개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로어레이 기반 전사체 분석을 위해 단일 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 주변 조직에서 망막을 절개한 다음 단일 세포로 해리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 단일 세포를 수확하여 용해 완충액이 들어 있는 PCR 튜브에 증착하는 것입니다.

그런 다음 세포를 용해시키고 역전사를 사용하여 CDNA를 증폭한 다음 중합효소 연쇄 반응을 수행합니다. 궁극적으로, A iMatrix 마이크로어레이에서 단일 세포 CD NA의 혼성화는 단일 세포에서 발현된 mRNA를 밝히는 데 사용됩니다. 전체 조직 접근법을 사용하는 것과 비교하여 단일 세포에서 유전자 발현을 프로파일링하는 것의 주요 이점은 단일 세포 분리를 통해 전체 조직을 구성하는 매우 작은 세포 집단에 접근할 수 있다는 것입니다.

이 세포는 다양한 유형의 뉴런에서 작은 줄기 세포 집단에 이르기까지 무엇이든 될 수 있습니다. 단일 세포 기술을 통해 이러한 세포에 대해 수행할 수 있는 것은 두 가지 세포 유형, 이러한 작은 세포 집단에 대한 특정 마커를 모두 식별하고 이러한 극히 드문 세포 하위 집합에서 발현되는 유전자 네트워크를 식별하는 것입니다. 또한 단일 세포 프로파일링 기술을 사용하면 매우 작은 세포 하위 집합에서 매우 역동적인 발달 전이 중에 일시적으로 발현되는 유전자 네트워크를 식별할 수 있습니다.

이 방법은 전구 세포가 분화와 관련된 유전자 네트워크를 발현하기 시작하는 시기와 같은 발달 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 녹내장과 같은 신경 퇴행성 질환에 대한 세포 치료로 확장되는데, 이는 개별 세포 발달의 주요 네트워크를 설명함으로써 세포 대체 요법에 사용할 세포를 생성할 수 있는 데 한 걸음 더 가까워졌기 때문입니다. PBS로 채워진 접시에 마우스 망막을 넣어 이 절차를 시작합니다.

다음으로 유리체와 수정체를 제거합니다. 그런 다음 망막 색소 상피를 모두 제거합니다. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 37°C의 망막을 넣고 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 튜브를 부드럽게 두드려 침전된 세포를 제거합니다. 그런 다음 P 1000 피펫터로 10-20회 부드럽게 트라이 등급을 지정합니다. 큰 조직 덩어리가 지속되면 섭씨 37도에서 10분 더 배양한 후 10-20회 냉장 보관합니다.

다음으로, 마이크로리터당 10단위의 DNA 5마이크로리터를 망막에 추가하고 5분 동안 배양합니다. 실온에서 P 1000 피펫터로 다시 부드럽게 평가한 후 10-20회 더 평가합니다. 3000RPM에서 3분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 바닥에 100-200 마이크로 리터의 액체를 남겨 둡니다. 튜브를 두드려 펠릿을 제거합니다. 다음으로, HBSS 1ml를 넣고 펠릿을 부드러운 양이온으로 재현탁합니다.

3000RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 완료되면 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 다음 단계에서 0.1% BSA를 함유한 PBS 450마이크로리터에 현탁시키고 0.1%BSA가 보충된 PBS 5밀리리터를 함유하는 6cm 접시 2개를 준비합니다.

다음 플레이트, 해리된 세포를 한 접시에 담습니다. 세포가 최소 5분 동안 안정되도록 합니다. 그 후, 해리된 세포의 접시를 도립 현미경 아래에 놓습니다.

흡입기 튜브가 있는 끝이 가는 피펫을 사용하여 단일 세포를 채취합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 세포 가까이에 놓으면 모세관 작용을 통해 마이크로 피펫에 쉽게 들어갈 수 있습니다. 그런 다음 세포를 두 번째 접시로 배출하고 유전자 발현 프로파일링을 위해 하나의 세포만 수확하도록 합니다.

이는 외부 세포를 제거하거나 새로운 마이크로 피펫을 사용하여 관심 세포를 다른 위치로 이동시켜 수행됩니다. 개별 세포가 인접 세포에서 완전히 분리되면 새로운 마이크로 피펫을 사용하여 관심 세포를 흡인합니다. 다음으로, 4.5마이크로리터 세포 용해 완충액이 포함된 0.2밀리리터 PCR 튜브로 직접 배출합니다.

