Name: Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 배우세요 인간 혈장에서 인자 V 응고 활성을 측정하는 마이크로플레이트 분석법을. 이 고속 스크리닝 기법은 혈전 형성 동역학을 정량적으로 평가하여 출혈 및 혈전 장애 연구에 활용됩니다.

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연구는 전문 개발 및 연구 시작 자금 기술 온타리오 연구소 (UOIT)의 대학에서 박사 존 A. Samis와 이리나 레비 타스 라에 건강 연구 건강 전문 학생 연구 상 캐나다 연수를 지원했다. 저자는 동영상을 준비 그녀의 도움 섀넌 에버렛 (Everett)을 (교육 및 학습 센터, UOIT)을 인정합니다. 저자는 자신의 멘토링, 통찰력, 그리고 도움이 토론에 박사는 마이클 E. Nesheim을 (생화학 부, ON 여왕의 대학, 킹스턴)을 인정합니다. 저자는 또한 연구에 사용 된 DIC 환자 플라즈마를 제공하는 박사 쳉 호크 토를 (로알 드 달의 Haemostasis 및 혈전증 센터, 로얄 리버풀 대학 병원, 리버풀, 영국)을 인정합니다.

1. FV-부족한 인간 플라즈마의 작성 <ol><li> 이 방법은 원래 블룸 외 4에 기술 된 절차의 수정입니다. </li><li> 어떤 약을 복용하지 않습니다 - 동의 건강한 성인 자원 봉사자 (50 세 남성 또는 여성, 18 세)에서 전체 인간의 피를 구합니다. 라텍스 장갑과 절차를 통해 실험실 코트를 착용하십시오. </li><li> 3.2 % (w / V) 증류수에 trisodium의 구연산의 100 ML을 준비합니다. 별도의 60 ML의 주사기에이 솔루션의 6.0 ML를로드합니다. 조심스럽게 주사기에 6.0 ML 마크에 대한 우울한 플런저에 의해 공기를 제거합니다. </li><li> bicep와 팔 사이 cubital 정맥의 장소를 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용합니다. 3 ML의 주사기 20 게이지 나비 장치를 연결합니다. cubital 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 혈액은 3 ML 마크에 가득 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. 피를 주사기를 폐기하십시오. 이 단계는 바늘에 손상된 내피에서 출시 조직의 요소를 제거하는 수행됩니다응고 과정을 활성화하고 FV-결함 플라즈마의 준비를 방해 할 수 있습니다 부상 사이트입니다. </li><li> 나비 바늘 60 ML의 주사기와 &#39;로드&#39;6.0 ML trisodium의 구연산으로 연결하고 피가 주사기에 60 ML에 도달 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. (최종 구연산 농도 10.9mM). </li><li> 나비 바늘에서 주사기를 제거하고 주사기 콘센트에 장갑 낀 손가락 또는 엄지 손가락을 유지하면서 부드럽게 주사기를 섞는다. </li><li> 60 ML 주사기 위에서 설명한대로 3.2 % trisodium의 구연산의 6.0 ML로 가득 각각에 혈액을 그리기 계속합니다. 하나는 원심 분리 후와 FV-결함 플라즈마의 50 μl가 microplate 분석에서 샘플 당되는 플라즈마로 citrated 혈액 양의 약 50 % 회복을 예상해야합니다. 저희 연구실은 정기적으로 3.2 % trisodium의 구연산 / 주사기의 6.0 ML로 5-7 X 60 ML의 주사기 각을 사용하여 한 번에 citrated 혈액 300-420 ML을 처리합니다. 이 약 3,000 마이크로에 대한 충분한 FV-결함 플라즈마입니다판 assays (아래 참조). </li><li> 자원 봉사의 팔에서 나비 바늘을 제거하고 1.0 분 동안 정맥 주사의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드를 누르십시오. 멸균 붕대로 정맥 주사의 사이트를 다룹니다. </li><li> 실온에서 20 분에 3,300 XG에서 citrated 혈액을 원심 분리기. 하단 빨간색과 흰색 혈액 세포 레이어를 방해하지 돌봐 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 저어 바있는 플라스틱 비커에 상단 노란색 플라즈마 층을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 측정 ML의 플라즈마의 볼륨과 미래 프로트롬빈 응고 시간 (PT) 테스트 (아래 참조)를 얼음에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 플라즈마의 100 μl을 유지합니다. </li><li> 천천히 5mM 달성하기 위해 실온에서 부드럽게 저어을 citrated 플라즈마에 고체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 (최종 농도). EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 해산되면, 부드러운 감동과 1.0M NaOH의 dropwise 추가하여 7.0으로 산도를 조정합니다. </li><li> 37 교반하지 않고 8-10 시간에 비닐 랩 및 배양과 비커를 커버 ° C. </li><li> 모든 2 시간은 100 μl를 복구EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 취급 얼음에 플라즈마하고 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화시 태평양 표준시를 결정하는 사​​전 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 추가 (위 참조)에 플라즈마의 태평양 표준시에 비교합니다. </li><li> 태평양 표준시의 결정에 대해, microplate 리더로 ​​플라스틱 템플릿 홀더와 인서트로 대신 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립. </li><li> 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용에 HBS의 50 μl를 (20mM HEPES, 150mM NaCl, 산도 7.4) 추가각 microplate 잘 샘플의 각 assayed되어 있어야합니다. 하나의 피펫 사용하여 microplate 우물을 분리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 한 후 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또한 전이나 다양한 배양 시간에 정상적인 인간 풀링 참조 플라즈마 (NHP) 또는 플라즈마의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용 assayed 할 플라즈마를 사용하는 모든 microplate 우물 50 μl thromboplastin을 (준비 방법은 아래를 참조)를 추가합니다. 