Name: 분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 학습하세요 Toxoplasma gondii의 온도민감성 egress 돌연변이체 분리를 위한 표현형 스크리닝 방법을 사용하여 기생충의 숙주세포 이탈 메커니즘을 연구하는 기법입니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 과학자 발달 그랜트 0635480N 및 건강 연구 보조금 AI081220 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. BIC은 성당 기사단이 눈 재단 연구 기금에 의해 지원됩니다.

개요 프로토콜이 먼저 기생충의 70 %의 살인 (프로토콜 1)로 이어지는 mutagen의 복용량을 정의하기 위해 제공됩니다. 다음 절차는 mutagenized 기생충 수영장 (프로토콜 2, 그림 2)에서 유도 탈출구의 돌연변을 풍부하게하기 위해 제공됩니다. 이것은 농축 수영장에 탈출구 돌연변이의 발생률을 테스트하기 위해, 또는 개별 돌연변이의 출현 표현형 (프로토콜 3) 검증 프로토콜 뒤에있다. 마지막으로, 프로토콜은 희석 (프로토콜 4) 제한하여 풍부한 인구에서 하나의 기생충의 클론을 생성하기 위해 제공됩니다. 1. mutagen의 적정 높은 mutagenic 화합물과 액체와 함께 작업할 때 이러한 이중 장갑과 같은 특별한주의, 사용하십시오. 적절한 처리를 위해 별도로 액체 폐기물을 수집합니다. <ol><li> 갓 lysed tachyzoites 1 ML과 인간 포피의 fibroblast (HFF) 세포와 합류 T25 조직 문화 flasks의 예방 37에 18-25 시간을 재배 °; C % 5 이하 Ed1 매체 (D-MEM 1퍼센트 열 inactivated 태아 소 혈청 0.2 밀리미터 L-글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신 및 0.25 μg / ML Amphotericin B와 보완의 CO 2 ). 로스 외를 참조하십시오. HFF 세포 및 기생충 21의 일반적인 성장과 미디어. </li><li> 10 분 10 ML 0.1 % 태아 소 혈청 배지 (D-MEM에서 물로 ​​씻어낸 Ed1 1시 10분) 및 (여기에서 &quot;37 ° C 배양기 &#39;라고도 함)에 5 % CO 2 하에서 humidified 37 ° C 배양기에서 떠나지으로 중간 교체 . </li><li> (mutagen 작업 dilutions는 5 2.5 1.25이되고, 각각 10 밀리미터,됩니다) 플라스크에 따라 0, 12.5, 25, 50, 또는 100 μl ENU (DMSO 1 M 주식) 또는 EMS를 (DMSO 1 M 주식) 추가합니다. 각 플라스크 100 μl에 DMSO를 추가합니다. 37 ° C 배양기 4 시간 동안 알을 품다. </li><li> 10 ML 차가운 PBS (4 ° C에서 미리 냉각)로 단일층를 rinsing하여 실온에서 10 초 동안 세 번 씻는다. </li><li> 5 ML PBS를 추가, 고무 경찰관 (세포 SCR을 느슨하게 단일층을 다쳤어요aper), 물리적으로 섬유아 세포 (바늘을 노출하지 않도록 무거운 의무 가위와 바늘이 외부 샤프트를 고정)에서 기생충을 제거 26.5 G 바늘로 긁어 세포를 통과하고, 필터 3.0 μm의 폴리 카보 네이트 필터. 여러 개의 바늘 구절은 숙주 세포에서 기생충을 발표의 효율성을 높일 것입니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 기생충 농도를 세어보세요. 기생충이 계산되기 전에 hemocytomer에서 5 분 동안 기다려야 해. </li><li> Ed1 3 ML 10,000 기생충 (10 ML 33,333 기생충이 필요한 경우) 기생충을 희석. </li><li> 희석 기생충 (10,000 기생충을 포함) 3 ML과 6 잘 접시에 잘 하나를 예방. 순차적으로 잘 첫번째 300 μl를 전송하여 2.7 ML Ed1을 포함 HFF 세포와 6 잘 플레이트 합류 3 우물 이상 10 배 기생충을 희석. 7 일간 37 ° C 배양기에서 그대로 접시를 남겨주세요. </li><li> 미디어를 대기음, 얼룩, 15 3 ML있는 분 / 잘 100 % 에탄올을 수정3 ML로 / 잘 크리스탈 바이올렛 솔루션 (500 ML 1 % 암모늄 oxalate에 반죽한 125 ML 에탄올의 12.5 g 크리스탈 바이올렛) 15 분, 3 ML과 헹굼 / 잘 PBS (1 분)과 공기 건조. 상온에서 모든. </li><li> plaques 백작과 mutagen의 농도가 노출된 기생충 (70 %는 복용량을 죽이는 : 그림 1 참조)의 30 %의 생존을 달성하는 데 필요한 선택합니다. 70 %의 살인의 복용량은 역사적으로 14를 사용하고 게놈 당 미만 100 점 돌연변이 (파렐, Marth, Gubbels 외., 원고 제출) 유도된되었습니다. </li></ol> 2. 탈출구의 돌연변이 농축 (그림 2) <ol><li> 70 %의 살인을 유도 mutagen 투약을 사용하여 위에서 설명한대로 돌연변이 유발을 수행합니다. 