Name: 형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 배우세요 형광 현미경과 차세대 시퀀싱을 이용해 식물 세포소기관 무결성 유지 유전자를 식별하는 방법을. 이 기법은 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실, 에너지의 미국과 (보너스 번호 DE-FG02-91ER20021) 및 국립 과학 재단 (MCB 0,948,584) (FB)의 사무실에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 원고를 편집 미스 카렌 버드에 감사합니다.

1. EMS 치료 Arabidopsis thaliana의 씨앗은 T / 돌연변이 5-7로 C / G 그 결과 게놈 C - 투 - T 변화로 유도 mutagen 에이전트 에틸 메탄 산염 (EMS) 3,4로 사용 mutagenized됩니다. <ol><li> organelle 형광 마커를 (특히, 본 연구에서는 ssGFPHDEL는 (신호 시퀀스-GFP-HDEL tetrapeptide) ER 마커로 사용되었습니다) 운반 0.8 g Arabidopsis 종자를 (~ 40,000 씨앗) 무게. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브의 씨앗을 전송 후 25 ML 증류수를 추가합니다. </li><li> 0.2 % (V / V) 에틸 메탄 산염을 추가합니다. </li><li> 낮은 속도로 믹서를 nutating 16 번 시간 동안 알을 품다. </li><li> 액체를 대기음 및 1.0 M NaOH는 EMS를 inactivate이 포함된 플라스크에 그 파일을 삭제. </li><li> 가까이, 씨앗을 포함 팔콘 튜브 25 ML 물을 추가하고 5 번 반전을 씨앗을 씻어, 모든 씨앗이 정착 때까지 기다려 다음, 1.0 M 나에 물을 대기음 및 폐기<html> 플라스크, 오하이오. </li><li> 최대 10 배까지 세정 단계를 반복합니다. </li><li> 최종 세척 후에 물을 최소한의 금액에 씨앗을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 10 % 표백제의 25 ML 추가 종자 살균을 진행, 30 s에 대한 노골적인 악수. 다음 표백제를 부어 및 멸균 물의 25 ML와 린스, 씨앗 하단으로 정착합시다. 멸균 물을 붓고 25 ML 70 % 에탄올을 추가합니다. 30의 위해 튜브를 흔들어. 씨앗이 하단으로 정착합시다. 에탄올을 붓고 멸균 물의 25 ML와 린스. 다음 3 MM 여과지를 포함하는 플라스틱 배양 접시에 씨앗을 붓다, 그리고 후드를 건조하게 두 번 멸균 물로 세탁을 반복합니다. 2 일간 4 ° C에서 저장. </li><li> ½ MS phytagel (Murashige와 Skoog 매체의 절반 농도), 150 mm 페트리 접시 (접시 ~ 250-300 씨앗)에서 플레이트 씨앗. </li><li> 2 주 동안 접시에 M1 씨앗을 재배 후 토양에 이식. </li><li> M2 라인 (1000 독립 라인) 생성 개별 M1에서 M2 식물 종자를 수집합니다. </li></ol>M2와 M3 인구의 ove_title &quot;&gt; 2. 공촛점 상영 이 섹션에서 우리는 앞서 8 설명된대로 공촛점 또는 형광 현미경과 모종의 관찰에 대해 설명합니다. <ol><li> 각 M2 라인에서 육십 종자는 플라스틱 배양 접시에 7-10일, ½ MS phytagel 위해 재배되며, 동일한 접시에도 (제어) EMS-경과 다섯 모종을 재배하고 있습니다. </li><li> 5 ~ 10 cotyledons는 현미경 슬라이드에 렌즈 (40X) 방면 abaxial 측면으로 탑재하고 coverslip과 함께 동봉합니다. </li><li> 각 떡잎은 organelle 마커의 변경된 subcellular 분포에 대한 형광 아래 피질에서 중간 영역에, 관찰됩니다. </li><li> 긍정적인 식물은 토양에 이식하고 씨를를 모으고 M3 세대에서 돌연변이 표현형 확인을 위해 다시 검사합니다. </li><li> 아마도 공동 야생 형 유전자에 backcrossing 통해 배경 변이 오염 것은 적어도 세 번 제거원하는 organelle 형광 마커를 ntaining. <ol><li> 어머니는 공장에서 미세 가위 또는 집게를 사용하면 성숙 siliques을 제거하고, 개방 꽃. </li><li> 분열 조직에서 너무 작은 봉오리를 제거합니다. </li><li> 꽃잎이 한 꽃의 꽃봉오리를 열고 모든 anthers을 제거하는 sepals 사이 포셉 중 한 쌍의 팁을 넣습니다. </li><li> 포셉 한 켤레를 사용하면 아버지는 공장에서 열린 성숙한 꽃을 가지고 emasculated 식물의 오명에서 anthers를 문지 르세요. </li></ol></li></ol> 3. 