형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

이 실험의 목적은 식물 소기관의 형태학적 및 기능적 무결성을 담당하는 유전자를 확인하는 것입니다. 이것은 먼저 세포 기관 형광 마커를 운반하는 돌연변이 유발 물질 아토피 씨앗에 화학 물질로 Ethel 메탄 설포네이트를 첨가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 첫 번째 돌연변이 유발 세대의 개별 식물에서 씨앗을 수집하여 후속 돌연변이 세대 M 2의 계통을 성장시키는 것입니다.

다음으로, 돌연변이 유발 물질인 Eliana 씨앗을 컨포칼 또는 형광 현미경을 사용하여 관찰하여 비정상적인 장기 표현형을 식별합니다. 마지막 단계는 세 번째 돌연변이 유발 유전자 발생을 생성하고 돌연변이 표현형의 존재를 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 열성 돌연변이는 차세대 염기서열분석 도구를 사용하여 매핑할 수 있습니다.

일단 돌연변이 유전자의 위치가 확인되면, 야생형 유전자를 이용한 형질전환은 비정상적인 기관 표현형을 회복시켜야 한다. 이 방법은 식물 소기관의 형태학적 및 기능적 무결성 유지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 메탄, sta 씨앗 상단의 설포네이트 처리는 게놈에서 사이토신 타이밍 변화를 유도하여 타이밍에 사이토신 관을 생성합니다.

돌연변이 추가. EMS 치료는 M 두 개체 내에서 완벽한 비율의 돌연변이를 보장하기 위한 이 프로토콜의 핵심 단계입니다. 우선, 관련 세포 기관 형광 마커를 운반하도록 이전에 설계된 야생형 Columbia Ecotype의 Arabidopsis 씨앗을 얻습니다.

0.8 그램 또는 약 40, 000 씨앗을 50 밀리리터 매 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 증류수 25ml와 0.2%에델 메탄 설포네이트를 추가합니다. 배양 후 저속으로 돌연변이 믹서에서 혼합물을 16시간 동안 배양하고 액체를 흡인하고 1몰 수산화나트륨이 포함된 플라스에 버립니다.

EMS를 비활성화하려면 씨앗이 들어 있는 Falcon 튜브에 25ml의 물을 추가합니다. 튜브를 닫고 5 번 뒤집어 씨앗을 씻으십시오. 모든 씨앗이 가라앉은 후 물을 흡인하고 1몰의 수산화나트륨 플라스크에 버립니다.

이 세척 단계를 최대 10회까지 반복하고 최종 세척 후 Reese는 최소한의 물에 씨앗을 소비합니다. 25%표백제 10ml를 넣고 30초 동안 세게 흔들어 종자 살균을 진행합니다. 씨앗이 바닥에 가라앉으면 표백제를 붓고 25ml의 멸균수로 헹굽니다.

멸균수를 제거한 후 70% 에탄올 25ml를 첨가합니다. 튜브를 30초 동안 흔들고 씨앗이 바닥에 가라앉도록 합니다. 에탄올을 붓고 25ml의 멸균수로 헹굽니다.

멸균 물 세척을 두 번 반복합니다. 그런 다음 3mm 여과지가 들어있는 플라스틱 페트리 접시에 씨앗을 붓습니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 씨앗을 배양한 후 후드 아래에서 씨앗을 건조시킵니다.

150mm 페트리 접시에 씨앗을 접시 당 약 250-300 개의 씨앗으로 반 개의 Magi와 파이터 젤이 들어있는 스쿠그 배지에 놓습니다. 젤링 에이전트로 M1 세대의 씨앗을 2 주 동안 접시에서 성장시킵니다. 묘목을 토양에 이식하고 식물이 계속 자랄 수 있도록합니다.

30일에서 45일이 지나면 식물이 성숙한 성숙 단계에 도달하므로 누출을 명확하게 볼 수 있습니다. 이 시점에서 개별 M1 식물에서 M 두 개의 종자를 수집하여 1000개의 독립적인 M 두 라인을 생성합니다. 컨포칼 또는 형광 현미경으로 묘목을 관찰하려면 플라스틱 페트리 접시에서 7-10일 동안 각 M 2개 라인에서 60개의 씨앗을 반으로 자랍니다.

파이터 겔을 함유한 Moreish 및 scoog 배지는 또한 동일한 플레이트에서 EMS 처리되지 않은 대조군의 5개 묘목을 성장시킵니다. 묘목이 자라면 현미경 슬라이드에서 ABAC 밀봉 쪽이 40배 렌즈를 향하도록 5-10 cos lead-in을 장착하고 형광 아래에서 커버 슬립으로 동봉하여 피질에서 내측 영역까지 각 olein이 소기관 마커의 세포 내 분포에 변화가 있는지 관찰합니다. 긍정적 인 식물을 토양에 이식하고 방금 설명 한대로 묘목을 성장시킨 후 돌연변이 표현형이 M 3 세대임을 확인합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 원하는 장기 형광 마커를 포함하는 야생형 게놈으로 최소 3회 역교차를 통해 오염된 배경 돌연변이를 제거합니다. 매핑을 시작하려면 cogen DN Easy Z 식물 미니 키트를 사용하여 동형접합 돌연변이 Columbia DNA를 나타내는 M three에서 약 3마이크로그램의 게놈 DNA를 추출합니다. Illumina 게놈 분석기 2개의 14 염기서열분석을 위해 이 DNA를 제출합니다.

다음 단계는 zago 돌연변이 콜롬비아를 건너는 것입니다 Las Berger는 조합이 발생할 수있는 자체 수분에 따라 하나의 자손을 생성합니다. 청각 장애인 치아 세대는 결과적으로 돌연변이를 일으키는 관심 유전자를 포함하는 매핑 개체군 역할을 할 것입니다. 이 집단의 게놈 DNA를 웰 타입 식물의 게놈 DNA와 비교함으로써, 돌연변이의 위치는 게놈에서 확인될 수 있다.