호스트 세포의 새로운 플라스크에서 한 구절을위한 mutagenized 인구 철. </li><li> 10 ML Ed1의 mutagenized 인구에서 120,000 갓 lysed 기생충과 T25, HFF 합류 조직 배양 플라스크를 감염. 5 % CO 아래 35 ° C 배양기에서 12 시간 동안 품어2 humidified ( &quot;35 ° C 배양기&quot;라고 hereon에서). </li><li> 미디어를 대기음 25 밀리그램 / ML dextran 황산 (DS) 13과 보충 10 ML Ed1 매체를 추가 후 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스합니다. 5% CO 2와 humidified ( &quot;40 ° C 배양기&quot;라고 hereon에서)에서 40 ° C 배양기에서 26 시간 알을 품다. </li><li> 탈출구 강화의 작업 솔루션을 준비합니다. 25 MG / ML DS로 보충 10 ML HBSSc을 포함한 15 ML 팔콘 튜브의 작동 농도에서 선택의 탈출구 유도를 희석. 37 ° C waterbath 30 분 사전 따뜻한 dilutions. 근무 농도에 대한 표 1을 참조하십시오. </li><li> 기생충에 감염된 flasks에서 매체를 대기음 미리 예열 탈출구의 유도 솔루션을 추가합니다. 표 1에 표시된 시간 동안 37 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 미디어를 대기음 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스 후 (PDTC 25 밀리그램 / ML DS와 50 μm의 pyrrolidine dithiocarbamate과 보완 10 ML Ed1을 추가 광고PBS 100 MM PDTC 주식의 D 5 μl) 13. 35 ° C 배양기에서 5 시간 알을 품다. </li><li> 미디어를 대기음 10 ML PBS (실온)에 한 번 10 초 씻어 다음 10 ML Ed1 매체를 추가하십시오. 매일 흔들 flasks : 기생충은 단일층를 파괴 때까지 35 ° C 배양기로 다시 flasks 놔. 이것은 복구 7 일 주위 소요됩니다. </li></ol> 3. 탈출구를 assays에 의한 돌연변이 phenotypes의 유효성 검사 농축 화면을 수행하고 HFF 세포에서 한 구절에 대한 풍부한 인구를 성장 후 phenotypes는 탈출구 분석 11,13에 의해 확정해야합니다. 이 분석은 또한 규정 4 이후 단일 클론의 유효성을 검사하는 데 사용해야합니다. <ol><li> coverslips (물론 당 1 ML Ed1 중간)에 성장 합류 HFF 세포를 포함하는 24 잘 플레이트로 잘 인당 20,000 기생충의 예방. 24 시간 동안 40 ° C 배양기로 전송 후 35 ° C 배양기에서 8 시간을 품어. </li><li> 한 ML / 잘 PBS (1 씻으상온, 0 초). 한 ML의 탈출구를 inducers (단지 부정적인 제어 DMSO를 포함), 사전 예열 및 HBSSc에 희석하고 표 1에 설명되어있는 시간에 대한 부화를 추가합니다. </li><li> 미디어를 대기음 1 ML / 상온에서 15 분뿐만 100 % 메탄올로 고정시킨다. </li><li> autofluorescent 단백질을 표현하는 부모 기생충이 돌연변이 유발에 사용한다면, # 3.5 13 단계로 진행합니다. 비 형광 단백질을 표현하는 기생충은 상위 라인으로 사용된다면, 비교 - 빠른 상온 11시 1 분 동안 얼룩과 고정 coverslips을 얼룩. </li><li> 상온에서 24 잘 판에 1 ML / 잘 PBS로 5 분 씻으십시오. </li><li> 형광 단백질을 표현하는 기생충의 경우 : 신속 ddH 2 O (수영)에서 coverslip을 씻어 형광 신호를 보호하기 위해 gelmount 밑에 슬라이드에 탑재합니다. 비교 - 빠른 묻은 기생충의 경우, 100 % 에탄올에 10 초 씻어 및 슬라이드에 장착하기 전에 공기가 건조 해. </li><li> 으로 (형광) 현미경 사용40-60x 목적은 vacuoles의 비율 (그림 4 참조) 세포내 체재 vacuoles 적어 넣은 egressed 계산됩니다. </li></ol> 4. 희석을 제한함으로써 탈출구의 돌연변이 복제 프로토콜 3을 사용 농축 탈출구 돌연변이 인구의 표현형 검증 후, polyclonal 인구가 하나의 기생충의 클론을 얻기 위해 복제해야합니다. <ol><li> hemocytometer에서 기생충 인구 백작과 Ed1 매체 ML 당 500 기생충의 농도로 희석. </li><li> HFF 세포의 합류 단일층를 포함 384 자 판에서는 멀티 채널 pipet을 사용하여 40 μl / 잘 Ed1의 매체와 매체를 교체하십시오. 다른 이름으로 그림 5와 같이, 네 polyclonal 인구는 다음과 같이 접시 당 복제하실 수 있습니다 pipet 40 μl / 잘 우물 C3-C12, 우물에 돌연변이 C13-C22, 우물 H3-H12에 돌연변이 3, 돌연변이로 희석 돌연변 1 우물 H13-H22로 4 (우물의 최종 부피는 이제 80 μl입니다.) 