매핑 이 섹션에서는 전통적인 매핑 방법 10,11 비교한다면 빠른 Borevitz 9 일부터 수정된 프로토콜을 사용하여 열성 돌연변를 매핑하는 근본적 방법을 설명합니다. 이 접근법은 하나의 분석 12 다양한 단일 기능 polymorphisms (SFPs)을 감지하는 능력과 고밀도 oligonucleotide 어레이를 사용합니다. Affymetrix의 Arabidopsis ATH1의 GeneChip 배열을 사용하면 가능합니다약 24,000의 유전자를 분석합니다. 변이를 보여주는 F 2 개인 수영장은 같은 segregating 인구 내에서 수집된 야생 - 타입 F 2 식물의 수영장과 비교됩니다. 그런 다음 돌연변이 돌연변이 수영장은 돌연변이 유전자형의 대립 유전자에 대한 풍부하고있는 지역에 매핑되며 결과적으로 같은 지역에서 야생 형 풀은 야생 형 부모 대립 유전자 13 풍부 해집니다. <ol><li> 게놈 DNA (3 μg)은 Qiagen DNeasy 공장 미니 키트를 사용하여 homozygous 돌연변 컬럼비아 (M3)에서 추출되며 Illumina 게놈 분석기 II (GA II) 14 시퀀싱을 위해 제출합니다. </li><li> homozygous 돌연변 컬럼비아 (M3)은 매핑 인구를 생성하는 Landsberg erecta으로 건너됩니다. </li><li> 매핑은 탈선 표현형 및 야생 형 표현형와 F2를 식물의 같은 숫자를 보여주는 70 최대 100 F2를 개인에 수행됩니다. </li><li> 홀 펀치를 사용하여 잎 디스크 각 공장 (0.60 ㎜)에서 수집합니다.잎 디스크의 DNA와 유사한 금액을 가지고해야하는 같은 시대의 잎사귀로부터 수집되어야한다. 샘플은 게놈 추출 별도로 또는 그룹에 대해 처리할 수 있습니다. 이 경우, 그것은 결국 당신은 게놈 DNA를 추출되어야한다있는 적은 eppendorf 튜브가되도록 각 Eppendorf 튜브에 대해 5-10 샘플을 수집할 수 있습니다. </li><li> MasterPure 식물 잎의 DNA 정제 키트 (Epicentre)은 게놈 DNA를 추출하는 데 사용됩니다. 각 시료로부터 얻은 게놈 DNA가 nanodrop로 계량합니다. </li><li> 각 샘플의 게놈 DNA의 동일한 수량 그러면 식물 DNAs 300 NG (~ 30 μL)의 합계를 함께 넣어되며 60 μL 2.5X 무작위 primers 솔루션을 추가 [125 MM 트리스-HCL (산도 6.8), 12.5 MM MgCl2, 25 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올은 750 μg / ML oligodeoxyribonucleotide의 primers (무작위 octamers] Bioprime 키트) 42 μL 물 (최종 부피 132 μL). </li><li> 변성의&gt; 95시 DNAs ° C에서 5-10 분. </li><li> 얼음 쿨. </li><li> 각 denatu으로붉은 DNA는 비오틴 dCTP [1 MM 비오틴-14-dCTP, 1 ㎜ dCTP, 2 MM dATP, 2 개의 MM dGTP, 10 MM 트리스-HCL 2 밀리미터 dTTP (산도 7.5), 1 ㎜ Na2EDTA]와 15 μL 10X dNTPs 믹스를 추가 (Bioprime 키트), 3 μL의 Klenow 효소 (Bioprime 키트)를 완료합니다. </li><li> 25 ° C.에 하룻밤 사이에 품어 </li><li> 믹스, 그 다음날, 15 μL 3 M NaOAc 400 μL 차가운 백퍼센트 EtOH를 추가합니다. </li><li> 1 시간 -80 ° C에서 부화 후 15 분에 해당하는 20,500 XG에 스핀, 뜨는 제거, 500 μL 감기의 75 % EtOH로 씻는다. </li><li> 10 분 동안 20,500 XG에 봐. </li><li> 100 μL 물에 10 분 및 resuspend위한 37 ° C에서 건조 DNA의 알약. </li><li> 겔 (그림 2)에서 수확량과 품질을 확인하는 5 μL를 사용합니다. </li><li> 를위한 야생 유형 및 돌연변이 GeneChip의 Arabidopsis ATH1의 게놈 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 반응을 레이블링의 95 μL를 보냅니다. </li><li> R 소프트웨어 (사용하는 배열을 스캔하고 취득. CEL 파일을 분석하고 <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o을</a>RG /). </li><li> R이 소프트웨어를 설치 후 프로그램을 열고 다음과 같은 문자열을 붙여 넣습니다 : 소스 ( &quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () 그런 다음 리턴 키 이것이 표준 Bioconductor 패키지 (설치 누르십 <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> 바탕 화면에 새 폴더에서 다음 웹사이트 (에서 다운로드 <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) 파일 : readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip 파일 ColLerCEL.zip은 풀었 및 결과 파일은 새 폴더에 붙여넣어야합니다. </li><li> wildtype.CEL 및 mutant.CEL에 GeneChip 실험에서 얻은 데이터를 바꿉니다. </li><li> 귀하의 GeneChip 데이터를 지금 복사 (wildtype.CEL과해당 폴더로 mutant.CEL). </li><li> 오픈 R, Mac 용)을 누른 다음 &quot;기타&quot;그리고 &quot;변경 작업 디렉토리&quot;를 클릭하십시오. b)는 PC 용 : 클릭 &quot;파일&quot;다음 &quot;변경 디렉토리&quot; </li><li> Mac 용) :이 파일이 포함된 폴더를 선택합니다. &quot;작업 영역&quot;, &quot;로드 작업 영역 파일을 클릭하십시오 :&quot;다음 &quot;파일,로드 작업 공간&quot;을 &quot;PC를 선택 ath1V5.RData, B)을 위의 파일이 들어있는 폴더를 선택하고&quot;및 ath1V5.RData를 선택합니다. </li><li> 오픈 readCEL.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사 </li><li> 오픈 SFP.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사 </li><li> 오픈 Map.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사 </li><li> 콘솔 창에서는 다음과 같은 메시지가 나타납니다 : 염색체 X는 MB yz을 제한 테어의 검색 유전자는이 링크를 붙여 넣습니다 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; 끝 = Z </li><li> 인터넷 브라우저에 링크를 복사하여 붙여 넣습니다. 창이 표시하고 파일을 열거나 저장 물을 것이다, 당신은 저장을 선택합니다. 파일 이름을 선택하고 확장자를 첨부. &quot;XLS는&quot;다음 저장을 누릅니다. </li><li> 파일을 열고 당신의 돌연변이에 대한 좌표를 (결과가 그래픽으로 그림 3에 표시됩니다) 찾을 수 있습니다. &quot;XLS&quot;. </li><li> 조립 Illumina의 매핑된 영역에서 돌연변이 게놈의 읽습 단일 염기 polymorphisms 중 특정 EMS 전환 할 4 식별합니다. 표준 절차 15을 사용하여 야생 형 유전자 (들)과 변형에 의해 돌연변이 표현형을 보완. </li></ol> 4. 대표 결과 그림 1은 공촛점 현미경 검사를 사용하여 분비 경로의 돌연변이의 식별에 사용되는 방식을 보여줍니다. 그림 2는 배열 하이브 리다이 제이션을위한 분류 게놈 DNA의 일반 준비를 보여줍니다. 그림 3, GeneChip의 Arabidopsis ATH1의 게놈 배열에서 얻은 데이터가 제공됩니다 분석하여 예상 전형 결과에서. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> ssGFPHDEL (ER 마커) (1) 표현 그림 1. Arabidopsis 형질 전환 식물은 EMS 치료 (2) 충분한 씨앗을 생산하기 위해 재배되었다. EMS로 치료 씨앗 후 M1 식물 (3)을 생성 sown되었다. 각 M1 식물은 다른 라인을 대표하고 씨앗이 각각 별도로 수집되었다. M2 씨앗이 ½ MS 기판 (4)에 도금 후 공촛점 현미경 (5)에 의해 응급실의 형태학의 결함에 대한 상영되었다. 심사하는 동안 우리는 야생 형 응급실의 형태 (6) 및 결함 응급실 phenotypes (7)를 표시 식물을 보존하는 식물을 발견. 