F 두 식물의 성장 후, 70 및 100 F 사이에서 비정상적인 표현형을 보여주는 두 개인과 야생형 표현형을 가진 동일한 수의 F 두 식물을 모으고, 전체 펀치를 사용하여 각 식물에서 잎 디스크를 수집합니다. 잎 디스크는 같은 나이의 잎에서 채취해야 합니다. 유사한 양의 DNA를 보장하기 위해 샘플을 개별적으로 또는 그룹으로 게놈 추출을 위해 처리할 수 있습니다.

이 경우, 각 eend orph tube에 대해 5개에서 10개의 샘플을 수집할 수 있으므로 genomic DNA를 추출해야 하는 튜브의 수를 줄일 수 있습니다. 마스터 순수 식물 잎 DNA 정제 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. 그런 다음 각 샘플에서 얻은 게놈 DNA를 NanoDrop으로 정량화할 수 있습니다.

그런 다음 각 샘플에서 최대 300나노그램의 동일한 양의 DNA를 결합하여 돌연변이체와 야생형 샘플을 분리하여 먼저 라벨링 반응을 만들고 60마이크로리터의 2.5 x 무작위 프라이머 용액과 42마이크로리터의 물을 추가합니다. 섭씨 95도 이상의 DNAA를 5분에서 10분 동안 변성시킨 후 얼음 위의 샘플을 호출하여 DNA를 변성시킵니다. 15마이크로리터의 10 X DN tps를 추가합니다.

비오틴 DCTP와 혼합하고 3 마이크로 리터로 완성하십시오. 글렌 폴리메라이제. 섭씨 25도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

다음 날, 15 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 400 마이크로 리터의 차가운 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 혼합된 샘플을 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 배양한 후 20, 500배 G에서 15분 동안 원심분리합니다. 두 번째 탈수 후 500마이크로리터의 냉기, 75% 에탄올로 펠릿을 세척합니다.

DNA 펠릿을 섭씨 37도에서 10분 동안 건조시킵니다. 펠릿을 100마이크로리터의 물에 다시 현탁시키고 5마이크로리터를 사용하여 겔 바이오의 수율과 품질을 확인합니다. 프라임 랜덤 라벨링 반응은 야생형 F형 식물 2개 풀과 돌연변이 F 2개 식물 풀에서 추출한 1%aros 겔에 로드되었습니다.

마지막 단계로, 유전자 칩 애기장대(gene chip arabidopsis)를 위한 야생형 및 돌연변이 표지 반응 95마이크로리터를 하나의 게놈 어레이 혼성화(genome array hybridization)로 보냅니다. 지우개를 스캔 한 후 얻은 결과 도트 CL 파일은 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 소프트웨어를 설치 한 후 프로그램을 열고 서면 절차에있는 생체 전도체 문자열을 붙여 넣으십시오.

그런 다음 return 키를 누르면 어레이, 유전형 분석 및 매핑 웹 사이트에서 표준 BIOCONDUCTOR 패키지가 설치됩니다. 텍스트에 나열된 파일을 다운로드하여 바탕 화면의 새 폴더에 압축을 풉니다. 유전자 칩 실험에서 얻은 데이터를 야생형 C, L 및 돌연변이 C로 유지합니다.이제 야생형 C 및 돌연변이 C에 대한 유전자 칩 데이터를 폴더에 복사합니다.

그런 다음 PC용 R을 엽니다. 파일을 클릭한 다음 디렉터리 변경을 클릭합니다. 파일이 들어있는 폴더를 선택하고 파일로드 작업 공간을 클릭 한 다음 A one V five R 데이터를 선택하고 메모장을 사용하여 C do R을 읽고 전체 텍스트를 Mac의 경우 R에 복사하고 mis를 클릭 한 다음 작업 디렉토리 변경을 클릭하십시오.

파일이 포함된 폴더를 선택합니다. 작업 공간 로드를 클릭하고 작업 공간 파일을 로드하고 ATH one V five R 데이터를 선택합니다. 마찬가지로 텍스트를 사용하여 SFP R과 MAP R을 모두 열고 콘솔 창에서 텍스트를 편집하고 R에 복사합니다.

애기장대 정보 리소스 또는 TAIR에서 유전자를 검색하라는 메시지가 나타납니다. 텍스트에 있는 링크를 복사하여 인터넷 브라우저에 붙여넣습니다. 창이 나타나 파일을 열거나 저장할지 묻습니다.

저장을 선택합니다. 파일 이름을 선택하고 확장자를 첨부합니다. x ls를 수행합니다.

그런 다음 저장을 클릭합니다. 여기에 표시된 것은 예상되는 일반적인 결과입니다. 유전자 칩 애기장대 H one 게놈 어레이에서 얻은 데이터를 분석한 후, 이 그림은 유전자 칩 애기장대(Arabidopsis), H one 게놈 혼성화를 사용하여 Columbia zero mutation을 매핑하는 예를 나타내며, 여기서 수평 막대는 검출 임계값을 나타냅니다.

이 예에서 돌연변이는 염색체 1에 위치하며 수직 막대로 구분됩니다. dot XLS 파일을 열어 매핑된 영역 내에서 돌연변이의 좌표를 찾습니다. 돌연변이 게놈의 조립된 Illumina 판독에서 단일 뉴클레오티드 다형성 간의 특정 EMS 전이를 식별합니다.

이 프로토콜을 설명하는 접근 방식을 마스터하면 기존 매핑 방법에 비해 3개의 짧은 시간 프레임으로 유전자를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.