코는 멀티 채널 pipet, pipet을 사용하여ution 위아래로 5 번 다음, 시작 행의 아래에 행 (행 C에서 D 또는 행 높이까지 전까지) 40 μl를 전송합니다. 행 G (뮤턴트 1, 2) 또는 행 N (돌연변이 3과 4)를 통해이 두 배 시리얼 dilutions을 계속합니다. 마지막 행에서 추가로 40 μl를 폐기하십시오. 번호판을 방해하지 않고 7-10일 동안 35 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 단일층에 &#39;구멍&#39;으로 보이는 한 plaques의 존재를위한 10-20x 목표로 거꾸로 현미경에 우물을 확인합니다. </li><li> 하나의 상패와 돌연변이 최대 4 개의 우물을 선택하고 HFF 세포와 조직 배양 플라스크의 합류로 기생충을 전송하고 Ed1 매체로 가득. 35 ° C 배양기에서 기생충 철, 세포외 기생충을 분산하기 위해서 매일 flasks를 흔들. 이것은 일반적으로 칠일 소요됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 오랜 기간 동안 저장할 때 mutagens ENU와 EMS는 안정되지 않습니다. 따라서,의 mutagenic 능력을 테스트주식 재현성 결과를 얻기위한 필수적인 조건입니다. 일반적인 적정 결과 및 ENU 및 EMS 모두 곡선을 죽이고는 그림 1에 표시됩니다. 그러나, 그것은 적절한 복용량이 사용되었음을 확인할 수있는 모든 돌연변이 유발 실험을위한 플라크의 assays를 수행하는 것이 좋습니다. mutagenized 기생충 인구의 다양성을 유지하기 위해서는 가능한 빨리 탈출구 돌연변이 화면을 진행하는 것이 중요합니다. 일반적으로 새로운 플라스크에 기생충 중 하나 통로가 살아남은 기생충은 화면과 함께 진행하기 전에 복구할 수 있도록 수행됩니다. 그것은 이렇게하면 돌연변이 분열을 초래할 것을 염두에 보관해야합니다. 따라서 그것은 모든 절차를 완료한 후 격리 여러 clonal 뮤턴트 정확히 같은 유전자형을 포함하는 제외 수 없습니다. 그들의 phenotypes (예 차동 탈출구의 유도 인자의 민감한 부분)가 아니라면, 그것은 돌연변이 유발마다 하나의 탈출구의 돌연변를 분리하는 것이 좋습니다 동일한 돌연변이 여러 번 분리 방지하려면서로 매우 다른. 반면에, 원하는 표현형와 돌연변이 격리되지 않은 모든 화면에서 결과를 표시합니다. 특히 칼슘 2 +-ionophore A23187 내성 표현형는 희귀하고 하나의 탈출구를 돌연변이 격리를 위해 여러 돌연변이 유발 실험과 스크린을 필요로합니다. 따라서 그것은 병렬로 5-10 돌연변이 유발 및 스크린 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 화면의 농축 능력이 다른 비율의 야생 타입의 기생충으로 알려진 탈출구의 돌연변를 혼합하여 테스트되었다. 이러한 믹스는 화면으로 받게되었으며 농축 인구의 돌연변이 표현형의 발병률이 평가되었다. 세포질 YFP을 표현 야생 형 세포질 RFP을 표현 기생충과 돌연변이 라인을 사용하면 그런 일이 빠르게 13 유동세포계측법 (그림 3)에서 작성할 수 있습니다. 결과는 돌연변이 phenotypes가 일상적 10,000 야생 - 타입 P 당 1 탈출구 돌연변이 기생충으로 시작하여 80 % 순도로 풍부 수있다는 것을 보여줄arasites 13. 그러나, 언제 탈출구 돌연변 : 야생 형 기생충 시작 비율이 1:100,000 기생충이며, 고립된 인구 (1:100) 탈출구의 돌연변이에만 1~2%입니다. 따라서 화면의 농축 능력은 1000 배입니다. 화면은 일반적으로 70 %가 가능한되어있는 120,000 기생충의 접종으로 시작하기 때문에, 우리는 일반적으로 농축의 두 라운드를 수행합니다. 격리된 기생충은 농축 라운드 사이에 성장하고 있습니다. 야생 형 기생충 : 1:1,000,000 탈출구 돌연변이로 시작하는 경우에도이 절차는 100 % 돌연변 인구로 안내합니다. phenotypes를 확인하고 특성화하기위한 탈출구 분석은 개별 vacuoles의 차별을 허용 숙주 세포 감염의 다수가 필요합니다. 개별 기생충이 주변에 흩어져으로 탈출구의 높은 비율과 조건을 분석하는 경우에 특히 중요합니다. 그림 4에 나타난 바와 같이 egressed 집단이 잘 분리되지 않은 경우,이 비율을 과소 평가하기 쉽다한 공포 두명 egressed vacuoles를 세어 탈출구니다. 탈출구 및 침입 관련 프로세스이며, 어떤 온도에 민감한 phenotypes는 낮은 온도에서 가벼운 표현형를 표시하기 때문에, 모든 뮤턴트 비슷한 침략의 효율성을해야합니다. 이러한 돌연변 따라서 그들의 탈출구의 표현형의 정확한 평가를 위해 충분히 높지 공포 밀도를 얻기 위해 몇 배 높은 복용량에 주사해야합니다. 또한, 일부 탈출구를 inducers 효율적으로 네 기생충 이하를 포함하는 vacuoles의 탈출구를 자극하지 않습니다. 따라서 그것은 탈출구 분석을 시작할 때 vacuoles 여덟 기생충 이상을 포함하는 것이 중요합니다. 