Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

다음 절차의 전반적인 목표는 인간 혈장에서 피브린 응고가 형성되는 동안 응고 단백질 인자 V의 활성을 측정하는 마이크로플레이트 분석을 개발하는 것이었습니다. 부상에 대한 반응으로, 혈액 응고 과정이 활성화되고 궁극적으로 응고 효소 트롬빈의 생성으로 이어지는 일련의 Xymogen to protease 변환 반응을 일으켜 궁극적으로 응고 효소 트롬빈의 생성으로 이어지고, 트롬빈 cleves 가용성 피브리노겐 to 피브린 단량체, 그리고 나서 불용성 피브린 응고를 형성하기 위해 결합합니다. 일반적으로 혈액은 건강하거나 손상되지 않은 상태에서 자유롭게 흐르는 액체로 남아 있으며, 형성된 피브린의 양은 분해되거나 분해된 피브린의 양과 같습니다.

그러나 특정 질병 상황에서는 너무 많은 응고가 심장 질환과 뇌졸중으로 이어지는 반면, 너무 적은 응고는 혈우병에서 종종 볼 수 있는 출혈 경향으로 이어집니다. 인자 V는 활성화된 폼 팩터 5 A에서 프로트롬빈 효소 복합체의 일부로 피브린 응고 형성 중 트롬빈 생성의 중요한 촉진제인 혈장 내 단백질이며, 프로트롬빈은 4가지 구성 요소인 인자 10 A, 프로테아제 인자 5 A, 보조 인자 지질, 표면 및 칼슘으로 구성됩니다. 멜린 인자 5 A는 기질 프로트롬빈에 대한 인자 10 A의 촉매 효율 또는 kcat을 약 3000배 증가시켜 트롬빈 생성 및 피브린 응고 형성을 크게 향상시킵니다.

마이크로플레이트 플랫폼은 편의성, 시간 비용, 소량의 시료, 지속적인 모니터링 및 높은 처리량으로 인해 효소 촉매 이벤트를 측정하는 데 선호됩니다. 피브린 응고 형성 현상은 피브린 응고가 없고 최소한의 광 흡수율이 있는 투명한 노란색 모양에서 피브린 응고와 최대 광 흡수율을 가진 불투명한 흐린 모양으로 변화함에 따라 플라즈마의 광 흡수도 증가를 측정하여 마이크로플레이트 리더로 모니터링할 수 있습니다. 수동 틸트 튜브 분석 또는 자동 분석기를 사용한 분석과 같은 기존 분석법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 빠르고 저렴하며 시료 부피가 적고 처리량이 높다는 것입니다.

이 분석은 의도하지 않게 활성화된 인자와 트롬빈 활성화 인자 5의 활성을 측정하여 전체 기능 활성에 대한 완전한 정량적 평가를 얻습니다. 그 기술을 시연하는 것은 실험실의 석사 학생인 Derek Tilley가 될 것입니다. 혈장 샘플에서 인자 5 활성을 측정하기 위해서는 인자 5 1 단계 활성, 패널 A의 피브린 응고 형성 시간의 표준 곡선 및 패널 B의 피브린 응고 형성의 초기 속도를 구성해야하며, 정상 인간 플라즈마 또는 NHP를 표준으로 사용하여 정의에 따라 요인 5 활성의 1 단위를 포함하는 ML당 요인 5 활성이 요인 5 결핍 혈장을 해동합니다. 정상 인간 혈장, 미확인 혈장 및 트롬보플라스틴을 37도에서 10분 동안 샘플합니다.

factor five 결핍 혈장 및 혈전 성형술 이식을 부드럽게 혼합하여 플라스틱 세척 트레이를 분리하고 얼음 위에서 배양합니다. 정상적인 인간 플라즈마를 보관하고 부드럽게 혼합한 후 알 수 없는 플라즈마를 얼음에 보관합니다. 염화칼슘 25 밀리몰을 증류수에 넣어 실온의 별도 세척 트레이에 넣어 factor five 1단계 활성 표준 곡선을 위해 보관하십시오.