1 분 및 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 수있는 프로그램 microplate 리더에 대해 25 ° C에서 microplate 리더에 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm에 파장, 키네틱, 온도 모드 25 ° C 및 프로그램 microplate 리더는 5 초에 흔들, 6 분 동안 매 5 초 405nm에서 흡광도를 읽어.에 독자를 설정 </li><li> 2.1mM 에서야, 멀티 채널 피펫 사용 (증류수에 25mM의 50 μl 염화칼슘을 추가난 농도)는 microplate 우물의 모든 15 초를 기다린 분석을 시작하기 위해 microplate SoftMax 프로 메뉴에서 &#39;시작&#39;아이콘을 누릅니다. </li><li> 시간이 405nm에서 흡광도의 반 최대 증가 (thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 생산 sigmoidal 흡광도 대 시간 곡선의 중간 지점. 아래를 참조를 도달하기로 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 포인트를 결정 그림 1). </li><li> 그림 2A에 아래 그림과 같이 로그 응고 시간 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)에서 FV 1 단계 활동을 계산할 수 있습니다. quantitation를 위해, FV 활동 1Unit는 사전 추가 트롬빈 (FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금 아래 참조) 의도적 활성화에 1.0 ML NHP의 활동 선물로 정의됩니다. </li><li> 부드러운 저어와 증류수에 0.15M NaCl을 포함하는 20mM HEPES의 4.0l를 준비합니다. 속도가 느린 dropw과 7.4로 pH를 조정5.0M NaOH의 이세 추가 (HBS, 산도 7.4). </li><li> 투석 튜브의 충분한 길이를 확보하고 증류수로 철저히 씻어. 튜브의 한쪽 끝에서 매듭을 묶게. 전송 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)는 플라스틱 전송 피펫으로 투석 튜브에 플라즈마를 처리, 공기를 제거하고 튜브의 다른 쪽 끝에서 매듭을 묶게. </li><li> 조심스럽게 부드러운 저어와 HBS에 튜브에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 처리 플라즈마을 설치하면 되요. 비닐 랩으로 덮어, 4 ° C.에 부드럽게 저어와 14-16h에 대한 dialyze </li><li> 주의 깊게 15.0 ML 나사 덮인 관에 3.0 ML의 aliquots에 EDTA-treated/dialyzed 플라즈마를 제거하고 얼음에서 &#39;최종&#39;FV-결함 플라즈마의 태평양 표준시 분석 100 μl을 유지합니다. -80 ° C에서 사용까지의 FV-결함 플라즈마를 저장합니다. 위에 설명 된 조건 하에서, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가 한 후 90-100 초 8-10 시간에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 10-15 초에서 포인트 증가. 이 방법으로 준비 FV-결함 플라즈마는 정기적으로 시작의 활성 FV 존재 미만 0.1 %를 포함신선한 인간의 플라즈마. </li></ol> 2. Thromboplastin의 작성 <ol><li> 투석은 응고 과정을 시작하려면 칼슘 염화물 추가의 시간에서 정확하게 타이밍 섬유소 응고 형성을 허용하기 위해이 시약의 모든 칼슘을 제거해야합니다. </li><li> 부드러운 저어와 플라스틱 비커에 증류수에 100 ML와 4.0l 20mM HEPES와 0.15M NaCl을 준비합니다. 5.0M NaOH (HBS, 산도 7.4)의 느린 dropwise 추가로 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> thromboplastin 시약의 각 유리 병에 HBS, 산도 7.4의 6.0 ML를 추가 뚜껑을 교체하고, 분해하고 부드럽게 흔들. 말린 재료를 해산하기 위해 상온에서 15 분에 덮힌 시험관에 시약을 품다. 완전히 용해에 부드럽게 흔들어. </li><li> , 투석 튜브의 충분한 길이를 잘라 증류수에 잘 헹구고, 매듭과 튜브의 한쪽 끝을 묶어. 투석 튜브에 thromboplastin을 전송, 공기를 제거하고 매듭과 튜브의 다른 쪽 끝을 묶을. </li><li> 칼슘refully HBS, 산도 7.4의 4.0l에 투석 튜브를 다짐하고 부드럽게 14-16 시간에 대해 4 ° C에서 비닐 랩으로 덮여 젓는다. </li><li> 사용 ° C까지 -80에서 15 ML 나사 덮인 튜브 및 저장소에 dialyzed thromboplastin의 3.0 ML의 aliquots를 전송합니다. </li></ol> 3. FV의 준비 1 단계 Microplate 응고 분석 활동 표준 곡선 <ol><li> 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 그리고 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 세탁기 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 부드럽게 혼합 한 후 얼음에 NHP를 저장합니다. 실온에서 별도의 세척 작업 표시 줄의 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM). </li><li> , 2 - - 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256-200 μl 0에서 NHP의 2 배 시리얼 dilutions의 각 준비, HBS의 512 배, 산도 7.4 1.5을 사용하여 ML의 microcentrifuge 튜브. 잘 와동과 얼음을 품다. </li><li> P에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입합니다microplate 리더로 ​​lastic 템플릿 홀더와 삽입합니다. </li><li> 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다. </li><li> microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)의 동시 추가를합니다. microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 NHP의 10 시리얼 dilutions의 50 μl를 추가 한 피펫을 사용합니다.