저희 연구실에서는 화면 뮤턴트 다른 탈출구 강화에 대해 특정 탈출구 확장기와 격리. 그들의 교차 반응을 프로 파일링하여 돌연변이 다른 클래스로 그룹화 할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 탈출구의 돌연변이 온도에 민감한 될 것입니다. 탈출구를 inducers가 intracellula의 출시 이전 단계를 실행과 고립 특정 돌연변이에R 칼슘 2 + 이외의 온도에 민감한 phenotypes하는 경향이 있습니다. 이것은 신호가 세포내 칼슘 2 +의 출시에 converges 전에 빠져나갈을 일으킬 수 병렬 경로 때문입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> 1 그림. 화학 mutagen 투약 적정. A. 플라크의 assays 다양한 EMS의 농도와 더불어 지적 당 기생충의 다양한 숫자를 사용하여 6 판에서 잘 수행했습니다. 하얀 반점은 HFF의 단일층에 형성된 기생 plaques입니다. B, EMS (B)와 ENU (C)의 다양한 복용량에 노출시 기생충 C.의 생존 곡선. 서바이벌은 플라크의 assays에 의해 평가되었다. 70 %의 살인을 유도 복용량은 돌연변이 유발 실험을 위해 선택됩니다. 세 독립적인 실험의 평균은 + / - 표준 편차가 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 2. 시간 진행은 X 축으로 표시됩니다 반면, 탈출구 돌연변이 농축 화면의 도식 표현. 온도는 y 축은에 표시됩니다. 그린 기생충 빨간색 기생충이 야생 형 기생충을 반영 탈출구 돌연변이 기생충을 반영합니다. 탈출구의 유도에 의한 조건 및 자극의 변화의시기는 상단에 표시되며 온도 프로파일을 반영 파란색 라인에 화살표로 표시됩니다. Eidell 외에서 채택했다. 13. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> 그림 3. 탈출구 돌연변 phenotypes의 전형적인 농축. 다양한 비율 (X 축)에 야생 형 기생충에 혼합 탈출구의 돌연변이의 농축 결과. 화면 후 어른이 인구의 탈출구 돌연변 phenotypes의 비율은 y 축은에 꾸몄다되고 유동세포계측법 (탈출구 돌연변이 기생충은 세포질 YFP을 표명하여 평가되었다 야생 형 기생충은 싸이를 표현) RFP toplasmic. 세 독립적인 실험 결과는 빨강, 파랑, 녹색의 데이터 요소로 표시됩니다. Eidell 외에서 채택했다. 13. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> 4 그림. 탈출구 분석의 일반적인 결과입니다. . 화살표 4-8 기생충을 포함하는 네 가지 그대로 vacuoles을 표시합니다. B는. 화살표 네 개의 독립적인 egressed vacuoles을 반영 흩어진 기생충 네 가지 그룹을 표시합니다. 탈출구는 부정적인 컨트롤 ()로 A23187 (B) 또는 DMSO에 의해 유도되었다. 기생충은 세포질 YFP 22 표현. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> 그림 5. clonal 기생충 라인. 포 polyclonal 인구 (빨강, 파랑, 노랑, 녹색)을위한 시리얼 희석은 순차적으로 HFF 세포와 단일 384 잘 플레이트 합류로 희석한다. 행 C와 나는 당 잘 열 기생충을 받고가 각각 행 H와 N,까지 (40 μl + 40 μl) 희석 2 배. 회색의 그늘 잘마다 기생충의 감소 수를 나타냅니다. 일반적으로 단일 클론은 행 DF와 JL에서 발견된다. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 재고 </td><td> 근무 농도 </td><td> T25 (10 ml) 쇼핑에 필요한 μl </td><td> 배양 시간 (분) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> DMSO의 1 M </td><td> 5 MM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 190 입증 </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> DMSO 2 MM </td><td> 1 μm의 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin에 * </td><td> DMSO 2 MM </td><td> 10 μm의 </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * nigericin가 풍부하게 사용하실 수 없습니다기생충 같은, 표준 화면 nigericin의 자극을 생존하지 않는다만이 탈출구 뮤턴트의 검증에 nigericin을 사용합니다. 절차에서 사용되는 표 1. 탈출구를 inducers. 10 ML HBBSc 25 밀리그램 / ML 화면 DS, 또는 돌연변이 유효성 검사 (탈출구 분석)에 대한 노 DS를 포함하는으로 희석. 시그마 - 올드 리치의 모든 화합물.

