로그래밍된 iPSC 콜로니에서는 GFP 발현이 나타나지 않습니다.이 그림은 TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four, T four 및 nano 항체를 이용한 Detroit 5 51 섬유아세포 유래 콜로니의 면역조직화학 분석 결과를 보여주며, 성공적으로 역분화된 IPC가 이 모든 마커를 발현함을 확인할 수 있습니다. 또한, 유전자 발현을 분석하기 위해 정량적 R-T-P-C-R을 수행한 결과, T four, SOX two, KLF four M 및 nano의 발현이 모세포인 섬유아세포에 비해 유의하게 증가하였으며, 이는 H nine HSCs의 발현 수준과 일치함을 나타냈습니다.이 영상을 시청한 후, 바이러스를 감염시키고 형광 현미경을 사용하여 완전히 lip 프로그래밍된 IPA 세포를 식별하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

유전자 변형의 최근 발전에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs)의 transfection은 변덕 과정 남아있다. 우리의 지식, 인간 유도 만능 줄기 세포를 (iPSCs) transfect하는 체계적이고 효율적인 방법은보고되지 않았습니다. 여기, 우리는 효율적으로 transfect과 인간 iPSCs를 nucleofect하는 강력한 프로토콜을 설명합니다.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서 TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 레트로바이러스와 GFP 리포터 시스템을 이용해 인간 체세포를 유도만능줄기세포로 재프로그래밍하는 방법을. 면역형광염색과 RT-qPCR로 다능성 마커를 검증하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

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