마이크로 원심분리기에서 샘플을 잠시 회전시켜 세포를 용해 완충액에 담그십시오. 다섯 번째 셀마다 이 회전을 수행한 다음 수집이 끝날 때 다시 회전합니다. 단일 세포 분리 기간 동안 튜브를 얼음 위에 보관하고 해리 후 2시간 이내에 단일 세포를 수집하여 이 절차에서 최적의 결과를 얻으려면 마이크로 원심분리기에서 샘플을 잠시 회전시켜 단일 세포가 세포 용해 완충액에 담겼는지 확인하십시오.

세포 용해를 촉진하려면 thermocycler에서 섭씨 70도에서 90초 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 즉시 튜브를 얼음 위에 다시 2분 동안 놓습니다. 역전사를 수행하려면 0.33마이크로리터를 추가합니다.

마이크로리터당 200단위의 위 첨자 3개, 마이크로리터당 40단위의 억제제 0.05마이크로리터 및 0.07마이크로리터. T 4 유전자 32 단백질을 튜브에 연결합니다. 반응 혼합물을 50분 후 열순환기에서 섭씨 50도에서 50분 동안 배양하고 또 다른 15분 동안 섭씨 70도에서 효소를 비활성화합니다.

이 작업이 완료되면 튜브를 다시 얼음 위에 올려 놓습니다. 유리 프라이머를 제거하려면 0.1 마이크로 리터, 10 x 엑소뉴클레아제 완충액, 0.8 마이크로 리터, D, H2O 및 0.1 마이크로 리터를 추가하십시오. 엑소뉴클레아제, thermocycler에서 30분 동안 섭씨 37도에서 배양된 튜브에 마이크로리터당 20개 단위.

30분 후, 반응 혼합물을 섭씨 80도에서 25분 동안 배양하여 효소를 비활성화합니다. 마지막에 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 다음으로, 6마이크로리터의 테일링 반응 혼합물을 샘플에 추가합니다.

37°C에서 20분 동안 thermocycler에 넣고 10분 동안 70°C에서 배양한 다음 섭씨 4°C로 유지합니다. 그 후, 10마이크로리터의 꼬리 샘플을 PCR 반응 혼합물에 첨가합니다. 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭을 수행하여 CDNA를 라벨링합니다.

iMatrix 마이크로어레이에서 강력한 혼성화를 얻기 위해 먼저 단일 셀 CD NA의 10-20마이크로리터를 모든 버퍼에 대해 1x1인 8마이크로리터에 추가하여 CD NA를 단편화합니다. 그런 다음 이 희석된 DNA 1마이크로리터를 80마이크로리터 반응 용액에 추가합니다. 다음으로, 20마이크로리터, XTDT 완충액 5개, 비오틴 2.5마이크로리터, D-D-A-T-P 6개 및 1마이크로리터 희석 TDT를 추가합니다.

다음으로, 20마이크로리터, XTDT 완충액 5개, 2.5마이크로리터, 비오틴, D-D-A-T-P 6개 및 1마이크로리터 TDT를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 65도에서 5분.

그 후, 영하 20도에서 보관하거나 iMatrix 마이크로어레이에 즉시 하이브리드화합니다. 다음은 단일 세포 CD NA 도말 및 유전자 특이적 PCR 레인 A-F-G-N-H의 대표적인 예이며, 레인 B, C, D, E는 상당히 덜 견고합니다. 형광 망막 신경절 세포에서 CDNA를 분리한 후, 망막 신경절 세포 마커에 특이적인 PCR 프라이머, 광수용체 마커에 대한 유전자 특이적 PCR인 BRN 3 B 및 PAC 6을 사용하여 테스트했습니다.

CRX는 단일 세포의 오염 수준을 결정하는 데 사용되었습니다. 망막 신경절 세포의 CDNA와 부분 집합은 tachy kinin one 유전자의 존재 여부를 스크리닝하여 확인되었습니다. 22개의 별개의 단일 세포에서 발현된 선택된 유전자에 대한 마이크로어레이 결과는 히트 맵 형식으로 표시됩니다.

마이크로어레이 신호의 강도는 빨간색의 강도에 따라 조정되었으며 검은색은 마이크로어레이에 신호가 없음을 나타냅니다. 이 절차에 따라 QPCR과 같은 추가 방법을 사용하여 마이크로레이에서 볼 수 있는 유전자 발현 패턴을 확인할 수 있습니다. C hybridization의 결과는 특정 유전자를 발현하는 세포의 위치에 대해 가질 수 있는 추가 질문에 답하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 망막을 해리하고, 단일 세포를 분리하고, 단일 세포에서 CDNA를 생성하는 방법에 대해 꽤 잘 알게 될 것입니다. 마이크로어레이의 혼성화용.