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<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
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<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

<html> 설명한 프로토콜은 탈출구 결함으로 Toxoplasma 돌연변이를 분리하는 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 성공적으로 이중 침략의 표현형 13 일부 중 탈출구 경로의 여러 단계에 따라 돌연변이를 분리했습니다. 침략에 대한 잠재적인 효과는 차동 항체 염색법 23,24으로 비 침략 기생충으로부터 침공 차별화 소위 빨강 녹색 검정을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 침략과 탈출구 assays 모두에 대해 그것은 기생충 13,22의 세포질에 autofluorescent 단백질 마커를 표현하는 것이 편리 될 수 있습니다. 기생충이 mutagenized하는 경우에는 이미이 나중에 immunofluorescence하여 추가 phenotypic 특성을 방해할 수있는 형광 단백질을 표현. 그것은 격리 후 돌연변이로 형광 마커를 추가하는 것이 언제나 가능합니다. 설명한 바와 같이, 단순하지 않은 형광 대안은 탈출구에 대한 비교 - 퀵 염색법이다. t는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ENU </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> N3385 </td><td> -20 ° C에서 DMSO, 가게에서 1 M 주식 </td></tr><tr><td> EMS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M0880 </td><td> -20 ° C에서 DMSO, 가게에서 1 M 주식 </td></tr><tr><td> Dextran 황산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P8765 </td><td> PBS 100 밀리미터 증권 </td></tr><tr><td> 비교 빠른 </td><td> EMD 화학 </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 홀더 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> 540,100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 μm의 폴리 카보 네이트 필터 </td><td> 워트 먼지Schleicher &amp; Schuell </td><td> 110,612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> 이 incubators 공동 </td><td> 다양한 제조 업체 </td><td></td><td> 35, 37 40 Humidified, 5 % CO 2, ° C </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 다양한 제조 업체 </td><td></td><td> 63x이나 100x 오일 목적과 이상적인 반전, 넓은 필드 </td></tr></tbody></table> HBSSc (블랙 외 11 ~했다.) <ul><li> 98.0 ML 행크스 균형 소금 솔루션 (Hyclone 카탈로그 번호 SH30588) </li><li> 100 μl 1M MgCl 2 (100 밀리미터 끝) </li><li> 100 μl 1M CaCl 2 (100 밀리미터 끝) </li><li> 2.0 ML 1M Hepes 산도 7.3 (20 밀리미터 끝) </li><li> 84 MG NaHCO 3 (10 밀리미터 끝) </li></ul>

분리하기위한 유전자 스크린 toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

널리, 고맙게 여기게 세포내, protozoan 기생충 Toxoplasma gondii는 immuno-감염된 환자에서 기회 질환의 원인과 선천성 감염시 태아에 악영향을 끼친다. 1 : lytic 복제주기가 3 단계이 특징입니다. nucleated 숙주 세포의 활성 침공 2. 숙주 세포 안에서 복제 3. 숙주 세포에서 활성 탈출구. 탈출구의 메커니즘은 점점 여전히 저조한 분자 수준에서 이해하는 독특한, 높은 규제 프로세스로 평가되고있다. 탈출구의 기본 신호 전달 경로는 경로 1-5의 다양한 측면에서 행동 pharmacological 대리인의 사용을 통해 특성화되었습니다. 따라서 탈출구 여러 독립적인 트리거는 모든 세포 내 칼슘 2의 릴리스에 수렴하는 확인되었습니다 +, 또한 숙주 세포 침입 6-8에 중요 신호. 이러한 통찰력은 identi로 이끌었 후보 유전자 접근 방법을 알려탈출구 9 관련된 칼슘 의존 단백질 키나제 (CDPK)과 같은 식물의 fication. 