이 공장이 M3 세대를 얻기 위해 그리고 표현형 (8)를 확인하기 위해 성장했다. M3 공장에서 게놈 DNA가 Solexa Illumina 시퀀싱 ()에 사용되었다. 같은 공장또한 F2 매핑 인구 (B)을 구하는 데 Ler-wt있는 십자가를 위해 사용되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> 그림 2. Bioprime 무작위 분류 반응 (100 μL의 5 μL)는 아가로 오스 겔 1 %로드되었습니다. 레인은 야생 형 F2 식물 풀에서이며, 차선 B는 돌연변 F2 식물의 풀에서입니다. (마커 코에서 1 KB DNA를 사다리-N3232입니다.) <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> 그림 3. 그림 GeneChip의 Arabidopsis ATH1 게놈 배열 하이브 리다이 제이션을 사용하여 열-0 변이의 매핑의 예를 나타냅니다. 이 예제에서 변이는 수직 막대기에 의해 염색체 1, 구분된에 있습니다. 가로 막대는 검출을위한 임계값을 나타냅니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기 endomembrane의 돌연변이의 식별을 위해 공촛점 현미경 기반 검사를 설명했다. 이 접근법은 쉽게 특정 형광 단백질 마커를 사용할 수있는 세포의 다른 organelles로 연장하실 수 있습니다. 화면이 대상 organelle이나 마커를 포함해야하지 않는 organelles로 중 형광 마커의 탈선 분포를 보여 돌연변이의 신분에 따라 달라집니다. 각각 이러한 돌연변 마커를 subcompartimentalize하기 organelle의 능력 중 하나가 손상되는 인구 않거나 제대로 organelles 중에서 마커를 이동시키다 수없는 돌연변이를 나타냅니다. 심사 기간 동안 우리는 어떤 뮤턴트 이르면 칠일 발아 후 빠르면 개발 단계 표현형을 보여주 것으로 파악되지만, 다른 단지 개발 이후 단계에 표현형을 보여주었다. 이것은 변이된 개발 종속적인 표현을 포함한 여러 가지 이유로 연결할 수 있지만allele (들),이 식물은 잠재적으로 흥미있는 돌연변이 삭제되지 않도록 보장하기 위해 (적어도 7~14일) 다른 성장 단계에서 검토되어...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Ethylmethane의 산염 </td><td> 시그마 </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT 베이커 </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige skoog 기초 매체 w gamborg 비타민 </td><td> 피토 technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> 시그마 </td><td> P8169-1kg </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> 마스터 순수 식물 잎의 DNA 정제 키트 </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime의 DNA 라벨링 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> 알콜 200 증명 </td><td> Decan 실험실 INC. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT 베이커 </td><td></td></tr><tr><td> 유전자 칩 Arabidopsis의 ATH1게놈 배열 </td><td> Affymetrix </td><td> 900,385 </td></tr><tr><td> 팔콘 튜브 50 ML </td><td> 코닝 </td><td> 430,290 </td></tr><tr><td> Eppendorf 튜브 1.5 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 90mm 필터 종이 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1,001,090 </td></tr><tr><td> 분석 잔액 </td><td> Mettler 톨레도 AB54-S </td><td> NA </td></tr><tr><td> Nutating (웨이브) 흔드는 </td><td> Heidolph polymax 1040 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