</li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다. </li><li> 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘 (증류수에 25mM의 50 μl, 최종 농도 3.5mM)을 추가하는 샘플 microplate 우물까지를 시작하려면 컴퓨터에서 15 초, 보도 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 &#39;시작&#39;아이콘을 기다리 검정. </li><li> 티그는 응고 시간은 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 405nm에서 최소 및 최대 흡광도 사이의 중간 지점에 도달하는 시간 (초)의 시간으로 계산됩니다. </li><li> 응고 형성의 초기 속도는 흡광도 대 시간 곡선의 선형 부분에 응고 형성의 첫 5 번 포인트를 포함 405nm에서 흡광도 증가의 속도 (mUnits / 분)로 계산됩니다. </li><li> 응고 형성의 정도는 응고 형성 이벤트 기간 동안 달성 405nm (단위)에서 최대와 최소한의 흡광도의 차이로 계산되었다. </li></ol> 4. FV 1 단계 및 2 단계 Microplate 응고 분석과 인간 플라즈마 샘플을 시금 <ol><li> 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 샘플 플라즈마 및 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 엘리사 세척 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 얼음에 NHP 및 샘플 플라즈마를 저장부드럽게 혼합 후. 실온에서 별도의 엘리사 세척 작업 표시 줄에 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM). </li><li> 200 μl 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하여 HBS, 산도 7.4의 NHP 및 샘플 플라즈마의 40 배 dilutions을 각각 준비합니다. 잘 와동과 얼음을 품다. </li><li> 플라스틱 템플릿 홀더에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입하고 microplate 리더에 삽입합니다. </li><li> 왼쪽에서 샘플 함유 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 수있는 템플릿 홀더의 오른쪽에 다른 빈, 빈, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 빈, 그리고 빈 immunomodule 스트립. 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)을 추가합니다. singl를 사용하여전자 피펫은 40 배 희석 NHP 또는 microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 샘플 플라즈마의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다. </li><li> 모든 샘플 microplate 우물과 즉시 홍보, 다중 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘을 (6.25mM 최종 농도가 증류수에 25mM의 50 μl)을 추가분석을 시작하기 위해 컴퓨터에서 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 &#39;시작&#39;아이콘을 ESS. </li><li> 실행의 끝에서 시간, 초기 속도, 그리고 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 40 배 희석 NHP 및 샘플 플라즈마에 대한 응고 형성의 범위를 결정합니다. </li><li> 계좌로 40 배 희석을 고려, 유닛에 / FV 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동 (그림 2A)의 1 단계 활동을 표준 곡선으로부터 ML FV 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용합니다. 이 트롬빈으로 &#39;의도적&#39;인증없이 FV-1 무대 활동 또는를 나타냅니다. </li><li> FV는 활성 cofactor로 트롬빈으로 활성화되어 있기 때문에, FVa 1, 트롬빈과 더불어과 부화 후 두 번째 분석은 정확하게 플라즈마 샘플의 FV 2 단계 활동을 (추가 트롬빈에 의한 &#39;의도적&#39;활성으로)을 측정하는 것이 중요합니다. </li><li> FV 2 단계 분석의 경우, 트롬빈 18을 정화의 200-300 μl를 준비t HBS, 산도 7.4의 100nM하고 얼음에 품다. FV 2 단계 분석과 assayed 할 각 플라즈마 샘플 희석 트롬빈의 10 μl를 사용 할 계획입니다. </li><li> 2.8mM 염화칼슘을 포함하는 HBS, 산도 7.4의 170 μl 100 배 ~ 40 배에서 위의 NHP 및 샘플 플라즈마 120 μl를 희석. 각 샘플에 10 μl 트롬빈을 (10nM 최종 농도)를 추가합니다. 소용돌이 잘 1 분에 37 ° C에서 혼합 품다합니다. </li><li> 위에서 설명한대로 1 단계 microplate 분석 FV 각 플라즈마 샘플의 50 μl를 HBS, 산도 7.4 400 μl를 추가, 소용돌이 잘하고, 분석하여 500 배에 NHP 및 샘플 플라즈마를 희석. </li><li> NHP와 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 assayed 각 플라즈마 샘플의 응고 시간을 확인합니다. 계좌로 500 배 희석을 고려, FV FV에서 2 단계 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 1 단계 표준 곡선 (그림 2A). </li><li> 총 FV activiFV 1 단계 활동 - 티 그 다음 FV 2 단계 활동으로 계산 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

운동 microplate 분석 방법이 소설하지 않은 (FV 1 단계 분석) 또는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 응고 활동의 측정을위한 신속한 저렴하고 편리한 기술의 발전을 설명하는 것은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV로 활성화 된 2 단계 분석). 검정은 운동 microplate 리더를 활용하여 필요한 모든 자료와 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 집에​​서 만들어 질 수있다. 검정은 지속적으로 405nm에서 섬유소 응고 형성 동안 플라즈마의 빛 분산의 변화를 모니터링합니다. microplate 분석 작은 플라즈마 샘플 볼륨을 (μl)를 사용의 장점을 가지고 있으며 동시에 여러 샘플 (12)의 분석을위한 의무입니다. 고가의 장비와 시약은 (자동 분석기 및 팩터 - 결함 플라즈마)를 사용하는 경우이 검정 속성은 유리이다; 만 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다 (환자 플라즈마) 또는 FV 정화 F에는 샘플의 큰 번호 (분석ROM 플라즈마). FV microplate 분석은 빠르고 편리있는 추가 이점을 가지고 있으며, 필요한 구성 요소의 절연 및 정화를 필요로하지 않습니다. 