또한, 이해 탈출구 여러 최근의 획기은 (화학) 유전 접근법에게 10-12를 사용되었습니다. Toxoplasma의 증가 유전자 접근으로 pharmacological 정보의 재산을 결합하기 위해 우리는 최근에 호스트 세포 밖으로 나가기 13 결함있는 기생충 뮤턴트 농축을 허용 화면을 설립했습니다. N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 또는 에틸 methanesulfonate (EMS)를 사용하여 화학적 돌연변이 유발이 Toxoplasma 생물학 11,14,15의 연구에서 수십 년간 사용되고 있지만, 최근에 밑에 변이 유전자 매핑을 가지고 phenotypes는 일상 16가 -18. 또한, 온도에 민감한 돌연변을 생성하여 필수적인 프로세스를 해부 수 있으며 기본 유전자 직접 확인. 이러한 돌연변이가 허용 온도 (35 ° C) 이하 야생 형 답게 행동하지만, p로 ​​실패문제의 돌연변이의 결과로 제한 온도 (40 ° C)에서 roliferate. 여기에서 우리는 온도에 민감한 탈출구의 표현형 13 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 심사 방법을 설명합니다. 탈출구 화면에 대한 도전은 다시 침략 및 호스트 세포에 기생충 일반 끈적 거림 빨리 복잡하지 않은 egressed 기생충에서 egressed 분리하는 것입니다. 이전에 설립 탈출구 화면이 세포외 기생충 11 일부터 세포 분리 biotinylation 단계의 성가신 시리즈를 기반으로했다. 이 방법은 또한 약한 phenotypes 결과 조건부 돌연변이 생성되지 않았습니다. 여기서 설명한 방법은 숙주 세포 19 고집에서 기생충을 방지 glycan 경쟁, dextran 황산 (DS)를 포함하여 기생충을 egressing의 강한 첨부 파일을 극복. 또한, 세포외 기생충은 특히 세포내 기생충을 떠나는 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)에 의해 죽였으니있다20 무사히. 따라서 구체적으로 유도 탈출구 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 화면, 유전학의 전원은 이제 완벽하게 숙주 세포의 출현의 기초 분자 메커니즘을 해명하도록 배포할 수 있습니다.

앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한 방법입니다<em&gt; Toxoplasma</em&gt;는 숙주 세포에서 egresses. 프로토콜은 화학적으로 기생충을 mutagenize 위해 제공, 유도 탈출구 결함있는 돌연변이에 대한 풍부하고, 복제된 돌연변이 표현형을 검증하고 있습니다.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

광범위하게 분포하며 필수 세포 내 기생을 하는 원생동물 기생충인 Toxoplasma gondii는 면역 저하 환자에게 기회감염성 질환을 일으키고, 태아...

이 영상은 온도 민감성 탈출 표현형을 가진 돌연변이체를 분리하기 위한 새로운 표현형 스크리닝 방법을 설명합니다. 돌연변이원과 기생충을 톡소플라스마(toxoplasma)에 감염된 인간 포피 섬유아세포 배양물에 처리합니다. 2시간 동안 침투하지 않은 기생충을 제거한 후, 표현형 발달을 유도하기 위해 플라스크를 40 °C로 옮깁니다.26시간 후, 액포에는 8~16마리의 기생충이 포함됩니다. 다음으로 세포를 탈출 유도 화합물로 자극합니다. 탈출 결함이 있는 돌연변이 기생충은 세포 내에 남아 있는 반면, 야생형 기생충은 배지로 탈출합니다.야생형 기생충은 세척을 통해 제거하고, 남은 세포들을 다시 35°C에서 배양하여 변이 개체군을 농축합니다. 마지막으로, 변이 표현형을 확인하고 한계 희석법을 통해 농축된 개체군으로부터 단일 기생충 클론을 분리합니다. 생체 내 흡입법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 탈출 변이체의 특이적 농축 효율이 훨씬 더 높다는 점입니다.우리는 성장 결함이 있는 돌연변이 패널에서 유출 돌연변이체를 확인했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 해당 돌연변이체를 사용하여 야생형 기생충과 다양한 비율로 혼합함으로써 스크리닝 절차를 최적화했습니다. 이 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Bradley Coleman이 진행하겠습니다.본 실험 과정에서는 매우 강력한 돌연변이 유발 화합물과 액체 및 감염성 기생충을 사용합니다. Toxoplasma gondii를 다룰 때는 실험복, 이중 장갑, 생물 안전 작업대(BSC)를 포함한 적절한 보호 장구를 반드시 착용해야 합니다. 발생한 모든 액체 폐기물은 적절한 처리를 위해 별도로 수집해야 합니다.먼저 합류(confluent) 상태의 인간 포피 섬유아세포 또는 HFF 세포에 신선하게 용해된 tachy Lloyds in ed one 배지 1 mL를 접종합니다. 그 후 플라스크를 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 배양기에 넣고 18~25시간 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 0.1% fetal bovine serum 배지 10 mL로 교체하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.배양 후, 각 플라스크에 ENU 돌연변이 유발물질을 0, 12.5, 25, 50 또는 100 µL씩 첨가합니다. 