개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

본 실험 절차의 전반적인 목적은 마이크로어레이 기반 전사체 분석을 위해 단일 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 주변 조직으로부터 망막을 절제한 다음, 이를 단일 세포로 해리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 단일 세포를 수집하여 용해 버퍼(lysis buffer)가 들어 있는 PCR 튜브에 분주하는 것입니다.

그런 다음 세포를 용해하고 역전사를 이용해 cDNA를 증폭시킨 후, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행합니다. 최종적으로, AiMatrix 마이크로어레이에서 단일 세포 cDNA를 하이브리드화하여 단일 세포에서 발현된 mRNA를 확인합니다. 전체 조직 접근 방식과 비교하여 단일 세포의 유전자 발현을 프로파일링할 때 얻는 주요 이점은, 단일 세포 분리를 통해 전체 조직을 구성하는 매우 적은 수의 세포 집단에 접근할 수 있다는 점입니다.

이 세포들은 다양한 유형의 뉴런부터 극소수의 줄기세포 군집에 이르기까지 무엇이든 될 수 있습니다. 단일 세포 기술을 통해 이러한 세포들에 대해 수행할 수 있는 것은 세포 유형과 이러한 소수 세포 군집의 특정 마커를 식별하고, 매우 희귀한 세포 하위 집합에서 발현되는 유전자 네트워크를 식별하는 것입니다. 또한, 단일 세포 프로파일링 기술을 이용하면 매우 작은 세포 하위 집합에서 매우 역동적인 발달 전이 과정 동안 일시적으로 발현되는 유전자 네트워크를 식별할 수 있습니다.

이 방법은 전구세포가 언제 분화와 관련된 유전자 네트워크를 발현하기 시작하는지, 그리고 이러한 전구세포들이 서로 어떻게 다른지와 같이 발달 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 개별 세포 발달의 핵심 네트워크를 규명함으로써 세포 대체 요법에 사용할 수 있는 해당 세포들을 생성하는 단계에 한 걸음 더 다가갈 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 녹내장과 같은 신경퇴행성 질환의 세포 치료로까지 확장됩니다. PBS가 채워진 접시에 마우스 망막을 배치하여 이 절차를 시작하십시오.

다음으로, 유리체와 수정체를 제거합니다. 그런 다음 망막 색소 상피를 모두 제거합니다. 망막을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.

그 후, 튜브를 가볍게 두드려 가라앉은 세포들을 떼어냅니다. 그런 다음 P 1000 피펫으로 10~20회 정도 부드럽게 트리튜레이션(trituration)합니다. 조직 덩어리가 여전히 크게 남아 있다면, 37 °C에서 10분 더 배양한 후 다시 10~20회 트리튜레이션합니다.

다음으로, 10 units/µL 농도의 DNA 5 µL를 망막에 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 실온에서 P 1000 피펫을 사용하여 이후 10~20회 정도 다시 부드럽게 혼합합니다. 3000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다.

그 다음 상층액을 제거하고 바닥에 100 to 200 µL의 액체를 남깁니다. 튜브를 가볍게 두드려 펠렛을 분리합니다. 이어서 1 mL의 HBSS를 첨가하고 부드럽게 회전시켜 펠렛을 재부유시킵니다.

3000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 완료되면 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그다음 0.1%BSA가 포함된 450 µL의 PBS에 다시 현탁합니다. 다음 단계에서는 0.1%BSA가 첨가된 5 mL의 PBS가 들어 있는 6 cm 디쉬 2개를 준비합니다.

다음으로, 분리된 세포를 하나의 디쉬에 플레이팅합니다. 세포가 가라앉을 때까지 최소 5분 동안 기다립니다. 그 후, 분리된 세포가 담긴 디쉬를 도립 현미경 아래에 놓습니다.

흡입 튜브가 달린 미세 팁 피펫을 사용하여 단일 세포를 수집합니다. 그다지 미세 피펫을 세포 가까이에 위치시키면 모세관 현상에 의해 세포가 미세 피펫 내부로 쉽게 들어옵니다. 이후 세포를 두 번째 디쉬에 배출하며, 유전자 발현 프로파일링을 위해 단 하나의 세포만 수집되었는지 확인합니다.

이는 불필요한 세포를 제거하거나 새로운 마이크로 피펫을 사용하여 관심 세포를 다른 위치로 이동시켜 수행합니다. 개별 세포가 주변 세포로부터 완전히 분리되면, 새로운 마이크로 피펫을 사용하여 관심 세포를 흡입합니다. 그다음, 4.5 µL의 세포 용해 버퍼가 들어 있는 0.2 mL PCR 튜브에 세포를 직접 분사합니다.