수동 경사 관 3, 4,보고 된 자동 5-7 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석이 응고 시간 비교 유용한 범위 (25-75 초) 및 샘플에 해당 FV 수준 (0.5-0.005 단위가 / ML) 및 감도 / 검출 한계 (20 80pM). 응고 형성 3, 4의 주관적인 시각적 평가에서 고통을 수동 경사 관 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석은 응고 시간을 객관적이고 정량적 측정, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 할 수 있습니다. 5-7 고가의 분석기 및 시약의 요구로 고통 자동 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석의 시약 및 재료는 저렴하고 필요한 모든 자료는 purcha 수 있습니다상업적으로 SED 또는 집에​​서했다. 수동 경사 관 3, 4 및 자동화 5-7 FV의 assays는 일반적으로 만 응고 형성을위한 시간을 제공,하지 시간, 초기 속도, 그리고 정확하게 FV microplate 분석과 spectrophotometrically 측정 섬유소 응고 형성의 범위. 마지막으로, 3,4 경사 관 수동 및 자동 5-7 FV의 assays는 플라즈마 샘플을 한 번에 하나의 FV 활동을 측정 할 수없는 고통, FV microplate 분석은 높은 처리량 의무가 있으며, 12 샘플 수 있습니다 반면, 동시에 assayed. microplate 분석은 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 때문에 지연 응고 시간 및 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 낮은 초기 속도의 조합의 NHP에보다 적극적이라고 설명하는 데 사용되었습니다. DIC 환자 플라즈마의 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 요금은 NHP에서 변경되지 않았습니다. DIC patien에서 응고 형성의 범위t 플라즈마는 FV 1 단계 및 2 단계 assays의 NHP에서 변경되지 않았습니다. FV 감소 1 단계, 2 단계 및 총 활동이 획득 혈액 장애의 pathogenesis 동안 다른 연구에 따라 증가 FV 소비 19 및 / 또는 불 활성화 여섯으로 인해 발생했을 수 있습니다. DIC 플라즈마에서 응고 형성의 정도는 같은 NHP와 함께 관찰 그대로였다 감안할 때,이 변수는 대부분의 FV-결함 플라즈마에서 피브리노겐 농도의 결과 가능성과 환자 플라즈마의 특성에 관한 아니 었습니다. microplate 분석의 결과는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 활동의 측정은 FV 1 단계 분석에서 응고 형성 시간과 초기 속도와 FV 2에서 응고 형성과 총 활동 시간에서 구할 수 있습니다 표시 - 단계 분석. 그것은 t의 응고 형성의 정도에 따라 플라즈마 샘플에 FV 활동의 양적 측정을 얻기 위해 불가능했다그는 FV 1 - 및 2 단계 assays 또는 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도. 모든 반응은 약 0.35의 응고 형성의 동일한 범위에 도달 감안할 때 - 전에 초기 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위, 응고 형성의 범위 측정에 FV 활동의 양적 평가를 제공하지 않습니다 플라즈마 샘플을 제공. 소설 microplate 분석은 인간과 동물 플라즈마로부터 정화하는 동안 인간의 플라즈마와 분수의 샘플에서 FV 활동의 측정을위한 연구 및 임상 설정에서 사용을 찾을 수 있습니다. microplate 분석은 시간, 초기 속도, 그리고 응고 형성의 정도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다, 매개 변수는 일반적으로 수동 경사 관 assays 및 자동 응고 분석기로 동시에 모니터링 없습니다. 이 정보는 응고 형성 이벤트 기간 동안 FV의 참여의 전체 정량 평가의 자세한 내용을 제공합니다인간의 플라즈마에 이상이 이전에 3-7보고되었습니다. 플라즈마의 샘플에 FV 활동 또는 FV 또는 FVa을 정화로 큰 변화를 측정 할 때이 정보는 연구와 임상 실험실 모두에서 특히 중요합니다. FV microplate 분석도 특성화하고 측정 FV 및 FVa을 활성화하거나 비활성화 할 수 있습니다 화합물을 정맥 혈전증에 대한 위험에 환자의 FV 활동을 측정 FV 레이덴 돌연변이의 결과로 20, 21하고의 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 플라즈마로부터 정화 기간 동안 FV. FV microplate 분석은 해당 요소 - 결함 플라즈마를 사용하고 섬유소 형성을위한 시약을 시작 외부, 고유, 또는 일반적인 경로에서 모든 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 분석 연구 및 임상 실험실에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 최고의지적인,이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애와 고통 사람들을위한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 의견 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 운동 microplate 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td> 스펙트럼 최대 190 </td><td> SOFTmax PRO 4.3 LS 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 일반 풀링 된 인간의 기준 플라즈마 </td><td> 정밀 체액 </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trisodium 구연산 </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-부족한 인간 플라즈마 네 </td><td></td><td></td><td> 신선한 인간의 플라즈마에서 만든 -70에서 aliquots에 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 3 60ML의 주사기 </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 및 136898 </td><td></td></tr><tr><td> 나비 장치 </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 게이지 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 어부 </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastin </td><td> 트리니티 생명 공학 </td><td> T1106 </td><td> Dialyzed 대 HBS, pH를 7.4와 -70에서 aliquots에 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 트롬빈 15 </td><td></td><td></td><td> 인간의 플라즈마에서, 50 % -20 ° C (V / V) 글리세롤에 저장됩니다. </td></tr><tr><td> 투석 막 </td><td> 어부 </td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDa 분자량의 컷오프, 50mm X 3m. </td></tr><tr><td> 템플릿 홀더 및 이동식 팔 잘 스트립. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63와 469,957 </td><td></td></tr><tr><td> 엘리사 세척 트레이 </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 microfuge 15 ML 나사 덮인 관. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690과 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 채널 피펫 </td><td> 어부 </td><td> 2703630 </td><td> 8 채널 모델입니다. </td></tr></tbody></table>

microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 v 활동의 측정

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

부상에 대응하여, 혈액 응고가 활성화하고 혈액 응고 단백 분해 효소, 트롬빈​​의 생성의 결과입니다. 섬유소로 트롬빈 cleaves의 피브리노겐 이는 출혈을 중지 불용성 응고를 형성한다. 의 활성 형태, FVa에서 요소 V (FV)는 prothrombinase 1, 2의 일부로 섬유소 응고 형성시 트롬빈 생성의 단백 분해 효소 FXa과 가속을위한 중요한 cofactor이다. 수동 FV의 assays는 3, 4 설명 된 있지만 시간이 소요 및 주관적입니다. 자동 FV의 assays는 5-7보고 있지만 분석기 및 시약 비싼 일반적으로는 응고 시간,하지 섬유소 형성의 속도와 범위를 제공합니다되었습니다. microplate 플랫폼 때문에 편리 효소 촉매 이벤트를 측정하는 것이 바람직하다, 시간, 비용, 작은 볼륨, 지속적인 모니터링, 9, 8 높은 처리량. Microplate의 assays는 응고의 용해 10, 혈소판 응집에 대해보고 된11 및 응고 요인 12,하지만 인간의 플라즈마에 FV 활동에 대한. 방법의 목적은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성하는 동안 FV 활동을 측정 microplate 분석을 개발하는 것이 었습니다. 이 소설 microplate 방법은 인간의 플라즈마에 FV 활동의 간단 저렴하고 빠른 분석을 설명합니다. 검정은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성 (그림 1) 13시 405nm에서 흡광도의 변화를 모니터링하는 운동 microplate 리더를 활용합니다. 검정 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 그것은 플라즈마 만 μl 양을 필요로 6 분에 완료, 높은 처리량이, 24 80pM FV에 민감하며,의 양을 측정 실수로 활성화 (1 단계 활동)과 트롬빈 활성화 FV (2 단계 활동 1 단계 활동) -)의 총 기능 활동의 전체 평가 (2 단계 활동을 구하십시오. 전파 intravascular 응고 (DIC)가 가장 많이 기존의 감염을 14 일부터 개발 획득 coagulopathy입니다. DIC는 기존의 병리 15 위 가난한 예후 (豫后)와 증가 사망률과 연결되어 있습니다. 검정은 DIC, FV 1 단계, 2 단계 및 총 활동 9 환자 일반 풀링 된 인간에 비해 각각 54 %, 44%, 42 %의 평균에 감소 된 것을 보여주기 위해 사용되었다 참조 플라즈마 (NHP). FV microplate 분석은 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 이 분석은 연구 및 임상 설정에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애에 대한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

대표 결과 - FV의 작성 1 단계 microplate 응고 분석 활동 표준 곡선 microplate 독자에 의해 생성 시간이 지남에 따라 FV 분석의 섬유소 응고 형성의 대표 예는 그림 1에 도시된다. FV 분석은 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 분석이 완료되면 우물의 검사는 응고 형성이 발생 확인. 전에 시작 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위 - 모든 반응은 0.35의 405nm에서 흡광도의 일반적인 변화 응고 형성의 약 동일한 범위에 도달했습니다. FV 대표 예제는 1 단계 로그 응고 시간의 활동 표준 곡선 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)와 응고 형성의 초기 속도를 기록 (mUnits / 분)을 대 로그 FV 활동 (단위 / ML NHP의 일련 dilutions 용)는에 표시됩니다 <stron각각 g&gt; 그림 2A와 그림 2B. FV 대 응고 시간의 로그인 로그 음모를 맞는 1 활동 (, R 2 = 0.980 그림 2A) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. FV 활동 대 응고 형성의 초기 속도의 로그인 로그 음모를 맞는하면 (; R 2 = 0.983 그림 2B) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. NHP 512 배까지 희석을 위해 모두 로그 응고 시간의 관계와 응고 형성 대 로그 FV 활동의 초기 속도를 로그 선형 남아 있었다. FV는 12 40nM 약 16에서 NHP에서 순환하기 때문에, microplate 분석은 약 NHP의 24 80pM FV에 민감합니다. prothrombinase의 FVa - FXa - 지질의 상호 작용의 일정한 분리는 약 1nM 17 점을 감안할 때, FV microplate 분석은 생리 학적 relevan에 FV 수준의 측정을위한 완전히 적합합니다prothrombinase의 FVa 기능에 대한 t의 nm의 범위. FV microplate 분석 사용, 또한 15 건강한 통제 플라즈마의 FV 1 단계 활동 분석 (남성과 여성, 나이 18 20yrs)에 FV 활동의 정상적인 범위 (± 표준 편차 평균, 범위)이라고 결정했습니다 : 0.96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. 이 커틀러 외에 의해보고되는 일반적인 건강 FV 활동 및 범위 (0.66-1.14U/ml)과 잘 동의합니다. FV에 대해 1 단계 활동은 자동 분석기 7 결정. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 3.4 %, 4.4 %, 그리고 3.1 %였다. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일에 8 개의 다른 실험 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 7.1 %, 7.8 %, 그리고 9.2 %였다. 따라서,이 세 measu의 내부 및 남북 검정 다양성빨간색 변수 (최대 12) 내에서 동시에 여러 샘플 microplate 분석 사이의 강력한 분석 성능을위한 낮은 허용 수준이었다. 대표 결과 - FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 표준 곡선 (그림 2A)은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV 1 단계 활동)으로 활성화되지 않았거나 의도적으로 활성화 된 NHP, 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 활동을 측정하는 데 사용 된 트롬빈 (FV 2 단계 활동)을 추가하고 그 결과는 표 1에 표시됩니다. 모든 9 DIC 환자 플라즈마은 1 단계 활동과 NHP에서 각각 54 %와 18 %, 평균 감소 된 응고 형성의 초기 속도 FV을 전시. DIC 환자의 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 범위는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP에서 13 %로, 평균 증가했다. <html> 트롬빈과 NHP의 활성화 FV에 대략 8 배 증가를 생성 FV 1 단계 활동 (표 1) 위의 2 단계 활동. 이 NHP의 FV는 unactivated 형태로 주로 존재 및 수동 경사 관 FV의 assays 3, 4 및 자동 FV의 assays 5-7를 사용하여 이전에보고 된 결과에 동의 함을 나타냅니다. FV 2 단계 및 전체 활동도 NHP에서 각각 44 %와 4​​2%하여 평균 DIC 환자에서 감소했다. FV DIC 환자의 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도와 extents는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP와 관찰이에서 각각 약 9%, 4 %로, 평균 다양. 이러한 결과는 장기간 시간에 결과와 섬유소 응고 형성의 속도를 감소 DIC 환자 플라즈마의 NHP, FV에있는 FV과 비교하여 환자 FV는 평균 만 56%뿐만 아니라 트롬빈과 activatable로라고 지적했다. 다닐 &quot;강한 : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 운동 microplate FV 1 단계 응고 분석과 측정 정상적인 풀링 된 인간의 참조 플라즈마에서 응고 형성. NHP의 섬유소 응고 형성은 지속적으로 운동 microplate 리더를 사용하여 405nm에서 모니터링되었다. 줄거리는 32 배 희석 NHP, FV-결함 플라즈마, thromboplastin, 잘 microplate에 염화칼슘의 6 분 반응의 microplate 리더 출력됩니다. 수직 축은 플라즈마의 섬유소 형성의 결과로 발생 405nm에서 흡광도의 변화를 나타냅니다. 섬유소 형성의 시간은 흡광도의 반 최대 증가 또는 곡선 (36.40 초)의 중간 지점에 도달하는 시간으로 정의되었다. 응고 형성의 초기 속도는 커브 (611.88 mUnits / 분)의 흡광도 부분의 선형 증가의 첫 번째 5 번 지점으로 405nm에서 흡광도의 변화의 속도로 정의되었다. 예응고 형성의 텐트는 405 nm의 (0.35 단위)에서 최대 및 최소 흡광도의 차이로 정의되었다. <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 시간과 FV 1 단계 microplate 분석을 사용하여 일반 풀링 된 인간의 참조 플라즈마의 응고 형성 대 팩터 V 활동의 초기 속도의 표준 곡선. NHP는 순차적으로 희석 (0 - 512 배에 HBS)을했고 프로토콜에 설명 된대로 FV 1 단계 microplate 분석과 assayed. 시간과 FV의 응고 형성 대 FV 활동 1 단계 microplate 분석의 초기 속도의 로그인 로그 줄거리는 패널의 데이터와 B, 각각의 선형 회귀 모델링 한 후 표시됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> 1 단계 분석 활동 (단위 / ML) </td><td> 1 단계 검정 범위 (단위) </td><tD&gt; 1 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분) </td><td> 2 단계 분석 활동 (단위 / ML) </td><td> 2 단계 검정 범위 (단위) </td><td> 2 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분) </td><td> 총 활동 (단위 / ML) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> 환자 1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> 환자 2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; 환자 3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> 환자 네 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 환자 5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> 환자 6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 환자 7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> 환자 8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> 환자 9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> NHP와 혈관 응고 (DIC)를 분해 해 버렸 개발 아홉 환자의 표 1 FV 활동. FV 1 단계, 2 단계, 그리고 NHP 9 DIC 환자 플라즈마의 총 활동은 microplate 분석 표준 FV-1 단계에서 결정 FV 활동 (그림 2A) 대 응고 형성 시간 곡선과는 단위 / ML에 부여됩니다. 초기 속도 (mUnits / 분의 처음 다섯 시간 포인트 이상 A405nm 증가의 초기 속도)와 extents (최대 A405nm - 최소 A40FV 1 응고 형성 5nm) - 및 2 단계 microplate 분석도 표시됩니다.

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

손상에 반응하여 혈액 응고가 활성화되며, 그 결과 응고 프로테아제인 트롬빈이 생성됩니다. 트롬빈은 피브리노겐을 분해하여 피브린을 형성합니다...