작업 희석 농도는 각각 1.25, 2.55 및 10 mM이 됩니다. 각 플라스크에 DMSO를 최대 100 µL까지 첨가합니다.37°C 배양기에서 4시간 동안 배양합니다. 단일층을 10 mL의 차가운 PBS로 10초씩 3회 헹굽니다. 5 mL의 PBS를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 단일층을 떼어냅니다.그 다음, 강력 가위를 사용하여 바늘이 노출되지 않도록 바늘 캡의 끝부분을 잘라냅니다. 이어서, 세포를 시린지에 옮기고 26.5 gauge 바늘을 통해 통과시킵니다. 섬유아세포에서 기생충을 물리적으로 제거하기 위해, 바늘 통과 횟수를 늘리면 숙주 세포로부터 기생충을 방출시키는 효율을 높일 수 있습니다.3.0 µm 폴리카보네이트 필터를 주사기에 부착합니다. 세포 너머에 있는 바늘을 주사기에 넣고 필터를 통해 튜브 파이프로 밀어 넣은 후, 기생충을 혈구계수기(hemocytometer)에 올려 계수합니다. 이 과정에서 가장 어려운 점은 기생충과 부스러기(debris)를 구별하는 것입니다.성공적인 결과를 위해, 계수 전 기생충이 충분히 가라앉도록 하는 것이 중요합니다. 기생충을 5분 동안 가라앉힌 후 계수하십시오. toxoplasma의 농도가 결정되면, ED one 10 mL에 기생충 농도가 mL당 3,333마리가 되도록 희석하십시오.33,333개의 기생충이 필요합니다. HFF 세포가 배양된 6-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 3 mL를 넣어 10,000개의 기생충을 접종합니다. 그다음, 한 웰에서 다음 웰로 300 µL씩 옮겨 다음 세 개의 웰에 걸쳐 기생충을 10배씩 단계적으로 희석합니다.플레이트를 37 °C 인큐베이터에 두고 7일 동안 그대로 둡니다. 일주일이 지난 후, 배지를 흡입하여 제거하고 각 웰에 100% ethanol 3 mL를 넣어 15분 동안 세포를 고정합니다. 에탄올을 제거한 후, 각 웰에 crystal violet 용액 3 mL를 넣어 15분 동안 세포를 염색합니다.마지막으로, 각 웰을 3 mL의 PBS로 1분 동안 헹굽니다. 플레이트가 마르면 플라크 수를 세고, 노출된 기생충의 생존율이 30%가 되도록 하는 돌연변이 유발제 농도를 선택합니다. 역사적으로 70% 사멸 용량이 사용되어 왔으며, 이는 게놈당 100개 미만의 점 돌연변이를 유도합니다.다음 절차 단계는 집단 내에서 유출 변이체(egress mutants)를 농축하는 것입니다. 집단이 확장되면, 갓 용해시킨 기생충 120,000개를 10 milliliters의 HFF 세포 합류층(confluent HFF cells)에 추가하십시오. 그 후 35 °C에서 2시간 동안 배양하십시오.이는 침입 시간을 제한함으로써 세포 집단을 동기화하기 위함입니다. 배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL의 차가운 PBS로 10초 동안 세포를 헹굽니다. 여기에 25 mg/mL 덱스트란 황산염(dextran sulfate)이 첨가된 DMEM 배지 10 mL를 추가합니다.이렇게 하면 기생충의 글리칸 결합 표면 단백질이 포화되어 숙주 세포에 다시 부착하고 재침입하는 것을 막을 수 있습니다. 플라스크를 5% CO₂가 포함된 40 °C의 가습 배양기에서 26시간 동안 배양하십시오. 이 과정 동안 정상적으로 접힌 단백질이 온도 민감성 변성 단백질로 교체됩니다.다음 날, 선택한 egress 유도제를 25 mg/mL dextran sulfate가 첨가된 HBSSC 10 mL가 들어 있는 15 mL 튜브에 넣어 작업 농도로 희석합니다. 이를 항온 수조에 넣어 30분 동안 용액을 미리 데웁니다.기생충이 감염된 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 탈출 유도 용액을 첨가합니다. 동봉된 문서에 명시된 대로 37 °C에서 배양합니다. 다음으로, 배지를 흡입하여 제거하고 10초 동안 헹굽니다.10 mL의 차가운 PBS와 함께, 25 mg/mL의 dextran sulfate와 50 µM의 pyridine DIO carbamate가 첨가된 10 mL의 ED one을 넣고 35 °C에서 5시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 10초 동안 한 번 헹굽니다.그 후 10 milliliters의 EED 배지를 추가하고, 플라스크를 35 degree Celsius 인큐베이터에 다시 넣습니다. 기생충이 분산되도록 매일 흔들어 줍니다.기생충이 단일층(monolayer)을 파괴할 때까지 배양을 계속합니다. 농축 스크리닝 후 약 7일이 지나면, 해당 개체군을 1회 계대 배양하여 증식시킵니다. 그 후 탈출 분석(egress assay)을 통해 표현형을 확인합니다.커버 슬립 위에서 합류(confluent) 상태로 배양된 HFF 세포가 담긴 24-웰 플레이트의 각 웰에 기생충 20,000마리를 접종하고, 허용 온도에서 배지 내의 모든 기생충이 침투할 수 있도록 35 °C 인큐베이터에서 8시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰을 1 mL PBS로 10초 동안 세척한 다음, 표현형을 유도하고 8~24마리의 기생충을 포함하는 oles를 성장시키기 위해 플레이트를 40 °C 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 실온에서, 미리 가온하여 H-B-S-S-C에 희석한 1 mL의 egress 유도제를 첨가하고, 첨부된 서면 프로토콜에 기술된 시간 동안 배양합니다.