1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4에서 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 및 512배의 일반 인간 혈장을 각각 2배 연속 희석하여 각각 200마이크로리터씩 준비하고 와류를 잘 만들고 얼음에서 배양합니다. 미지 혈장 샘플의 경우, 1.5ML 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4에서 일반 인간 플라즈마와 미지 샘플 플라즈마의 40배 희석액 각각 200마이크로리터를 준비합니다. 5개의 마이크로웰 스트립을 마이크로플레이트 리더의 템플릿 홀더에 넣습니다.

Microplate 리더를 켜고 멀티채널 파이펫을 사용하여 Softmax Pro microplate 어플리케이션 소프트웨어에 액세스합니다. 단일 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 인자 5 결핍 혈장을 모든 시료 마이크로플레이트 웰에 동시에 추가하고, 준비된 정상 인간 혈장의 10회 연속 희석액 50마이크로리터와 정상 인간 혈장 및 시료 혈장 미지수의 40배 희석액을 다중 채널 피펫을 사용하여 MICROPLATE 웰을 분리하고, 모든 시료 웰에 50마이크로리터의 혈전 성형술을 추가합니다. 섭씨 25도의 마이크로플레이트 리더에서 1분 동안 배양하고 1분 배양 중 15-25초 동안 흔들어 배양합니다.

MICROPLATE 리더와 인터페이스된 컴퓨터를 사용하여 Softmax Pro Microplate 애플리케이션 소프트웨어에 액세스하십시오. Microplate 리더를 405나노미터의 흡광도 파장으로, 운동 온도를 섭씨 25도로 설정하고 Microplate 리더를 염화칼슘 첨가 후 처음 5초 동안 흔들도록 프로그래밍하고 6분 동안 5초마다 405나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그 후, 5초의 진탕 간격은 두 개의 멀티 채널 피펫을 사용하여 계산된 응고 시간에 포함되지 않으며, 샘플이 있는 두 개의 마이크로플레이트 스트립에 50마이크로리터의 염화칼슘을 동시에 추가합니다.

15초 동안 기다렸다가 즉시 컴퓨터에서 Softmax Pro의 시작 아이콘을 눌러 분석을 시작합니다. 분석된 각 혈장 샘플에 대해 응고 형성 시간이 결정되고 흡수율의 절반 최대 증가에 도달하는 시간(초)으로 정의됩니다. 초기 응고 형성 속도는 시간 대비 흡수율 증가의 선형 부분의 처음 5개 시점에 걸친 흡수도 증가 속도로 정의됩니다.

응고 형성 정도는 런이 끝날 때 응고 형성 이벤트 동안 달성된 최대 흡수도와 최소 흡수도의 차이로 정의됩니다. Softmax Pro의 ABSORBENCE 대 시간 프로파일을 사용하여 정상 인간 혈장의 연속 희석을 위한 응고 형성의 시간, 초기 속도 및 정도를 결정할 수 있습니다. 요인 V 1단계 활성 표준 곡선을 구성하려면 40배 희석된 정상 인간 혈장 및 샘플 혈장 미지수에 대한 응고 시간을 사용하여 요인 5 1단계 활성 표준 곡선에서 밀당 단위 단위의 요인 5 활성을 보간합니다.

이것은 요인 5 1단계 활동 또는 트롬빈에 의한 의도적인 활성화가 없는 활동을 나타냅니다. 이는 마이크로플레이트 리더에 의해 생성된 시간 경과에 따른 factor five 분석에서 피브린 응고 형성의 대표적인 예입니다. 이 프로파일은 단일 마이크로플레이트에서 32배로 희석된 정상 인간 혈장을 사용하여 피브린 응고 형성을 나타냅니다.

글쎄요, 세로축은 피브린 응고 형성의 결과로 발생한 405나노미터의 흡수제 변화를 나타냅니다. 응고 형성 시간은 흡수도 대 시간 곡선의 중간점인 36.4초로 계산되었습니다. 초기 응고 형성 속도는 분당 611.88 밀리 단위로 계산되었습니다.