다음 절차의 전반적인 목표는 인간 혈장 내 피브린 응고물 형성 과정 중 응고 단백질 인자 V의 활성을 측정하는 마이크로플레이트 분석법을 개발하는 것이었습니다. 손상이 발생하면 혈액 응고 과정이 활성화되어 일련의 자이모젠(Xymogen)에서 프로테아제(protease)로의 전환 반응이 일어나며, 이는 최종적으로 응고 효소인 트롬빈의 생성으로 이어집니다. 트롬빈은 수용성 피브리노겐을 피브린 단량체로 절단하며, 이후 이들이 결합하여 불용성 피브린 응고물을 형성합니다. 정상적인 건강 상태나 손상이 없는 상태에서 혈액은 자유롭게 흐르는 액체 상태를 유지하며, 이때 형성되는 피브린의 양은 분해되거나 파괴되는 피브린의 양과 동일합니다.하지만 특정 질환 상태에서는 혈액 응고가 과도하면 심장 질환과 뇌졸중으로 이어지며, 반대로 응고가 너무 적으면 혈우병에서 흔히 볼 수 있듯이 출혈 경향으로 이어집니다. Factor V는 혈장 내 단백질로, 활성화된 형태인 factor five A는 프로트롬빈 효소 복합체의 일부로서 피브린 응고 형성 중 트롬빈 생성을 가속화하는 핵심적인 역할을 합니다. 프로트롬빈 복합체는 프로테아제인 factor 10 A, 보조 인자인 factor five A, 표면 지질 및 칼슘의 네 가지 성분으로 구성됩니다. membrane factor five A는 기질인 프로트롬빈에 대한 factor 10 A의 촉매 효율 또는 kcat을 약 3000배 증가시켜, 트롬빈 생성과 피브린 응고 형성을 획기적으로 강화합니다.마이크로플레이트 플랫폼은 편의성, 시간 비용, 적은 시료 양, 연속 모니터링 및 높은 처리량 덕분에 효소 촉매 반응을 측정하는 데 선호됩니다. 피브린 응고 형성 과정은 마이크로플레이트 리더를 통해 혈장의 빛 흡광도 증가를 측정함으로써 모니터링할 수 있습니다. 이때 혈장은 피브린 응고가 없는 투명한 노란색 상태(최소 흡광도)에서 피브린 응고가 형성된 불투명하고 탁한 상태(최대 흡광도)로 변화합니다. 수동 틸트 튜브 분석법이나 자동 분석기를 이용한 분석법과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 분석 속도가 빠르고 비용이 저렴하며, 시료 요구량이 적고 처리량이 높다는 점입니다.본 분석법은 의도치 않게 활성화된 응고인자 V(factor five)와 트롬빈에 의해 활성화된 응고인자 V의 활성을 측정하여 전체적인 기능적 활성에 대한 완전한 정량적 평가를 수행합니다. 이 기술의 시연은 연구실의 석사 과정생인 Derek Tilley가 맡았습니다. 혈장 샘플 내 응고인자 V 활성을 측정하기 위해서는, 정의상 mL당 1단위의 응고인자 V 활성을 포함하는 표준물질인 정상 인간 혈장(NHP)을 사용하여, 패널 A의 피브린 응고 형성 시간과 패널 B의 피브린 응고 형성 초기 속도에 대한 응고인자 V 1단계 활성 표준 곡선을 작성해야 합니다. 응고인자 V 결핍 혈장, 정상 인간 혈장, 미지 샘플 혈장 및 트롬보플라스틴을 37°C에서 10분 동안 해동하십시오.제5인자 결핍 혈장과 트롬보플라스틴을 부드럽게 혼합하여 각각 별도의 플라스틱 세척 트레이로 옮긴 후 얼음 위에서 배양합니다. 정상 인간 혈장과 미지의 샘플 혈장은 부드럽게 혼합한 후 얼음 위에 보관합니다. 제5인자 1단계 활성 표준 곡선 작성을 위한 25 millimolar 증류수 내 염화칼슘은 별도의 세척 트레이에 담아 실온에 보관합니다.1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4 내에서 정상 인간 혈장을 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512배로 2배 연속 희석하여 각각 200 microliters씩 준비하고, 충분히 볼텍싱한 후 얼음 위에서 배양합니다. 정체불명의 혈장 샘플의 경우, 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4 내에서 정상 인간 혈장과 미지 샘플 혈장을 각각 40배 희석하여 200 microliters씩 준비합니다. 마이크로플레이트 리더의 템플릿 홀더에 5개의 마이크로웰 스트립을 넣습니다.마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 Softmax Pro 마이크로플레이트 애플리케이션 소프트웨어에 접속합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 모든 샘플 마이크로플레이트 웰에 factor five 결핍 혈장 50 µL를 동시에 첨가합니다. 단일 피펫을 사용하여 준비된 정상 인간 혈장의 10단계 연속 희석액, 정상 인간 혈장의 40배 희석액 및 미지 샘플 혈장을 각각 별도의 마이크로플레이트 웰에 50 µL씩 첨가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 모든 샘플 웰에 thrombo plasty 50 µL를 첨가합니다. 마이크로플레이트 리더 내에서 25 °C로 1분간 배양하며, 배양 시간 1분 중 15~25초 동안 흔들어 줍니다.MICROPLATE 리더기와 연결된 컴퓨터를 사용하여 Softmax Pro Microplate 애플리케이션 소프트웨어에 접속합니다. Microplate 리더기의 흡광 파장을 405 nanometers 모드로, 반응 온도를 25 degrees Celsius로 설정하고, calcium chloride 첨가 후 처음 5 seconds 동안 흔들림(shake) 설정을 한 뒤 6 minutes 동안 5 seconds마다 405 nanometers에서 흡광도를 측정하도록 프로그래밍합니다. 이후 계산되는 응고 시간(clot times)에는 5 second의 흔들림 간격이 포함되지 않습니다. 