배지를 흡입하여 제거하고, 각 웰에 100% methanol 1 mL를 첨가하여 고정한 후 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온의 PBS 1 mL로 세척합니다. 세척 및 슬라이드 마운팅 후, 40~60배 대물렌즈가 장착된 현미경을 사용하여 세포 내 액포 대비 S egress의 백분율을 측정합니다. 농축된 egress 돌연변이 집단의 표현형을 검증한 후, 단일 기생충 클론을 얻기 위해 다클론 집단을 클로닝합니다.HFF 세포의 단일층이 형성된 3 84-웰 플레이트에서 기생충 농도를 ED one 배지 내 mL당 500마리로 희석하여 결정합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 배지를 웰당 40 µL의 ED one 배지로 교체합니다. 빨간색, 파란색, 노란색 및 초록색으로 표시된 네 가지 다클론 집단입니다.이 그림에서는 파이펫을 사용하여 플레이트에 클로닝할 수 있습니다. 희석된 mutant one 40 µL를 C3에서 C12 웰에, mutant two 40 µL를 C13에서 C22 웰에, mutant three 40 µL를 H3에서 H12 웰에, 그리고 mutant four 40 µL를 H13에서 H22 웰에 각각 분주합니다. 이제 각 웰의 총 부피는 80 µL가 되어야 합니다.그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 용액을 5회 파이펫팅하고, 40 µL를 시작 행 아래 행으로 옮깁니다. 이 2배 연속 희석을 Row H의 변이체 1 및 2 또는 Row N의 변이체 3 및 4까지 계속 수행합니다. 마지막 행의 남은 40 µL는 버립니다.플레이트를 움직이지 않은 상태로 35 °C 인큐베이터에서 7~10일 동안 배양합니다. 다음 주에 10~20배 대물렌즈가 장착된 도립 현미경으로 웰을 관찰하여, 단일층에 구멍 형태로 보이는 단일 플라크의 존재 여부를 확인합니다. 단일 플라크가 있는 돌연변이당 4개의 웰을 선택하고, 기생충을 HFF 세포가 합류 성장하였으며 5 mL가 채워진 T 12.5 조직 배양 플라스크로 옮깁니다.ED one 배지에서 35 °C 인큐베이터를 사용하여 기생충을 배양합니다. 세포 외 기생충을 분산시키기 위해 플라스크를 매일 흔들어 줍니다. 이 과정은 일반적으로 7일이 소요됩니다.다양한 EMS 돌연변이 유발제 농도와 웰당 다양한 수의 기생충을 사용하여 6-웰 플레이트에서 플라크 분석을 수행하였습니다. 본 영상에서 보는 바와 같이, 여기 표시된 웰의 흰색 반점들은 EMS 처리된 플레이트의 HFF 단층 위에서 형성된 기생충 플라크입니다. 이러한 플라크 분석 결과는 EMS 및 ENU의 용량을 증가시켜 노출시킨 기생충의 생존 곡선을 작성하는 데 사용되었습니다.70%의 사멸을 유도하는 투여량을 이후 돌연변이 유발 실험을 위해 선택하였습니다. 다른 실험에서는 여기에서 보여주는 바와 같이, 농축 후 집단 내의 유출 돌연변이 표현형 비율을 유세포 분석법으로 평가하였습니다. 유출 돌연변이 기생충과 야생형 기생충의 초기 비율이 10,000분의 1일 때, 농축을 통해 80%의 순도를 달성하였습니다.하지만 초기 비율이 기생충 100,000마리당 1마리였을 때, 분리된 개체군은 단지 1~2%만을 차지했습니다. 이 데이터는 스크리닝의 농축 능력이 1000배임을 시사합니다. 세 번째 실험에서는 칼슘 이온 이온ophores인 A 2 3 2 1 8 7을 사용하여 유출을 유도했습니다. 이 이미지들에서 화살표는 대조군에서 YFP를 발현하는 기생충 4~8마리를 포함하는 네 개의 서로 다른 VAE를 나타냅니다.하지만, 화살표는 네 개의 독립적인 탈출 VA를 반영하는 네 그룹의 흩어진 기생충을 나타냅니다. 따라서 이 절차에 따라 수를 세면 돌연변이와 야생형 표현형의 비율을 쉽게 결정할 수 있습니다. 원인 돌연변이와 그에 따른 표적 유전자를 식별하기 위해 코스믹 상보성 분석(cosmic complementation)이나 전장 유전체 분석(whole genome sequencing)과 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 관심 있는 돌연변이 유발제의 적정 방법, ток소플라스마 기생충 집단의 돌연변이 유발 방법, 그리고 해당 돌연변이 집단으로부터 개별 온도 민감성 탈출 돌연변이체를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 파라메틴(paramethymine) 내성 톡소플라스마 기생충을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보안경과 같은 안전 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

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앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

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