이 프로토콜은 Arabidopsis 모종의 형광 현미경 기반 검사를 설명하고 분비 경로에서 특정 태그를 형광 마커의 subcellular 분포를 변경 열성 돌연변를 매핑하는 방법에 대해 설명합니다. Arabidopsis 때문에 자사의 게놈 크기의 유전자 연구를위한 강력한 생물 학적 모델이며, 생성 시간, 그리고 왕국 간의 분자 메커니즘의 보존. 분자 마커를 기반으로 전통적인 방법과 대안에 변이를 매핑하는 방식으로 genotyping 배열은 비교적 빠른 있기 때문에 유리하고 아주 짧은 기간에 여러 돌연변이의 매핑을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 식물의 어떤 organelle의 무결성에 영향을 미칠 수있는 단백질의 식별이 가능합니다. 여기 예로, 우리는 endoplasmic reticulum (ER)의 무결성을위한 중요한지도 유전자에 대한 화면을 제안합니다. 우리의 접근법은 그러나, 쉽게 다른 식물 세포 organelles로 연장하실 수 있습니다(예를 들어 1,2 참조), 따라서 다른 subcellular 구조를 지배하는 분자 기초를 이해 향한 중요한 단계를 나타냅니다.

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

본 프로토콜은 형광 현미경 기반의 Arabidopsis 유묘 스크리닝 방법을 설명하며, ...을 변화시키는 열성 돌연변이를 매핑하는 방법을 기술합니다.

본 실험의 목적은 식물 세포 소기관의 형태적 및 기능적 무결성을 담당하는 유전자 또는 유전자들을 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포 소기관 형광 마커가 도입된 애기장대 종자에 화학적 돌연변이 유발제로 에틸 메탄 설포네이트(Ethyl methane sulfonate)를 처리합니다. 그 다음 단계로, 첫 번째 돌연변이 세대(M1)의 개별 식물에서 종자를 수집하여 후속 돌연변이 세대인 M2 계통을 육성합니다.다음으로, confocal 또는 형광 현미경을 사용하여 Eliana 종자의 돌연변이 유발물을 관찰함으로써 비정상적인 소기관 표현형을 식별합니다. 마지막 단계는 세 번째 돌연변이 세대를 생성하고 돌연변이 표현형의 존재를 확인하는 것입니다. 최종적으로, 차세대 염기서열 분석 도구를 사용하여 열성 돌연변이의 위치를 매핑할 수 있습니다.돌연변이 유전자의 위치가 확인되면, 야생형 유전자를 형질전환하여 비정상적인 세포소기관 표현형을 복구해야 합니다. 이 방법은 식물 세포소기관의 형태적 및 기능적 무결성 유지에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Atil methanes, sulfonate 처리를 atop sta 종자에 실시하면 게놈 내 시토신 타이밍 변화가 유도되어 시토신 gwan to timing이 발생합니다.돌연변이 유도. M2 개체 내에서 최적의 돌연변이 비율을 확보하기 위해 EMS 처리는 이 프로토콜의 핵심 단계입니다. 우선, 관련 소기관 형광 마커를 운반하도록 미리 제작된 야생형 Columbia Ecotype Arabidopsis 종자를 준비합니다.0.8 g 또는 약 40,000개의 종자를 50 mL 팔콘 튜브에 옮깁니다. 그 다음 증류수 25 mL와 0.2% Ethel methane sulfonate를 추가합니다. 혼합물을 저속 돌연변이 유발 믹서에서 16시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 액체를 흡입하여 1 M 수산화나트륨이 담긴 플라스크에 버립니다.EMS를 불활성화하려면 종자가 들어 있는 Falcon 튜브에 물 25 milliliters를 추가하십시오. 튜브를 닫고 5회 뒤집어 종자를 세척합니다. 모든 종자가 가라앉으면 물을 흡입하여 1 molar 수산화나트륨 플라스크에 버립니다.이 세척 단계를 최대 10회 반복한 후, 마지막 세척 단계에서 최소량의 물로 종자를 헹굽니다. 10% bleach 25 milliliters를 첨가하고 30초 동안 격렬하게 흔들어 종자 멸균을 진행합니다.

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GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

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저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

이 비디오에서는 세제 가용화 후 대장균에서 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 막 단백질 안정성을 스크리닝하기 위한 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 기술을 시연합니다. 유리 GFP가 거의 또는 전혀 없는 크기 배제 프로파일에서 대칭적인 피크를 나타내는 단백질은 분해 및 응집이 최소화된 정제된 단백질을 나타내며, 이는 이후에 구조 기능 분석을 위해 선택될 수 있습니다.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

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이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

배우세요 형광 현미경과 차세대 시퀀싱을 이용해 식물 세포소기관 무결성 유지 유전자를 식별하는 방법을. 이 기법은 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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