두 개의 멀티 채널 피펫을 동시에 사용하여 시료가 들어 있는 두 개의 마이크로플레이트 스트립에 calcium chloride 50 microliters를 첨가합니다.15초 동안 대기한 후, 컴퓨터의 Softmax Pro에서 즉시 시작 아이콘을 눌러 분석을 시작합니다. 분석된 각 혈장 샘플에 대해 혈전 형성 시간을 결정하며, 이는 흡광도가 최대 증가량의 절반에 도달하는 데 걸리는 시간(초)으로 정의합니다. 혈전 형성의 초기 속도는 시간 대비 흡광도 증가 곡선의 선형 구간 중 처음 다섯 개의 시점 동안의 흡광도 증가율로 정의합니다.혈전 형성 정도는 측정 종료 시 혈전 형성 과정 동안 도달한 최대 흡광도와 최소 흡광도의 차이로 정의합니다. Softmax Pro의 시간 대비 흡광도 프로필을 사용하여 정상 인간 혈장 희석 시리즈의 혈전 형성 시간, 초기 속도 및 정도를 결정하십시오. factor V 1단계 활성 표준 곡선을 작성하려면, 40배 희석한 정상 인간 혈장과 미지의 샘플 혈장의 혈전 형성 시간을 사용하여 factor V 1단계 활성 표준 곡선으로부터 mL당 단위로 factor V 활성도를 보간하십시오.이는 트롬빈에 의한 의도적인 활성화가 없는 응고인자 V의 1단계 활성도를 나타냅니다. 이는 마이크로플레이트 리더를 통해 생성된 응고인자 V 분석 과정에서의 시간에 따른 피브린 응고 형성의 대표적인 예시입니다. 이 프로필은 단일 마이크로플레이트 내에서 32배 희석된 정상 인간 혈장을 사용한 피브린 응고 형성을 나타냅니다.세로축은 피브린 응고물 형성의 결과로 발생한 405 nanometers에서의 흡광도 변화를 나타냅니다. 응고 형성 시간은 흡광도 대 시간 곡선의 중간 지점인 36.4 seconds로 계산되었습니다. 응고 형성의 초기 속도는 611.88 milli units per minute로 계산되었습니다.구름 형성 정도는 0.35 단위로 계산되었습니다. factor five 분석법은 초기 속도와 구름 형성 정도를 정확하게 측정합니다. 분석 완료 후 웰을 확인한 결과, 응고 형성이 일어났음을 확인하였습니다.모든 반응은 거의 동일한 수준의 혈전 형성(CloudFormation)에 도달하였으며, thromboplasty와 염화칼슘 처리 전의 초기 흡광도와 처리 후의 최대 흡광도 사이의 405 nanometers에서의 일반적인 흡광도 변화는 0.35에서 0.45 units 사이였습니다. 정상 인간 혈장에 대한 factor five 1단계 활성의 대표적인 예시, units per mil 단위의 factor five 활성 대비 초 단위의 응고 시간 표준 곡선, 그리고 units per mil 단위의 factor five 활성 대비 milli units per minute 단위의 초기 혈전 형성 속도가 각각 패널 A와 패널 B에 제시되어 있습니다.제5인자는 일반적으로 트롬빈에 의해 활성화됩니다. 활성화된 보조인자인 제5인자 A를 측정하기 위해, 트롬빈 첨가 및 배양 후 두 번째 분석을 수행하는 것은 혈장 시료의 제5인자 2단계 활성도를 정확하게 측정하는 데 매우 중요하며, 제5인자 2단계 분석을 위해 첨가된 트롬빈으로 의도적인 활성화를 유도합니다. HBS pH 7.4에서 최종 농도가 100 nM인 정제된 트롬빈 200~300 µL를 준비하여 얼음 위에서 배양하십시오. 위에서 준비한 정상인 혈장 및 시료 혈장 120 µL를 2.8 mM이 포함된 HBS pH 7.4 170 µL로 40배에서 100배까지 희석하십시오.염화 칼슘. 각 샘플에 thrombin 10 µL를 추가하여 최종 농도가 10 nM이 되도록 합니다. Vortex를 사용하여 잘 혼합한 후 37 °C에서 1분 동안 배양합니다. 정상 인간 혈장과 샘플 혈장에 HBS pH 7.4 400 µL를 추가하여 500배로 희석합니다.SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로파일을 사용하여 각 샘플 혈장 미지 시료 분석에서 정상 인간 혈장의 응고 시간을 결정하십시오. 500배 희석을 고려하여, 각 샘플의 응고 시간을 응고 시간 대 활성의 factor five 1단계 표준 곡선에 대입해 factor five 2단계 활성을 계산하십시오. 이는 factor five 2단계 활성 또는 thrombin에 의해 의도적으로 활성화된 상태의 활성을 나타냅니다.총 factor five 활성은 factor five 2단계 활성에서 factor five 1단계 활성을 빼서 계산할 수 있습니다. 혈전 형성 시간의 로그 값 대비 log factor five 활성의 표준 곡선을 사용하여 정상 인간 혈장과 파급성 혈관 내 응고(disseminated intravascular coagulation 또는 DIC) 환자 9명의 혈장에서 factor five 활성을 측정하였습니다. 9명의 DIC 환자 모두 factor five 1단계 활성과 초기 혈전 형성 속도가 평균적으로 각각 54%와 18% 감소한 것으로 나타났습니다. DIC 환자의 factor five 2단계 및 총 활성은 정상 인간 혈장과 비교하여 평균적으로 각각 44%와 42% 감소하였습니다.제5인자와 DIC 환자의 경우, 섬유소 응고 형성 시간이 연장되고 형성 속도가 감소하는 결과가 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 본 방법을 연구실에 어떻게 적용할 수 있을지에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 방법은 혈장 내 모든 응고 인자의 활성을 측정하도록 쉽게 조정될 수 있어, 광범위한 연구 및 임상 응용 분야에 적합합니다.궁극적으로, 이러한 factor V에 관한 정보는 DIC와 같은 혈전성 또는 출혈성 질환의 조기 진단 및 치료를 통해 의료 환경에 긍정적인 영향을 미칠 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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