구름 형성 정도는 0.35 단위로 계산되었다. 요인 5 분석은 구름 형성의 시간, 초기 속도 및 정도를 정확하게 측정합니다. 분석 완료 시 우물을 검사한 결과 응고 형성이 발생한 것으로 확인되었습니다.

모든 반응은 405 나노미터에서 0.35 및 0.45 단위 사이의 흡광도의 일반적인 흡광도 변화와 혈전 성형술 및 염화칼슘 후의 최대 흡광도로 이루어진 일반적인 흡광도 변화로 CloudFormation과 거의 동일한 범위에 도달했습니다. 또한 요인 5 1단계 활성, 응고 시간의 표준 곡선(초) 대 요인 5 활성(mil당 단위), 초기 발톱 형성 속도(분당 밀리 단위 대 요인 5)의 대표적인 예가 있습니다. 정상적인 인간 플라즈마에 대한 mil당 단위 단위의 활성은 각각 패널 A와 패널 B에 표시되어 있습니다.

인자 5는 일반적으로 트롬빈과 함께 활성화되기 때문입니다. 트롬빈을 첨가하고 배양한 후 두 번째 분석인 활성 보조 인자 5 A는 인자 5 2단계 분석을 위해 트롬빈을 첨가하여 의도적으로 활성화한 혈장 샘플의 인자 5 2단계 활성을 정확하게 측정하는 데 중요합니다. HBS pH 7.4에서 100 나노 몰의 최종 농도에서 200-300 마이크로 리터의 정제 된 트롬빈을 준비하고 얼음에서 120 마이크로 리터의 위의 정상 인간 혈장 및 샘플 플라즈마를 2.8 밀리 몰을 포함하는 170 마이크로 리터의 HBS pH 7.4로 40 배에서 100 배로 희석합니다.

염화칼슘. 각 샘플에 10나노몰의 최종 농도를 달성하기 위해 10마이크로리터의 트롬빈을 추가합니다. 소용돌이. 37도에서 혼합하고 배양하려면 1분 동안 HBS pH 7.4 400마이크로리터를 첨가하여 일반 인간 혈장과 샘플 혈장을 500배로 희석합니다.

소프트 맥스 Pro의 흡광도 대 시간 프로파일에서 각 샘플 혈장 미지 물질 분석에서 정상 인간 혈장에 대한 응고 시간을 측정합니다. 500배 희석을 고려하여 각 샘플의 응고 시간을 사용하여 응고 시간 대 활성의 요인 5 1단계 표준 곡선에서 요인 5 2단계 활성을 계산합니다. 이것은 인자 5, 2단계 활동 또는 트롬빈에 의한 의도적인 활성화를 나타냅니다.

그런 다음, 총 요인 5 활성은 요인 5 2단계 활성에서 요인 5 1단계 활성을 뺀 값으로 계산될 수 있다. 로그 응고 시간 대 로그 인자 5 활성의 표준 곡선을 사용하여 파종성 혈관 내 응고 또는 DIC 환자 9명(모두 9명의 DIC 환자)의 정상 인간 혈장과 혈장에서 인자 5 활성을 측정했습니다. 나타난 인자 5, 1단계 활동 및 초기 혈전 형성률은 평균 54% 및 18% 감소한 요인 5, 2단계 및 총 활성은 정상 인간 혈장에 비해 DIC 환자에서 평균 44% 및 42% 감소했습니다.

인자 5와 DIC 환자는 시간이 길어지고 섬유 응고 형성 속도가 감소했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 이 방법을 구현하는 방법에 대한 좋은 아이디어를 갖게 될 것입니다. 이 방법은 혈장에서 응고 인자의 활성을 측정하는 데 쉽게 적용할 수 있으므로 광범위한 연구 및 임상 응용 분야에 적합합니다.

궁극적으로 인자 V의 이러한 정보는 DIC와 같은 혈전성 또는 출혈성 질환의 조기 진단 및 치료를 통해 의료 환경에 긍정적인 영향을 미칠 것입니다.