세포가 용해 버퍼에 완전히 잠기도록 마이크로 원심분리기로 샘플을 짧게 원심분리합니다. 매 5번째 세포마다, 그리고 수집이 완료된 후 마지막에 이 원심분리 과정을 수행하십시오. 단일 세포 분리 과정 전반에 걸쳐 튜브를 얼음 위에 유지해야 하며, 본 실험 절차에서 최적의 결과를 얻으려면 해리 후 2시간 이내에 단일 세포를 수집하십시오. 단일 세포가 세포 용해 버퍼에 완전히 잠겼는지 확인하기 위해 샘플을 마이크로 원심분리기로 짧게 원심분리합니다.

세포 용해를 촉진하기 위해, 서모사이클러에서 샘플을 70 °C로 90초 동안 배양합니다. 그 후 즉시 튜브를 얼음 위에 2분 동안 놓아둡니다. 역전사를 수행하려면, 0.33 µL를 첨가합니다.

200 units/µL 농도의 Superscript three 0.05 µL, 40 units/µL 농도의 억제제 0.07 µL, 그리고 T four gene 32 protein을 튜브에 넣습니다. 반응 혼합물을 서모사이클러(thermocycler)에서 50 °C로 50분 동안 인큐베이션한 후, 70 °C에서 15분 동안 추가로 처리하여 효소를 불활성화합니다.

해당 과정이 완료되면 튜브를 다시 얼음에 놓습니다. 유리 프라이머를 제거하기 위해 10 x exonuclease buffer 0.1 µL, DH2O 0.8 µL, 그리고 20 units/µL 농도의 exonuclease 0.1 µL를 튜브에 첨가한 후, 써모사이클러에서 37 °C로 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 반응 혼합물을 80 °C에서 25분 동안 배양하여 효소를 불활성화합니다. 종료 후, 튜브를 다시 얼음에 놓습니다. 다음으로, 테일링 반응 혼합물 6 µL를 샘플에 첨가합니다.

써모사이클러에서 37 °C로 20분, 70 °C로 10분 동안 배양한 후 4 °C에서 보관하십시오. 이어서, 꼬리가 달린 샘플 10 µL를 PCR 반응 혼합물에 첨가하십시오. cDNA를 표지하기 위해 2차 가닥 합성 및 PCR 증폭을 수행하십시오.

iMatrix 마이크로어레이에서 강건한 하이브리다이제이션을 얻기 위해, 먼저 단일 세포 CD NA 10~20 µL에 1x T4 buffer 8 µL를 첨가하여 CD NA를 단편화합니다. 그런 다음, 이렇게 희석된 DNA 1 µL를 80 µL 반응 용액에 첨가합니다. 이어서 5x TDT buffer 20 µL, biotin-dUTP 2.5 µL, ddATP 6 µL 및 희석된 TDT 1 µL를 첨가합니다.

다음으로, 20 µL의 5X TDT buffer, 2.5 µL의 biotin, 6 µL의 ddATP 및 1 µL의 TDT를 추가합니다. 혼합물을 37 °C에서 90분간 배양한 후, 65 °C에서 5분간 배양합니다.

그 후 -20 °C에서 보관하거나 즉시 a iMatrix 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 다음은 단일 세포 cDNA 스미어 및 유전자 특이적 PCR의 대표적인 예시입니다. 레인 A-F-G-N-H는 강력한 cDNA 스미어를 포함하고 있는 반면, 레인 B, C, D, E는 훨씬 덜 강력합니다. cDNA는 형광 망막 신경절 세포에서 분리되었으며, 이후 망막 신경절 세포 마커인 BRN3B 및 PAC6에 특이적인 PCR 프라이머와 광수용체 마커에 대한 유전자 특이적 PCR을 사용하여 테스트되었습니다.

단일 세포 내의 오염 수준을 결정하기 위해 CRX를 사용하였습니다. tachy kinin one 유전자의 존재 여부를 스크리닝하여 cDNA와 망막 신경절 세포의 하위 집합을 식별하였습니다. 22개의 서로 다른 단일 세포에서 발현된 선택된 유전자들의 마이크로어레이 결과가 히트맵 형식으로 표시되어 있습니다.

마이크로어레이 신호의 강도는 빨간색의 강도에 대응하도록 스케일링되었으며, 검은색은 마이크로어레이 상에 신호가 없음을 나타냅니다. 이 절차 이후에 QPCR과 같은 추가적인 방법을 사용하여 마이크로어레이에서 관찰된 유전자 발현 패턴을 확인할 수 있습니다. C 하이브리다이제이션 결과는 특정 유전자를 발현하는 세포의 위치에 대해 가질 수 있는 추가적인 질문에 답하는 데에도 활용될 수 있습니다.

본 영상을 시청하신 후에는 망막을 해리하고, 단일 세포를 분리하며, 마이크로어레이 하이브리드화를 위해 해당 단일 세포로부터 cDNA를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.